Luminiscenční spektroskopie excitace1 k1 k4 k5 k4 k3 A ® A* ® A* ® A+ ® A+ ® A k2 k3 k4 A hn hn hn Luminiscenční spektroskopie excitace Luminiscenční spektroskopie Fluorescenční spektroskopie Fosforescenční spektroskopie Chemiluminiscenční spektroskopie Základní pojmy Excitace a emise emise Interakce s rozpouštědlem Singletový excitovaný stav Singletový základní stav Základní pojmy Stockesův posun – ztráty energie po dobu excitovaného stavu nm Dl F Absorpce Emise Základní pojmy 2 l3 l2 l1 Biochemicky významné fluorofory fluorofory Instrumentace schémaflu Instrumentace Shimadzu RF-5301PC – spektrofluorimetr Shimadzu Podmínky fluorescence polarita1 Závislost na polaritě a viskozitě polarita Nitrobenzoxadiazol Pokles polarity 6 – 1. Podmínky fluorescence Závislost fluorescence na teplotě 20 40 °C F 80 40 Podmínky fluorescence Stabilita fluorescenčního signálu chininsulfátu 40 80 min F 80 40 Podmínky fluorescence 1 Rayleighův rozptyl (Tyndalův rozptyl) 2 Fluorescenční emise 3 Ramanův rozptyl 1 3 2 Excitace 450 nm Emisní spektrum 450 nm 600 nm 3 Kvantitativní fluorimetrie Závislost intenzity fluorescence na koncentraci látky F = f (I, e, c, F) F = Io F [1 – 10-ecd] jestliže c ® 0 F = Io F.2,3.ed.c F c Kvantitativní fluorimetrie aminy Stanovení koncentrace aminokyselin 390/464 nm 340/455 nm 450/550 nm Kvantitativní fluorimetrie CBCQA-protein Stanovení bílkovin CBCQA CBCQA Kvantitativní fluorimetrie Detekce bílkovin v gelu (barevně: Coomasie blue, stříbrné barvení) Fluorimetricky: SYPRO Orange (Molecular probes) – citlivost 1 – 2 ng Kvantitativní fluorimetrie ethidium Detekce nukleových kyselin Ethidium bromid detekceDNA rRNA 16 a 23s barvená SYBR Green II Molecular Probes Fluorogenní substráty galaktosidasy galatosidasy1 Galaktosidasy 4-methylumbelliferyl-a-galaktosid Fluorescein-digalaktosid Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí Přirozené fluorofory (Tyr, Try) – fluorescence závislá na polaritě prostředí obklopující fluorofor H2O H2O F nm Emisní spektrum Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí t (min) F310 substrát > Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí Interakce makromolekul s ligandy polarita F koncentrace makromolekuly Ligand volný Ligand vázaný L + M « LM Kd = Lf.Mf/LM Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí F = Ff + Fb F = Cf .Ff + Cb. Fb F = (C-Cb) Ff + Cb. Fb F = CFf – CbFf + Cb. Fb F = Fo + Cb (Fb – Ff) Cb = (F – Fo)/ (Fb – Ff) Ff, Fb – fluorescence volné, vázané frakce Fb, Ff –kvant. Výtěžek fluorescence vázaného, volného ligandu Cb,Cf – koncentrace vázaného, volného Ligandu C – celková koncentrace ligandu F – celková fluorescence Použití fluorimetrie ke sledování struktury biopolymerů a interakcí parinar AOC16 Interakce makromolekul s ligandy Použití fluorescenčních analogů FluorescPL Kys. cis-parinarová Anthroyloxypalmitát Fluorescein-PE Vazba ligandu - Scatchardův model • Mf + Lf ML (= Lb) • •Kas = [Lb] / ([Mf] . [Lf]) = [Lb] / ([Mt](n-n) . [Lf]) • •[Lb] / [Mt] = n, [Lb] = n . [Mt], Kas = n / (n-n) . [Lf]) • •Kas . (n-n) = n / [Lf] Kas . n - Kas . n = n/ [Lf] • Scatchardův model •Grafické •Znázornění •odpovídá •nesedí Fluorescenční sondy • • • • • • •ANS – 1,8-anilinonaftalensulfonát • Použití fluorimetrie ke sledování vazby F = Ff + Fb F = [Lf] .Ff + [Lb].Fb F = ([Lt] - [Lb]) Ff + [Lb].Fb F = [Lt].Ff – [Lb].Ff + [Lb].Fb F = Fo + [Lb].(Fb – Ff) [Lb] = (F – Fo)/ (Fb – Ff) Ff, Fb – fluorescence volné, vázané frakce Fb, Ff –kvant. Výtěžek fluorescence vázaného, volného ligandu [Lb], [Lf] – koncentrace vázaného, volného ligandu [Lt] – celková koncentrace ligandu F – celková fluorescence