MOLEKULOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROFOTOMETRIE v UV a viditelné oblasti spektra ENERGIE MOLEKULY • EM = ET + ER + EV + EE • EE > EV > ER > ET Kvantovaná energie ⇒ energetické hladiny: – Rotační ⇒ přechody mezi rotačními stavy ⇒ rotační spektra (MW) – Vibrační ⇒ přechody mezi vibračními stavy ⇒ vibrační spektra (IR) ∆EV ≈ X.104 . ∆ER – Elektronové ⇒ přechody mezi elektronovými stavy ⇒ – elektronická spektra (UV-Vis) ∆EE ≈ X.102 . ∆EV ENERGETICKÉ PŘECHODY V MOLEKULE A MOLEKULOVÁ SPEKTRA V=0 V=1 V=2 V=3 V=4 V=0 V=1 ∆EE = 6,2 – 1,5 eV ∆EV = 0,6 – 0,06 eV ∆ER = 0,01 – 0,0001 eV ∆EE Vibronický přechod ∆EE Rotačně-vibrační př. ∆EV Rotační přechod ∆ER ∆EV ∆ER ELEKTRONICKÉ PŘECHODY VE FORMALDEHYDU n π π* π* ELEKTROMAGNETICKÉ VLNĚNÍ SPEKTRUM ELEKTROMAGNETICKÉHO ZÁŘENÍ ZÁŘENÍ UV - Vis E = hν = hc/λ c je rychlost světla (3×108 m/s) h = 6.65 × 10−34 J·s = 4.1 µeV/GHz je Planckova konstanta VIDITELNVIDITELNÉÉ SVSVĚĚTLOTLO ZZáářřeneníí o vlnových do vlnových déélklkáách 400ch 400 -- 800800 nmnm jeje viditelnviditelnéé svsvěětlo, ktertlo, kteréé je absorbovje absorbovááno ano a emitovemitovááno elektrony v atomech a molekulno elektrony v atomech a molekuláách,ch, kdykdyžž ppřřechecháázejzejíí mezi energetickými hladinami.mezi energetickými hladinami. Barva Vlnová délka Frekvence červená ~ 625 až 740 nm ~ 480 až 405 THz oranžová ~ 590 až 625 nm ~ 510 až 480 THz žlutá ~ 565 až 590 nm ~ 530 až 510 THz zelená ~ 520 až 565 nm ~ 580 až 530 THz azurová ~ 500 až 520 nm ~ 600 až 580 THz modrá ~ 430 až 500 nm ~ 700 až 600 THz fialová ~ 380 až 430 nm ~ 790 až 700 THz INTERAKCE ZINTERAKCE ZÁÁŘŘENENÍÍ S LS LÁÁTKOUTKOU 11 22 •• AbsorpceAbsorpce 11 •• EmiseEmise 22 •• LuminiscenceLuminiscence 33 EE0 EE22 EE11 0 EE33 33 EE33 >> EE22 >>EE11 >>EE00 hhννabsabs = E= E33--EE00 hhννemem = E= E33--EE11 hhννlumlum = E= E22--EE00 PROPUSTNOSTPROPUSTNOST AA BARVABARVA LidskLidskéé oko vidoko vidíí komplementkomplementáárnrníí barvu, svbarvu, svěětlotlo vlnových dvlnových déélek, pro nlek, pro něžěž je lje láátka propustntka propustnáá ABSORPCE A KOMPLEMENTABSORPCE A KOMPLEMENTÁÁRNRNÍÍ BARVYBARVY UVUV--Vis spektroskopieVis spektroskopie FotometrieFotometrie • Signál: zářivý tok Φ (W), dopadající Φ0 – Emisní – Absorpční – Luminiscenční (fluorescenční, fosforescenční) • Transmitance T = (Φ/Φ0); (Φ/Φ0)×100 (%) • Absorbance A = log(Φ0/ Φ)= -log T; 0≤A ≤∞ Transmitance a délka absorbujícího prostředí: zákon Bouguer-Lambert prostrediabsorbdélkakonst e/T 0 ×− =ΦΦ= I0 až I5 = propuštěný zářivý tok Φ = Φ0 - Φabs T Délka absorbujícího prostředí Transmitance a koncentrace zákon Beerův ekoncentrackonst 0 e/T ×− =ΦΦ= Concentration T UV-Vis spektroskopie Bouguert-Lambert-Beerův zákon ck ⋅ε= λ dΦ = Φ- Φ0 -dΦ = k·Φ·dl -dΦ/Φ = k·dl Φ0 Φ Φ< Φ0 dl ∫ ∫ ∫ ∫ =−=−==− φ φ l 00 x 1 lnxln x dx xln x dx dlk φ dφ ln(Φ0 /Φ) = k·l ελ je molární absorpční koeficient při λ c je koncentrace UV-Vis spektroskopie Bouguert-Lambert-Beerův zákon )clexp()clexp( 0 0 ⋅⋅ε−Φ=Φ⇒⋅⋅ε= Φ Φ λλ Φ/Φ0 c limΦ=0 c→∞, c=konst. Φ=Φ0·eε·l·c Φ/Φ0 l limΦ=0 l→∞, c=konst. Φ=Φ0·eε·l·c Bouguert-Lambert-Beerův zákon ( ) ( ) cbIIIITA ⋅⋅==−=−= ε/log/loglog 00 Derivační spektrofotometrie D1 D3 Derivační spektrofotometrie 1. derivace minmax;;0derivace.1);(f d dA λλ=λ′= λ funkciklesajícínabod.lexinfmin; d dA funkcirostoucínabod.lexinfmax; d dA = λ = λ Přesné určení polohy maxim λmax širokých absorpčních pásů a inflexních bodů Derivační spektrofotometrie 2. derivace ( ) )(fAminmax;;0 d Ad fAmaxmin;;0 d Ad bodylexníinf;0)´´(f d Ad 2 2 2 2 2 2 λ=≈〉 λ λ=≈〈 λ ≈=λ= λ Přesné určení polohy maxim a minim λmax a λmin širokých absorpčních pásů a inflexních bodů Derivační spektrofotometrie • S rostoucím n sudé derivace klesá šířka centrálního Gaussova píku • Sudé derivace mají vždy centrální pík s alternujícím znaménkem, který koinciduje s původním píkem(λmax) W0 W2 W4-34W66 +41W44 -53W22 +100W00 Orientace ústřeního píku W (%) Pološířka FWHM Derivace n Derivační spektrofotometrie • Lichá derivace (n+1) stupně jakožto derivace n-té derivace obsahuje maximum a minimum. • Velikosti maxima a minima jsou rovny směrnicím tečen v inflexních bodech nté derivace. • Užší = strmější profil tedy poskytuje větší amplitudu jako rozdíl y-souřadnic mezi max. a min. liché derivace D1, D3. • Čím užší pík, tím strmější křídla Gaussova profilu, tj. větší absolutní hodnota směrnice v inflexním bodě. n n W 1 D ⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ = Amplituda Dn n-té derivace je nepřímo úměrná n-té mocnině šířky píku W. T D1 D3 Derivační spektrofotometrie • Derivace Lambert-Beer-Bouguer zákona = zvýšení citlivosti: A = ε·l·c ck d dA d dA D L,lexinfS,lexinf ⋅=⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ λ −⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ λ = λλ •λinflex, S,L je vlnová délka inflexního bodu při kratší (S) a delší (L) části spektra • Amplituda n-té derivace Dn je úměrná koncentraci • S rostoucím stupněm derivace roste citlivost jakožto směrnice k kalibrační přímky S ck d dA d dA D L,lexinfS,lexinf ⋅=⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ λ −⎟ ⎠ ⎞ ⎜ ⎝ ⎛ λ = λλ λinflex, S λinflex, L T λinflex, S λinflex, L D Derivační spektrofotometrie • Velikost derivace v inflexních bodech profilu píku je nezávislá na velikosti pozadí, pokud je v rozsahu ∆λ šířky absorpčního pásu přibližně konstantní. • Derivováním spekter superponovaných na zvýšeném pozadí korigujeme pozadí a zvyšujeme poměr S/B, podstatný pro určení meze detekce • Derivace absorpčních pásů na šikmém pozadí (rozptyl záření) umožňuje určit přesnou vlnovou délku λmax. Derivační spektrofotometrie NBW = 40 nm∆λmax = 30 nm Obálka 2 křivek - rozlišení Derivační spektrofotometrie n A B n,B n,A W W D D ⎟⎟ ⎠ ⎞ ⎜⎜ ⎝ ⎛ = Při stejné absorbanci (výška píku) dává užší pás větší amplitudu D=∆(dA/dλ) lepší citlivost odlišení od širšího pásu. Derivační spektrofotometrie Korekce vlivu rozptýleného záření Derivační spektrofotometrie •• ZlepZlepššeneníí rozlirozliššeneníí ppřřekrývajekrývajííccíích sech se absorpabsorpččnníích pch páássůů – Odhalení pásů příslušejících nečistotám – Přesné určení λmax širokých absorpčních pásů •• ZvýZvýššeneníí citlivosti mcitlivosti měřěřeneníí •• Eliminace pozadEliminace pozadíí – Rayleighova rozptylu – Konstantního pozadí (v závislosti na λ) – Neselektivní absorpce matrice •• ZlepZlepššeneníí pompoměěru signru signáál/pozadl/pozadíí Derivační spektrofotometrie Tvorba derivačních spekter 1) Elektronicky: výstupní napětí proporcionální absorbanci je diferencováno vzhledem k času – vhodné pro skenující monochromátory: – Analogové derivační obvody: •Zesilovač •Derivační členy RC •Pásové filtry pro redukci šumů určitých frekvencí •Kombinace derivačních členů pro vyšší derivace Analogová derivační spektrofotometrie – zvýšení citlivosti ve srovnání s „klasickou fotometrií“ 5n – násobné, kde n = řád derivace x každý RC-člen snižuje poměr S/N faktorem 2. Derivační spektrofotometrie Elektronická tvorba derivačních spekter – diferencování vzhledem k času: dt d d dA dt dA λ λ ⋅= S)mmnm(.konst dt d 1 =⋅= −λ dt dA S 1 d dA ⋅= λ 2 2 22 2 dt Ad S 1 d Ad = λ Derivační spektrofotometrie Tvorba derivačních spekter 2) Opticky: rychlá modulace λ záření do kyvety; Modulace λ = rychlé změny λ, periodické skenování ±λ v malém intervalu ∆λ; ∆λ<< FWHM absorpčního pásu. Derivační spektrum – jako funkce času (konstatní rychlost skenu dλ/dt ) se měří elektronickým diferenciačním členem λ Φ λ Φ d dt dt d d d = dt dΦ Derivační spektrofotometrie Tvorba derivačních spekter – opticky a) Modulace λ: provedení modulace vlnové délky: i. rychlým periodickým skenem monochromátoru ±λ ii. kmitající planparalelní destičkou (posun paprsku) iii.oscilací vstupní nebo výstupní štěrbiny (změna úhlu dopadu paprsku na mřížku) střídavý fotoproud ~ změně Φ v úzkém intervalu ∆λ: 1.derivace spektra ~ 1. harmonická fotoproudu (AC) 2.derivace spektra ~ 2. harmonická fotoproudu (AC) Derivační spektrofotometrie Tvorba derivačních spekter – opticky b) Dvouvlnová spektrofotometrie: spektrometr se dvěma monochromátory, které skenují simultánně s rozdílem ∆λ= 1 až 5 nm. Dva monochromatické paprsky procházejí střídavě kyvetou (rotující sektor, zrcadlo). Derivační spektrofotometrie Tvorba derivačních spekter 3) Matematicky: v současné době nejvíce používáno Aproximace 1. derivace: polynom, Savitzky-Golay λ∆ λ∆λλ∆λ λ 2 )(A)(A d dA −−+ =