Izolace restrikčních endonukleáz z bakteriálních buněk •Úloha demonstrující přípravu hrubého extraktu proteinů z produkčního bakteriálního kmene –Kultivace bakteriálních buněk –Shromáždění, promytí a stanovení výnosu –Lyze buněk sonikací –Částečná purifikace hrubého lyzátu –Průkaz enzymatické aktivity Poznámky k postupu •Buňky centrifugujeme v rotoru 6× 50 ml zkumavkách; objem 500 ml je třeba centrifugovat na několikrát •Množství lyzostafinu pro lyzi buněk dávkujeme 15 µl na 1 g buněk •Během izolace nesmí teplota překročit 10 °C, při sonikaci chladíme v ledové lázni • • • Poznámky k bezpečnostním rizikům •Práce s velkým objemem potenciálně patogenního organismu •Práce s merkaptoetanolem – v digestoři •Ultracentrifugace – nutno vyvážit zkumavky na předvážkách s přesností na 0,01 g •Práce s ultrazvukem – bezpečnostní předpisy Princip stanovení aktivity izolovaných restriktáz •DNA fága 3A není štěpena restriktázou Sau3AI •DNA fága 96 není štěpena restriktázou Sau96I •Jiné fágové a bakteriální DNA jsou štěpeny oběma restriktázami •Vybíráme optimální reakční pufr Výsledky v protokolu •Stanovení výtěžku buněk •Izolovaný hrubý extrakt rozplněný do alikvotů •Gel se štěpenými fágovými DNA •Stanovení optimálního reakčního pufru Modifikace konců DNA a klonování produktu PCR •Úloha demonstrující izolaci určitého genu z neznámého genomu s využitím degenerovaných primerů nesoucích restrikční místa –Příprava vektoru pBluescript izolace plazmidu → štěpení dvojicí RE → izolace linearizovaného vektoru z gelu → elektroforéza → stanovení koncentrace DNA –Příprava inzertu PCR → štěpení dvojicí RE → purifikace → elektroforéza→ stanovení koncentrace DNA –Ligace a transformace –Skríning klonů pomocí PCR nebo lyzí varem Obecné poznámky k postupu •K dispozici budou: –Připravené kompetentní buňky –Neštěpená purifikovaná DNA vektoru •K zabránění znovuspojení konců plazmidu štěpíme dvojicí restriktáz •V průběhu experimentu zařazujeme vhodné kontroly •Práci s GMO evidujeme dle předpisů Poznámky k postupu klonování •PCR a štěpení inzertu a vektoru restriktázami –Příprava dostatečného objemu reakční směsi 4 × 25 µl –Před štěpením RE produkt nutno purifikovat –Výběr vhodného pufru společného pro obě restriktázy –Purifikaci po štěpení RE provádíme současně s naštěpeným vektorem –Nenaštěpený vektror eliminujeme izolací linearizovaného vektoru z gelu z LMT agarózy Poznámky k ligaci •Volba poměru inzertu a vektoru ng vektoru × kb velikost inzertu inzert kb velikost vektoru vektor • •V případě, že neznáme koncentraci: • • • •Používáme rychlý ligační pufr s 10% PEG • • × molární poměr = ng inzertu vektor inzert 1:3 1:1 3:1 1:5 5:1 Poznámky k transformaci •Z každé ligační směsi provádíme tři transformace (1, 3 a 5 µl ligační směsi) •Médium pro výsev: LBA obsahující 100 µg/ml ampicilinu, 40 µg/ml Xgal a 0.1 mM IPTG •Zásobní roztoky: Ampicilin 100 mg/ml, Xgal 40 mg/ml, 0,1 M IPTG •Kontroly: –Prázdný vektor = ověření frekvence transformace –Linearizovaný vektor = ověření, že nedochází k cirkularizaci bez inzertu –Bez DNA = oběření, že kompetentní buňky jsou citlivé k ampicilinu Skríning rekombinantních vektorů 1.Přeočkování kolonií ve formě dlouhých čárek na misky 2.Izolace plazmidu lyzí varem 3.Štěpení DNA dvojicí restriktáz 4.Elektroforéza 5.Ověření inzertu sekvencováním Výsledky v protokolu •Kontrolní gely s inzertem a vektorem před a po štěpení •Výsledky stanovení koncentrace inzertu a vektrou •Výpočet složení ligační směsi •Počty kolonií – modrobílý test •Gel s rekombinantními vektroy •Sekvence inzertu •Zamražení řádně označených klonů Klonování a exprese fágového lytického enzymu •Úloha demonstrující expresní klonování a funkční test připraveného enzymu –Návrh sekvence primerů pro amplifikaci genu pro účely klonování v transkripčním fúzním vektoru –Příprava vektoru pSP72 izolace plazmidu → štěpení dvojicí RE → defosforylace → izolace linearizovaného vektoru z gelu → elektroforéza → stanovení koncentrace DNA –Příprava inzertu vyštěpení dvojicí RE z pBluescript → izolace inzertu z gelu → elektroforéza→ stanovení koncentrace DNA –Ligace a transformace –Přeočkování klonů na médium pro expresi a funkční test Obecné poznámky k postupu •K dispozici budou: –Připravené kompetentní buňky DE3 –purifikovaná DNA vektoru pSP72 –Purifikovaná DNA pBluescript s inzertem (endolyzin) –Usmrcené autoklávované buňky S. aureus •K zabránění znovuspojení konců plazmidu štěpíme dvojicí restriktáz a defosforylujeme •Vektor neumožňuje provést modrobílý test •V průběhu experimentu zařazujeme vhodné kontroly, vektor i inzert izolujeme z gelu •Postup ligace – viz předchozí experiment •Selektivní médium po transformaci obsahuje pouze ampicilin Výsledky v protokolu •Kontrolní gely s inzertem a vektorem před a po štěpení •Výsledky stanovení koncentrace inzertu a vektrou •Výpočet složení ligační směsi •Srovnání počtů kolonií po ligaci: samotný pSP72, pSP72 + inzert •Gel s rekombinantními vektroy •Fotografie misky s funkčním testem •Zamražení řádně označených klonů