Praktikum z genetiky rostlin JS 2014 Genetická analýza a genetické markery n 1.Genetická analýza a identifikace počtu genů odolnosti k padlí u ječmene. 2.Určení DNA markerů v genetické vazbě s genem odolnosti k padlí travnímu u ječmene. Práce s balky. 3.Genetické mapování genů odolnosti k padlí travnímu u ječmene. Využití mapovacího softwaru. 4.Identifikace transgenních rostlin Arabidopsis thaliana. 5.Expresní analýza genu PPO pomocí RT-PCR Genetické markery nMarker (genetický marker) n= signální gen, signální linie n nmorfologické nbílkovinné (izoenzymy) nDNA n 1. založené na hybridizaci DNA n 2. založené na polymerázové řetězové reakci n amplifikace - specifických sekvencí n - náhodných sekvencí n n n n Především z důvodů velikosti rostlinného genomu, jsou potřeba nástroje, které umožňují jeho studium. Takovými nástroji jsou mutageneze, ale i genetické markery. Pokud hovoříme o genetických markerech v širším slova smyslu – morfologické, molekulární - bílkovinné, DNA. Význam jednotlivých skupin Morfologické – málo, spíše náhodně, využití především ve šlechtění jednoduchá detekce – podle fenotypu Molekulární – výhody – počet, pokrytí genomu, složitější detekce – elektroforeticky – agar, PAGE, kapilární, různé typy různý počet, srovnání mezi model druhy a plodinami, srovnání s genomem člověka Klasifikace podle metody, význam PCR Vlastnosti markerů 1.vysoký polomorfizmus 2.kodominantní charakter dědičnosti 3.častý výskyt v genomu 4.nezávislost na podmínkách prostředí 5.snadná dostupnost 6.snadné a rychlé testování 7.vysoká reprodukovatelnost 8.snadná výměna údajů mezi laboratořemi n Typy DNA markerů: 1. založené na hybridizaci DNA 2. založené na polymerázové řetězové reakci amplifikace - specifických sekvencí - náhodných sekvencí Klasifikace DNA markerů podle použitých sond: 1. jednokopiové a vícekopiové sondy RFLP (Restriction fragment length polymorphism CAPS 2. mnohokopiové sondy mikrosatelity, RAPD, AFLP - Izolace DNA - Restrikční analýza - Elektroforetická separace - Přenos DNA na membránu - Značení sondy - Hybridizace - Vizualizace rflp rflp-gel Schéma RFLP markerů O151F Schéma SSR markerů Schéma CAPS markerů O153F RAPD - random amplified polymorphic DNA DAF - DNA amplification fingerprinting SCAR - sequence characterised amplified regions gelblack RAPD Dom, 1 oktamer až dekamer, sekvence náhodná, nespecifická PCR, nižší teplota anenalingu 40C DAF modifikovaná RAPD, primer 5 nukleotidů, produkt separován na PAGE, barven stříbrem JECNEM98 RAPD příklady : ječmen Analyzována kolekce jarních ječmenů využívaných ve šlechtění na sladovnickou kvalitu Malé rozdíly v genetickém založení kolekce AFLP - amplified fragment length polymorphism O152 AFLP O152 AFLPband Vhodný pro hodnocení genových zdrojů vyhledávání markerů kvantitativní znaky Využití genetických markerů nZákladní výzkum i šlechtění nStudium rostlinných genomů n 1.Otisk DNA (fingerprinting) 2.Stanovení evolučních vztahů (příbuznost genotypů), taxonomie 3.Genetické mapování Charakterizovat oblasti využití následně Ad 1 – využití především mnohokopiových sekvencí Ad 2 – speciální např. taxonomie – charakterizace sekvencí genů pro rRNA (DP) 3. Genetické mapování n1. Konstrukce genetických map určitého druhu n2. Identifikace nových DNA markerů -Vytváření nástrojů pro MAS (marker-assisted selection) -Poziční klonování genů n Konstrukce genetických map hlavních plodin 1986 – 1. mapa RFLP markerů u kukuřice a rajčete pocet map Databáze projektů zabývajících se mapováním rostlinných genomů (celkem pro 66 různých druhů rostlin) http://www.nal.usda.gov/pgdic/Map_proj/ Teoretické otázky genetického mapování rostlinných genomů Podstata genetického mapování Pravděpodobnost vzniku crossing-overu mezi 2 lokusy Polymorfizmus a jeho detekce Výchozí křížení Výchozí křížení fenotypově kontrastních rostlin – předpoklad pro genetickou odlišnost, a na molekulární úrovní předpoklad polymorfismu Populace využívané k mapování F2 znak dominantní 3:1 znak kodominantní 1:2:1 B1 1:1 Aneuploidní linie – viz schéma Dihaploidní linie – homozygotní materiál Rekombinantní inbrední linie (RIL) Blízké izogenní linie (NIL) Znaky kvalitativní x znaky kvantitativní Velikost populace Počet DNA markerů pro zachycení vazby Lokalizace genů do vazbových skupin pomocí aneuploidů trizomiků 1. Mutace a je lokalizována na trizomickém chromozomu P: AAA x aa F1: AAa Aa F2: 2 A a AA 2 AAA AAa 2 Aa 4 AAa 2 Aaa 2 A 4 AA 2 Aa a 2 Aa aa Fenotypové štěpné poměry: A-- : aaa 1 : 0 A- : aa 8 : 1 2. Mutace b není lokalizována na trizomickém chromozomu P: AAA BB x AA bb F1: AAA Bb AA Bb F2: AB Ab AAB AAA BB AAA Bb AAb AAA Bb AAA bb A B AA BB AA Bb A b AA Bb AA bb Fenotypové štěpné poměry: AAA B- : AAA bb 3 : 1 AA B- : AA bb 3 : 1 Příklad: Genetické mapování mutace lycopodioformis Arabidopsis thaliana Materiál: morfologická mutace ly Populace F2 DNA markery – SSR (Simple sequence repeats ) mikrosatelity – CAPS (Cleaved amplified polymorphic sequences) Columbia lycopodioformis Schéma křížení Krizeni Vysvetlivky 1. Etapa práce 30 až 50 mutantních rostlin F2, hrubé mapování Lokalizace používaných DNA markerů v genetické mapě Arabidopsis thaliana CAPS zeleně SSR černě Postup n20 až 30 vzorků DNA ly z F2 nKontroly: rodiče, F1 n nPCR pro SSR markery nELFO n nPCR pro CAPS markery nŠtěpení enzymem nELFO Segregující populace F2 a molekulární analýza - příklady gel lc 150 bp 140 bp M C ly H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 nga249 gel280 nga1126 199 bp 191 bp M C ly H 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Výpočet podílu rekombinace r : C…rekombinovaný chromozom Výpočet střední chyby podílu rekombinace sr: n…celkový počet chromozomů Odhad mapové vzdálenosti D dle Kosambiho mapovací funkce (Kosambi, 1944): Výpočet střední chyby odhadu mapové vzdálenosti sD: Lokalizace mutantní alely ly v genetické mapě Arabidopsis mapa pro Biotechnologii2006001 černá – SSR markery zelená – CAPS markery červená – analyzované mutace 2. Zpřesnění mapové pozice (200 mutantních rostlin) vzdálenost 1 až 3 cM (200 až 600 kb, 45 až 135 genů) 3. Identifikace kandidátních genů až 2000 F2 rostlin, identifikace dvou DNA markerů v co nejbližší pozici, identifikace rekombinantů Nezbytná vysoká vysycenost genomu DNA markery SNP, In/Del Speciální problémy řešitelné mapováním u druhů s velkým genomem Podrobné mapování určité oblasti genomu Identifikace DNA markerů v těsné vazbě s genem Speciální populace pro mapování – RIL, NIL, BSA (Bulk Segregant Analysis) s cílem MAS RIL (recombinant isogenic lines) Rekombinantní inbrední linie F2 50,0% F3 75,0% F4 87,5% F5 93,8% F6 96,9% F7 98,7% F8 99,5% F1 X Křížení polymorfních (fenotypově kontrast- ních) linií Ä časová náročnost Å vysoká homozygotnost Homozygoti dom a rec, oba znaky v F8, eliminace heterozygotů – všichni informativní jedinci. Počítáme pro jednotlivé markery podíl rekombinace pro určitou fenotypovou kategorii. Rekombinovaný fragment druhého fenotypu, tedy 2. genetického pozadí NIL (near isogenic lines) Izogenní linie Ä časová náročnost – vytvoření F1 + 6 x BC, selekce na daný gen (znak) v každé generaci Å vysoká homozygotnost, rozdíl jen v lokusu konkrétního genu a jeho okolí Å polymorfismus (DNA) mezi NIL s vysokou pravděpodobností souvisí s vazbou marker-gen X B1 B2 B7 P1 Donor P2 Recipientní rodič 25% P1 12,5% P1 0,42% P1 BSA (bulk segregant analysis) Årychlá příprava kontrastních skupin genotypů z F2 generace dominance, recesivita Rezistentní Segregující Náchylné F2 BSA Rodič R Rodič S F1 R-Bulk S-Bulk RIL Rezistentní Náchylné Genetické mapování genu odolnosti u ječmene nHordeum vulgare nPadlí ječmene n n n n n nŠlechtění odolných odrůd nVýznamné zdroje genů odolnosti jsou plané ječmeny – H. vulgare ssp. spontaneum, H. bulbosum n23 zdrojů (donorů) odolnosti ječmene (H. vulgare ssp. spontaneum) k padlí ječmene (PI…..) n barley-powdery-mildew srovnání původce Blumeria graminis f. sp. hordei v ČR i celosvětově jedna ze závažných chorob ječmene padlí konidie Plant Introduction Genetické aspekty choroby Rostlina (hostitel) Patogen genom 1 genom 2 geny odolnosti R geny avirulence Avr většinou dominant alela dominantní protein 1 protein 2=elicitor Aktivace mechanismů odolnosti interaction rozpoznání Resistance mechanisms Plants have evolved a complex array of biochemical and enzymatic defence, both constitutive and inducible that is not involved in pathogen detection but whose effectiveness influences pathogenesis and disease resistance. Among the PR proteins, for example, chitinases and endoglucanases that attack and degrade the cell walls of pathogens, and with pathogens counterattack with inhibitors. Classicaly, two levels of resistance have been defined: Non-host resistance – where entire plant species or genus is resistant and therefore not a host for particular pathogen Host resistance - individuals within a species have developed genetically inherited ways of defending themselves against the organism that cause disease on other individuals within plant species. Passive=constitutive mechanisms of resistance –structural elements such as cuticle, root border cells, pre-formed antimicrobial chemical compounds within plant termed phytoanticipins. Active=induced mechanisms – hypersensitive response (local plant cell death), induction of specific gene expression within the plant, including gene involved in cell wall strengthening, repairing structural defences, genes for biosynthesis of additional antimicrobial compounds=phytoalexins, induction of genes encoding hydrolytic enzymes and, PR proteins. other defence-related proteins post-transcriptional gene silencing PTGS systemic resistance mechanisms systemic aquired resistance induced systemic resistance geny R 1.Mají schopnost detekovat (rozpoznat) patogena 2.Mají schopnost aktivovat obranné mechanismy 1. koncept gen – proti – genu Horizontal versus vertical – Horizontal – numerous genes have small additive effects; resistance varies by small amounts between cultivars, on the level of species? Vertical – gene for gene resistance, on the level of genotypes, controlled by single genes, resistance is either close to complete immunity if the gene is present, or complete susceptibility if it is absent. 1940 Flor working on flax/flax rust (Melampsora lini) in the USA and Oort working independently on wheat(wheat smug (Ustilago tritici) in The Netherlands, made the major breakthrough – it was possible to discriminate between different genotypes in the pathogen population by using different resistance genes in the plant populations. It was found that virulence was generally recessive and avirulence dominant, and this led to gene for gene koncept stating that for every dominant gene determining resistance in the host, there is a matching complementary dominant avirulence gene in the pathogen. Such gene have been identified in plants that confer resistance against bacteria, fungi, viruses, oomycetes, nematodes and insects, and a simple model to explain this concept is the elicitor/receptor model. In this, recognition of the elicitor derived from the functional avirulence gene in the pathogen by the product of the R gene in the plant activates a signal transduction pathway leasing to the hypersensitive response and resistance. It should also be noted that some R genes are only semi-dominant – Mla, allowing a greater degree of fungal ingress in the heterozygout state, and other R genes are influenced in their effectiveness by environmental conditions (e.g. temperature), and also by the age of the plant. Cíle studia donorů rezistence 1.Zjistit charakter dědičnosti genů v nových zdrojů odolnosti ječmene k padlí ječmene 2. Lokalizovat zjištěné geny odolnosti v genomu ječmene pomocí DNA markerů 3. Vyvinout molekulární markery alespoň pro některé ze zjištěných genů odolnosti Od úrovně fenotypové – projev hodnocení choroby Genotypové - počet genů Molekulární Strategie řešení n1. Vytvoření vhodných populací pro analýzy n odrůda ´Tiffany´x zdroj odolnosti F2 n2. Fytopatologické testy – P, F1, F2 n3. Genetická analýza n Určení počtu genů determinujících odolnost n4. Získání DNA markerů pro ječmen H. vulgare n Určení polymorfismu u rodičů n5. Určení DNA markerů ve vazbě s jednotlivými geny odolnosti: n Analýza balků – náchylného a odolného Lokalizace genů na chromozomech ječmene n Mapa SSR markerů ječmene využívaných v laboratoři Barley Cons Varshney - mame Druh – ječmen Hordeum vulgare Hodnocený znak - odolnost k padlí travnímu Původce padlí travního – Blumeria graminis f. sp. hordei (houba) Populace F2 Křížení 7: náchylná (S) x odolná (R) H. vulgare cv. Tiffany x H. vulgare ssp. spontaneum PI466200 (zdroj odolnosti – planý ječmen) F1 F2 (100 rostlin) Úkoly n1. Určit počet genů determinujících odolnost k padlí travnímu v uvedeném zdroji odolnosti ječmene, statisticky ověřit n2. Určit typ dědičnosti genu/genů odolnosti n3. Určit SSR/CAPS markery ve vazbě (analýzou balků) n4. Se kterými markery jsou vázány geny odolnosti (použitím SW MapQTL5) • Rostliny rodičovské, F1 i jednotlivé rostliny F2 jsou otestovány virulentním izolátem Bgh • Stupnice hodnocení: 0, 0-1, 1, 1-2, 2, 2-3, 3, 3-4, 4 0 až 3 – rostliny odolné, 3-4 a 4 - rostliny náchylné Tiffany RT4 Zdroj odolnosti 7 RT0 F1 RT0 • F2 balky (DNA) každý 18 rostlin • F2 100 rostlin (DNA) • F2 240 rostlin (fytopatologická analýza) Úkol č. 3 Určení markerů ve vazbě s genem odolnosti k padlí travnímu u ječmene. Práce s balky. Materiál: Zdroj odolnosti 7 (PI460200) Populace F2 (Tiffany x PI460200) Krajní třídy RT0 a RT4 DNA markery – SSR (Simple sequence repeats ) CAPS (cleaved amplified polymorphis sequence) chromozom 1H chromozom 2H chromozom 3H chromozom 6H chromozom 7H Analýza bulků při dominanci odolnosti S – z náchylných rostlin F2 R – z odolných rostlin F2 S1 – testovaný SSR marker není ve vazbě s genem odolnosti S2 – testovaný SSR marker je ve vazbě s genem odolnosti cross6Bmac0134 - tr4(15+6)upr cross6Bmac0154 tr0,0-1,4upr