Nukleární magnetická rezonance Řešení prostorové struktury molekul Homogenizace magnetického pole - shimování • vliv okolí a nehomogenního vzorku - B0 různé v jednotlivých částech vzorku - různé rezonanční frekv. -CH2- Homogenizace magnetického pole - shimování • homogenní B0 - shodné rezonanční frekvence pro stejné atomy, např. CH2 skupina v EtOH. Homogenizace magnetického pole - shimování • homogenita se docílí korekčními, tzv. shimovacími cívkami • korekční cívky jsou umístěny kolem vzorku v různých směrech Homogenizace magnetického pole - shimování y2x2 xz3 Stabilizace magnetického pole -lockování ("locking") • B0 se mění v čase • pro stabilizaci B0 se používá tzv. field lock • korekce B0 podle změny polohy signálu 2H Stabilizace magnetického pole - lockování rezonanční pozice deuteria í při změně mag. pole - změna rezonanční frekvence přístroj indukuje přídavné pole v opačném směru a vrátí rezonanční frekvenci na původní hodnotu • pro měření 2H, lockování na 19F Stabilizace magnetického pole lockování ("locking") Průřez NMR spektrometrem otvor pro kyve ty ^ korekční cívky ^ izolační vrstva vnitřní Dewarova nádoba pro hélium vnejsi Dewarova nádoba pro dusík ^ i 1 11 i - ! plnění hélia plnění dusíku supravodivá cívka N M R ky vety Klasické kyvety Klasické kyvety • průměr: 1, 3, 5,10 mm • délka: ~ 20 cm • objem vzorku pro 5 mm kyvetu 500-600 |il • vyrobeny z borosilikátového skla Shigemi • velikosti stejné jako klasické kyvety ~ poloviční objemy - 200-300 |il pro 5 mm vysoké dno, do kyvety se zasouvá pístek vyrobeny jsou z materiálu s podobnou magn. susceptibilitou jakou má roztok NMR sondy • kyveta se vzorkem se pouští do sondy • obsahuje cívky laděné na frekvenci jednoho nebo více jader při daném magnetickém poli • další cívka zabezpečuje gradientní pulzy • jsou konstruovány pro různou velikost NMR kyvet • kryosondy - prostor cívek je chlazen asi na 20K -> zvýšena citlivost cívky díky snížené úrovni tepelného šumu Vývoj N M R spektrometrů 25.00 2 20.00 o Q. O .C o c O) CO E tí) O 15.00 10.00 ô 5.00 > 0.00 1000 900 4, 800: 750 600 220 27 400 36 J(c/s) > J(gauche) >J(90°) *0 H alkeny: i(trans) > i(cis) 3)(trans): 14-20 Hz H cyklohexan v židličkové konformaci i(aa) > i(ae) ~ j(ee) 3J(c/s): 6-14 Hz J(aa): 10-16 Hz O * 180° J(ae) = J(ee):3-5Hz O * 60° Dihedrální úhly konfigurace na dvojné vazbě: C2H5 —O CH(CH3)2 H K-_X 3J(c/'s): 6 Hz 3J(ůrans): 13 Hz CH(CH3)2 konfigurace na dusíku s volným elektronovým párem: ^H^N): ~ 14 Hz ^H^N): 2-3 Hz Meziatomové vzdálenosti • využití NOE interakcí • NOE klesá se šestou mocninou meziatomových vzdáleností (NOE~ 1/r6) • pro malé, rychle rotující molekuly: NOE > 1 • pro velké, pomalé molekuly, ve viskózních rozpouštědlech: NOE < 1 -i ■ -1,5 J Měření NOE A: 180° s 90° tm m ||| ŕ ni'"' selektivní inverze 90° B: t m <-► i i/W. diferenční spektrum A-B NOE výstavbová křivka • intenzita NOE závisí na směšovacím čase tm • měřením NOE při různých časech tm získáme výstavbovou křivku • čím delší je tm, tím je NOE menší v důsledku podélné relaxace a spinové difúze i max Spinová difúze u sousedících spinu ve vzorku dochází ke křížové relaxaci ozáření jádra 1 indukuje pozitivní NOE na jádru 2 a dále negativní NOE u jádra 3 oo 28% O O: -13% Výpočet vzdálenosti směrnice a výstavbové křivky v bodě 0 -rychlostní konstanta křížové relaxace nutné zvolit vhodné tm, aby ještě nedocházelo ke spinové difúzi H max aab> °ac rab 6 rab-známa, referenční vzdálenost rac - měřená neznámá vzdálenost a - rychlostní konstanta křížové relaxace ab * (°ab/°ac)1,e 2.2 2.4 2.6 2.8 lim Výpočet vzdálenosti 0 200 400 600 800 1000 1200 mixing time Výpočet vzdálenosti zjednodušený přístup na základě intenzit signálů zjištění intenzity NOE - integrace XVI • XI / V • i • x I v 'v \ - výska signálu (pri stejné polosirce) rab ~ rref 'ab 'ac Ll lab rab 6 lac °^ rac -6 Relativní citlivost NMR experimentů ID experimenty Množství vzorku (mg) 13C pH} 13C DEPT ID 13C-13C INADEQUATE 0,004 4 5 75 2D experimenty Množství vzorku (mg) COSY 0,5 delayed COSY 1 phase-sensitive COSY 1 HETCOR 10 long-range HETCOR 20 HSQC, HMQC 2 HMBC 4 NOESY 8 homonuclear 2D 7-resolved 1 heteronuclear 2D7-resolved 40 2D 13C-13C INADEQUATE 300 Přibližně pro 12ti hodinové měření na 400 MHz spektrometru DOSY Diffusion-Ordered Spectroscopy 'H GP 90 180 <- G1 G1 —r A ') / = /0exp | - (YSG)2D (A -1 Acetone Isomenlhol TMS 2.0 L5 1.0 Increasing gradient Strength 0.5 0.0 ppm