Mendel lecture Dnes od 17.00 „Defensive RNA Silencing in plants and animals“ Olivier VOINNET Swiss Federal Institute of Technology Zurich, Switzerland DNA-vazebné motivy specifických transkripčních faktorů Obecné TFII komplexy, histon … a proces transkripce Komplexy spojené s transkripcí File:Transcription Factors.svg •Velký žlábek má velikost odpovídající rozměrům a-šroubovice a má exponované H-vazebné skupiny •Nejčastěji interaguje Arg (pozitivní náboj + vodíkové vazby) •Další vazebné motivy (b-listy, hydrofobní AMK, malý žlábek) •Zipper typ •Helix-turn-helix •Zinkový prst •Histon, HMG-box • • b-barrel • b-hairpin/ribbon • Smíšené a/b histon HMG - histony vážou DNA sekvenčně nespecificky - histonové podjednotky (H2A, H2B, H3, H4) obsahují svazky 3-4 šroubovic skládaných proti sobě (histon fold) - DNA se obtáčí kolem válcovitého oktameru (2x4 histony) - šroubovice se vážou na cukrfosfátovou kostru DNA 1KX3 Liljas a spol. H3 H4 H3/H4 interagují s oběma vlákny – silnější vazba AP-1 NF-kB enhanceosome - AP-1/IRF-3/IRF-7/NF-kB pokrývá sekvenci -102 až -47 básí upstream od počátku transkripce - nukleosom-free oblast (nukleosom downstream zakrývá TATA-box) - všechny podjednotky (TA domény) enhanceosomu interagují s CBP/p300 acetylásou - acetylace nukleosomu vede k jeho remodelingu/přemístění - uvolní se TATA-box pro vazbu TBP/TFIID a RNA polymerasy II Agalioto et al, Cell, 2000 Panne, CO in SB, 2008 CBP/p300 IFN-b enhanceosom Modifikace histonů - acetylace rozvolňuje vazbu oktameru a zpřístupňuje sekvence DNA pro TBP - TFIID se váže na Ac-H4 prostřednictvím bromodomény TAF1 proteinu Alberts, MCB (kniha) Swi/Snf - Transkripční faktory NF-Y (podjednotky B a C ) obsahují histon-fold a vážou se sekvenčně nespecificky na cukrfosfátovou kostru jako histony - DNA se v důsledku vazby ohýbá podobně jako v nukleosomech - NF-YA podjednotka rozeznává CCAAT sekvenci pomocí a-šroubovice (interkalace do MŽ) - Nardini et al., Cell, 2013 Full-size image (131 K) Nardini et al., Cell, 2013 NF-YA podjednotka rozeznává CCAAT sekvenci pomocí a-šroubovice (interkalace do MŽ) Nardini et al., Cell, 2013 PIIS0092867412014353 - NF-Y se váže přes histon-fold a nahrazuje nukleosom - podobně jako ubiquitince histonu (H2B) i ubiquitinace NF-YB aktivuje transkripci - TAF6 TBP–associated factors (9 z 13 podjednotek TFIID komplexu mají histon-fold, ale nevytváří oktamery) Histon-fold doména se neváže na DNA (podílí se C-konec) Shao et al, MCB, 2005 PDB:1TAF TAF6/TAF9 TAF9 ve dvou kopiích (nikoli v dimerech) Bieniossek et al., Nature, 2013 video - TAF4, 6, 9 a 12 obsahují histon-fold a jsou ve dvou kopiích (nikoli v dimerech) v „core“ části TFIID komplexu - TFIID komplex a TBP jsou klíčové pro rozpoznání promotorů a poskytují scaffold/lešení pro sestavení transkripčního systému „core“ > •Velký žlábek má velikost odpovídající rozměrům a-šroubovice a má exponované H-vazebné skupiny •Nejčastěji interaguje Arg (pozitivní náboj + vodíkové vazby) •Další vazebné motivy (b-listy, hydrofobní AMK, malý žlábek) •Zipper typ •Helix-turn-helix •Zinkový prst •Histon, HMG-box • • b-barrel • b-hairpin/ribbon • Smíšené a/b histon HMG - ohyb a rozvolnění párování dsDNA může napomáhat procesům replikace, transkripce a rekombinace/opravy poškozené DNA - ohyb napomáhá přiblížení vzdálených míst nebo zpřístupňuje DNA pro transkripční faktory Prof. Fajkus - HMGB (HMG-box) obsahuje 3 šroubovice uskupené ve tvaru L - 1. a 2. šroubovice váže cukrfosfátovou kostru a báze v MŽ - interkalace aromatických AMK způsobuje ohnutí DNA HMG%20Fig1 HMG-D (1E7J) Aromatické aminokyseliny se interkalují do MŽ a vytváří kink IFN-b enhanceosom AP-1 NF-kB - HMGA1a se váže na 4 místa a (ohýbá DNA) napomáhá sestavení enhanceosomu - není ale součástí finálního komplexu - AP-1/IRF-3/IRF-7/NF-kB - nukleosom-free oblast (nukleosom downstream zakrývá TATA-box) - všechny podjednotky (TA domény) enhanceosomu interagují s CBP/p300 acetylásou - acetylace nukleosomu vede k jeho remodelingu/přemístění - uvolní se TATA-box pro vazbu TBP/TFIID a RNA polymerasy II transkripce HMGA-1 Agalioto et al, Cell, 2000 Panne, CO in SB, 2008 Motivy DNA vazebných domén •Zipper typ –Leucinový zip –Helix-loop-helix •Helix-otáčka-helix –Winged helix •Zinkový prst – bba zinc-finger –Hormon-receptor –Loop-sheet-helix –Gal4 •Histon, HMG-box • b-hairpin/ribbon • b- barrel •Enzymy b-listy a-šroubovice - pouze 2-3 b-listy nebo hairpin - represory, chromosomální proteiny (lešení pro strukturu DNA) - vážou velký nebo malý žlábek - - b-hairpins lokalizovány podél malého žlábku - Inzerce Pro mezi baze a ohyb DNA Motivy DNA vazebných domén b-listy a-šroubovice •Zipper typ –Leucinový zip –Helix-loop-helix •Helix-otáčka-helix –Winged helix •Zinkový prst – bba zinc-finger –Hormon-receptor –Loop-sheet-helix –Gal4 •Histon, HMG-box • b-hairpin/ribbon • b- barrel •Enzymy OB-fold (oligonucleotide/oligosacharide binding) -4-5 anti-paralelních b-listů (b-barel) zakončeno a-šroubovicí (kompaktní) -vytváří úzkou jamku pro jednořetězcovou ssDNA (RNA, oligosacharidy) -váže 2-5 nukleotidů (báze, cukry i fosfáty) -SSB/RP-A a TRF proteiny -replikace, HR, telomery ...(příští přednáška + Dr. Kolesár) - Liljas, kniha (2SNS) OB-fold (oligonucleotide/oligosachcaride binding, 1JMC) Více OB – RPA70 (A+B) vytváří prodlouženou lineární kapsu Bochkareva et al, EMBO J, 2002 Flynn a Zou, CR in BMB, 2010 Centrální část RPA komplexu (1L10) a model celého komplexu - protein-proteinové interakce (integrita komplexu) - celý komplex ~30nt - protein-proteinové interakce (integrita komplexu + interakce s dalšími proteiny/komplexy) - příští přednáška + Dr. Kolesár (cdc13 v kvasinkách) CST komplex (RPA-like) – regulace telomer (obsahují ssDNA) Flynn a Zou, CR in BMB, 2010 - oprava DNA - část komplexu SHELTERIN – chrání telomery (aby nebyly považovány za DSB, reguluje přístup telomerásy) nespecifická vazba TTAGGGTTAG-specifická vazba domény jsou vůči sobě pootočeny – ohyb/kink na ssDNA (1XJB) - část komplexu SHELTERIN – chrání telomery (aby nebyly považovány za DSB, reguluje přístup telomerásy) Lei et al,NSMB, 2004 OB-fold (POT1) domény jsou vůči sobě pootočeny – ohyb/kink na ssDNA (1XJB) TATA-box vážící protein (TBP) – klíčový pro sestavení preiniciačního komplexu -10 anti-paralelních b-listů pokrývá MŽ -Interkalují se postranní řetězce Phe (hydrofobní v.) -vytvaří ohyb (kink) a rozplétá dsDNA -Konsensní sekvence: TATA(A/T)A(A/T)(A/G) 1YTB Liljas a spol. 1NH2 - TFIIA (2 podjednotky) komplex interaguje s TBP a DNA - brání represorům v inhibici vazby TBP na TATA-box (ko-aktivátor některých sekvenčně specifických trans. faktorů) – není esenciální - b-barrel váže DNA (neovlivňuje strukturu) TBP TFIIA TBP ohýbá a rozplétá dsDNA IFN-b enhanceosom – začátek transkripce - HMGA1a se váže na 4 místa a (ohýbá DNA) napomáhá sestavení enhanceosomu - není ale součástí finálního komplexu - AP-1/IRF-3/IRF-7/NF-kB - nukleosom-free oblast (nukleosom downstream zakrývá TATA-box) - všechny podjednotky enhanceosomu interagují s CBP/p300 acetylásou - acetylace nukleosomu vede k jeho remodelingu/přemístění - uvolní se TATA-box pro vazbu TBP a TFIID/RNA polymerasy II Agalioto et al, Cell, 2000 Panne, CO in SB, 2008 Thomas et al., CRiBMB, 2006 začátek transkripce - faktory Bieniossek et al., Nature, 2013 - TFIID komplex a TBP jsou klíčové pro rozpoznání promotorů a poskytují scaffold/lešení pro sestavení transkripčního systému Připojením TAF8+10 na „core“ část dochází ke konformační změně a vzniku asymetrického komplexu „core“ Bieniossek et al., Nature, 2013 - TFIID komplex a TBP jsou klíčové pro rozpoznání promotorů a poskytují scaffold/lešení pro sestavení transkripčního systému - Po připojení zbývajících podjednotek TFIID komplexu včetně TBP vzniká funkční holokomplex – TBP se váže na TATA-box … TAF1 se váže na Ac-H4 cryoEM Full-size image (43 K) Full-size image (102 K) Cianfrocco et al, Cell, 2013 - Footprint anlýza – ukázala jak se TFIIA-TFIID/TBP komplex společně váže na DNA (TFIIA pomáhá vázat TATA box) - cryoEM ukázaly, že dochází k reorganizaci TFIID Full-size image (30 K) TBP TFIIA TAF1 TAF6/9 Full-size image (43 K) Cianfrocco et al, Cell, 2013 TBP TFIIA TAF1 TFIIB je klíčový pro další postup transkripce – propojuje TFIID-TFIIA s RNA pol II TAF6/9 - Footprint anlýza – ukázala jak se TFIIA-TFIID/TBP komplex společně váže na DNA (TFIIA pomáhá vázat TATA box) - cryoEM ukázaly, že dochází k reorganizaci TFIID Full-size image (43 K) TBP TFIIA TAF1 TAF6/9 - TFIIB (C-konec) váže TBP a 6-7bp up- a downstream od ohybu DNA přes cukrfosfátovou kostru (kolem TATA boxu) TFIIB stéricky nevadí TFIIA (viz později) 1VOL Nikolov et al, Nature, 1995 - TFIIB (N-konec) váže RNA polymerasu II a orientuje TFIID-TFIIA-DNA komplex na pol II (do jeho aktivního centra/cleft) - Zn-ribbon s dock, B-finger/reader s RNA tunelem, B-core/CTD1 s wall, B-linker s CC clamp - - B-ribbon s dock, B-finger/reader s RNA tunelem, B-core/CTD1 s wall, B-linker s CC clamp - umístění TFIIB determinuje pozici počátku transkripce - pozice B-reader (v RNA tunelu) limituje iniciační krok (12nt RNA) - po dosažení 12nt RNA dochází k disociaci TFIIB (elongace…) RNA pol II s TFIIB krystal s částí DNA a krátkým řetězcem RNA 4BBS, Sainsbury et al, Nature, 2013 - postupným odhalováním detailů struktur, mutagenezí podjednotek, funkčními testy (in vitro a in vivo) byly identifikovány všechny TFII a určeno pořadí jejich působení He et al, Nature, 2013 -biotin-DNA navázána na streptavidinové kuličky – na DNA nachytány in vitro sestavené komplexy – odštěpeno SalI a cryoEM - postupně rekonstituován celý PIC He et al, Nature, 2013 TFIIB TBP TFIIA TFIIF - TFIIF (navázaný na pol II) stabilizuje DNA v prohlubni/cleft pol II a pomáhá TFIIB s nastavením startu (WHD z RAP30 podjednotky váže přímo DNA: BREdownstream) - změna natočení TFIIA+TFIIB+TBP/TFIID+RNA pol II - váže TFIIE a TFIIH a pomáhá tak stabilizaci komplexu RNA pol II Dimerizace WHD Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012 - TFIIF (navázaný na pol II) stabilzuje DNA v prohlubni/cleft pol II a pomáhá TFIIB s nastavením startu (WHD z RAP30 podjednotky váže přímo BREdownstream) - změna natočení TFIIA-TFIIB-TBP-pol II -váže TFIIE a TFIIH a pomáhá tak stabilizaci komplexu (vidí DNA) - tandem 4x WHD uzamyká DNA v pol II prohlubni TFIIE He et al, Nature, 2013 cleft DNA DNA Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012 - TFIIF (navázaný na pol II) stabilzuje DNA v prohlubni/cleft pol II a pomáhá TFIIB s nastavením startu (WHD z RAP30 podjednotky váže přímo BREdownstream) - změna natočení TFIIA-TFIIB-TBP-pol II -váže TFIIE a TFIIH a pomáhá tak stabilizaci komplexu (vidí DNA) - tandem 4x WHD uzamyká DNA v pol II prohlubni He et al, Nature, 2013 cleft DNA DNA Dimerizace WHD Vanini & Cramer, Mol Cell, 2012 TFIIEa TFIIEb TFIIFa dsDNA (closed) ssDNA (open) TFIIB Rpb4/7 RNA pol II TFIIE TFIIF TFIIH kvasinkový PIC komplex Gibbons et al, PNAS, 2012 lidský PIC komplex He et al, Nature, 2013 TBP TFIIA TFIIE TFIIF TBP TFIIA TFIIH RNA pol II - TFIIH (10 podjednotek, 450KDa), podkomplex CDK7-cyclin H-MAT1 fosforyluje pol II (Rpb1) - XPB v kontaktu s DNA rozvíjí dvoušroubovici - TFIIH (10 podjednotek, 450KDa), podkomplex CDK7-cyclin H-MAT1 fosforyluje pol II (Rpb1) - XPB v kontaktu s DNA rozvíjí dvoušroubovici lidský PIC komplex He et al, Nature, 2013 helikása lešení/scaffold - XPB a XPD regulují transkripci vs opravu DNA (NER) Graphic Murakami et al., Science, 2013 - pohled z jiného úhlu - TBP-TFIIA-TFIIA-RNA-pol II (tunýlek kde se syntetizuje nový RNA řetězec) video > - celý mechanismus aktivace transkripce od vazby aktivátoru … uvolnění chromatinové struktury … zahrnuje ještě další podkomplexy (jako např. mediator) TBP TFIIB Rpb4/7 TFIIA RNA pol II TFIIE TFIIH Gibbons et al, PNAS, 2012 TFIIF mediator