•Úvod - Analýza proteinu –Domény •fold-struktura (ss, 3D – homolog v PDB? – I-TASSER) •Interakce (IntAct, BioGRID) –Komplexy •Funkce •Lokalizace –evoluce •Konkrétní nová data – článek •V PyMolu připravit 3D movie •Ujasnit si souvislosti, rozšířit si znalosti, aplikovat poznatky z přednášek … • •PhD studenti anglicky • - komplexy podílející se na replikaci DNA - komplexy účastnící se přepisu informace - komplexy opravující poškozenou DNA - komplexy vytvářející strukturu chromosomu - samotný chromosom je obrovským dynamickým nukleoproteinovým komplexem (nikoli holá DNA) REPLIKACE ÓPRAVA DNA Co zde schází?? Chromatin = histony … - komplexy podílející se na replikaci DNA - komplexy účastnící se přepisu informace - komplexy opravující poškozenou DNA cover popup TFIIB Rpb4/7 RNA pol II TFIIE TFIIF TFIIH kvasinkový PIC komplex Gibbons et al, PNAS, 2012 TBP TFIIA TRANSKRIPCE - Samotný chromosom je obrovským dynamickým nukleoproteinovým komplexem s mnoha odlišnými částmi - DNA makromolekula asociovaná s různými proteinovými komplexy – (lidský genom 3x109bp – natažený řetězec 1chromosomu cca 4cm!!) - komplexy vytvářející strukturu chromosomu - vytváří základní strukturu - nukleosomy (histonový oktamer) a histony (H1) - HMG, HP proteiny - vytváří specializované domény - centromery, telomery - podílí se na dynamice struktury - kohesin, kondensin a SMC5-6 komplex chromosomy přednášky prof. Fajkuse: Struktura a funkce eukaryotických chromozomů (C9041) Nukleosom oktamer histonů H2A, H2B, H3, H4 histon fold komplexy vytvářející strukturu chromosomu - 146bp – histon fold - centrální část DNA váže tetramer H3-H4 - okraje DNA vážou dimery H2A-H2B - 10bp konce DNA vážou N-koncové šroubovice H3 (acetylovaný K56) Skládání histonů do nukleosomu (komplexu) - 146bp - centrální část DNA váže tetramer H3-H4 - H3 dimerizuje přes postraní šroubovici - okraje DNA vážou dimery H2A-H2B - 10bp konce DNA vážou šroubovice H3 (acetylovaný K56) - - - - Ransom et al, Cell, 2010 H3-H4 Figure 4-26 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) figure 4-26 Sestavování nukleozomu: - Silnější je interakce mezi H3-H4 - H3 dimerizuje přes postraní šroubovici a vytváří tetramer který asociuje s DNA - dimery H2A-H2B se vážou následně z obou stran tetrameru (H3-H4)2 - - - při uvolňování odpadají nejdříve dimery H2A-H2B - H2A a H3 existují ve více variantách, které mohou být zaměněny v nukleosomu Ransom et al, Cell, 2010 Nabalování a rozbalování histonů Histonové H3-H4 chaperony - Postupné sestavování (a uvolňování) histonů je zprostředkováno různými chaperony (+ ATP-dependent remodeling “stroji”) - ASF1 (antisilencing function, tetramerizace) => CAF1 (chromatin assambly factor, vazba k DNA) Ransom et al, Cell, 2010 Histon chaperony - replikace - na ssDNA nukleosomy nejsou: replikace, transkripce, oprava DNA ... - před těmito procesy se musí histony odstranit a poté zase nabalit … (feedback: inhibice chromatin assembly inhibuje disassembly nukleosomů) - 1. ASF1 (váže MCM a PCNA) a 2. CAF1 (assembly) pro H3-H4 disassembly a assembly 250-300bp – cca nukleosom - histon chaperon komplex FACT (facilitates chromatin transcription) je složen ze 2 podjednotek (Spt16 a Pob3/SSRP1) - dimerizační část také interaguje s DNA-polymerásou (spojení s replikací) - rozeznává histon H2A-H2B heterodimer (interferuje s vazbou na DNA tzn. rozrušení vazby H2A-H2B s DNA) C:\Documents and Settings\Administrator\Desktop\New Folder\completed\nature12242-f1.2.jpg FACT komplex Hondele et al., Nature, 2013 disassembly a assembly Histon chaperony - nově syntetizované H3 (replikace) jsou acetylované na K56 – jsou specificky rozeznávány a zainkorporovávány CAF-1 komplexem - acetylace K56 (šroubovice) interferuje s vazbou na DNA (cca 8x slabší) - pozice nukleosomu je náhodná a následně je „upravená“ pomocí remodelačních komplexů (a teprve poté je H3 K56 deacetylován a stabilizován) - pozdější acetylace (Gcn5-HAT) rozvolňuje nukleosomy v místech transkripce - možnost nově zabudovat histonové varianty - nejznámější: CenH3/CENP-A (specificky v centromerách – ukotvení kinetochor – klíčový pro segregaci chromosomu) - H2A.Z v regulaci transkripce, opravě DNA, hranice chromatinu Variantní histony mohou vyznačovat hranice chromozomálních domén. (A) Typický chromozom vykazující doménové členění. (B) V kvasinkách brání H2A.Z šíření umlčeného chromatinu do sousedních oblastí… (D) Centromerické nucleozómy obsahují centromerickou variantu H3. Variantní histony - CenH3/CENP-A … specificky v centromerách - H2A.Z - v regulaci transkripce, opravě DNA, hranice chromatinu (integrita centromer a telomer) - H2A.Z je důležitý pro aktivaci transkripce - 1 nukleosom up- a 1 nukl. down-stream TSS - odstraněn po aktivaci transkripce … Billon a Cote, BBA, 2012 Oprava poškozené DNA - chromatin Upravené z Tatum & Li, 2011 - na ssDNA nukleosomy nejsou … oprava DNA - před těmito procesy se musí histony odstranit a poté zase nabalit … - pro malá poškození (NER, BER) postačí menší změny chromatinu zatímco pro větší (DSB - resekce DNA tj. vznik ssDNA) musí nukleosomy odstranit - NER (BER) doprovázeno acetylací histonů a remodelací (posuvem) - při DSB musí být odstraněny nukleosomy pomocí ASF1 a CAF-1, aby mohlo dojít k účinné resekci (patrně fyzicky spojené procesy) - po opravě poškozené DNA jsou nukleosomy uloženy zpět (díky interakci PCNA s ASF1 a CAF-1 – i zde je H3 K56 acetylován) - Sgs1/BLM interaguje s CAF-1 a reguluje jeho funkci - až kompletní reassembly chromatinu signalizuje dokončení opravy! - Tsabar & Haber, CO in GD, 2013 Ransom et al, Cell, 2010 - poškozená DNA signalizuje/spouští „DNA damage checkpoint“ - kinasy - H2A.X varianta je fosforylována (v okolí poškození ~50kb během 15min; H2A u kvasinek) - po opravě poškození je gH2A.X vyměněn FACT komplexem za nefosforylovaný H2A.X (a H2A) - nefosforylovaný H2A.X je chráněn před FACT ribosylací (PARP1) - H2A.Z varianta je zainkorporována v okolí poškození (SWR a Chz1) a pomáhá resekci DNA - ukončení opravy je signalizováno až dokončením chromatinového vlákna Oprava poškozené DNA – H2A histony Billon a Cote, BBA, 2012 Bao a Shen, Snapshot in Cell, 2010 Remodelovací komplexy - ATP-dependentní remodelace (SWI2/SNF superrodina) - „sklouznutí“, rozložení, odstranění nukleosomu nebo „výměna“ histonových dimerů - SWR komplex specificky zaměňuje H2A-H2B dimer za H2A.Z-H2B bromodoména SWR komplex - mapování interakcí pomocí cross-link a MS analýzy Nguyen et al., Cell, 2013 Nguyen et al., Cell, 2013 science?_ob=MiamiCaptionURL&_method=retrieve&_eid=1-s2 SWR komplex - EM ukázala celkovou strukturu komplexu a konformační změny po navázání nukleosomu Tosi et al., Cell, 2013 INO80 komplex - mapování interakcí pomocí cross-link a MS analýzy - EM analýza ukázala celkovou strukturu komplexu - zmapovali i interakce INO80 s nukleosomem (jádro i „ocásky“) - konformační změna po navázání nukleosomu Tosi et al., Cell, 2013 - H2A.Z - v regulaci transkripce, opravě DNA, hranice chromatinu (integrita centromer a telomer) - „sklouznutí“, rozložení, odstranění nukleosomu nebo „výměna“ histonových dimerů Bao a Shen, Snapshot in Cell, 2010 NASP chaperon přidává histon H1 - nukleosom/H1 – další non-histon proteiny – chromatinové vlákno Vazba H1 uzavírá remodelaci chromatinu komplexy vytvářející strukturu chromosomu - vytváří základní strukturu - nukleosomy (histonový oktamer) a histony (H1) - HMG, HP proteiny - vytváří specializované domény - centromery, telomery - podílí se na dynamice struktury - kohesin, kondensin a SMC5-6 komplex chromosomy Repetitivní sekvence vytvářející specifický chromatin – CENP-A histon, který kotví kinetochoru (kolem je pericentromerický heterochromatin a SMC komplexy) tah mikrotubulů a kohesiny zajišťují správnou segregaci v anafázi Carroll a Straight, Trends in Cell Biol, 2006 10 Repetitivní sekvence vytvářející specifický chromatin – CENP-A histon, který kotví kinetochoru (kolem je pericentromerický heterochromatin a SMC komplexy) tah mikrotubulů a kohesiny zajišťují správnou segregaci v anafázi Velké komplexy viditelné EM > 10 Mad2 komplexy kontrolují ukotvení kinetochor (konformační změna - dokud nejsou všechny nedojde k segregaci) APC komplex (ubiquitin ligasa) proteolyticky štěpí např. sekurin (uvolňuje separasu, která štěpí kleisin tj. otevírá kohesin) vytváří základní strukturu - nukleosomy (histonový oktamer) a histony (H1) - HMG, HP proteiny - vytváří specializované domény - centromery, telomery - podílí se na dynamice struktury - kohesin, kondensin a SMC5-6 komplex chromosomy Model separace chromosomů (S. cerevisiae) APC=anaphase promoting complex Uhlmann et al., Nature, 1999 Komplex Mad2/Cdc20 inhibuje APC – po jeho uvolnění degraduje (ubiquityluje) sekurin – uvolní se tak separasa – štěpí Scc1 kleisin kohesinového komplexu Separasa-securin ATP-binding cassette (ABC) ATP-binding Hinge Dimerizace, vazba na DNA Loading i exit přes otevírání head konce … Kohesin „objímá” DNA Haering et al, Mol Cell, 2002 SMC1 Scc1/Rad21 SMC3 Scc3 Použití fůzních proteinů při studiu kohese sesterských chromatid SMC3-Scc1-Frb + SMC1-FKBP12 (vážou rapamycin) Gruber et al., Cell, 2006 Uzamčení je pro buňku letální Full-size image (60 K) - loading přes hinge - exit přes head - Wpl1 destabilizuje Scc1-SMC3 Marston AL, Genetics, 2014 Loading přes hinge, exit přes head dvěma způsoby – štěpením kleisinu nebo ATP-řízený - regulace acetylací SMC3 - regulace fosforylací Scc3 Remeseiro & Losada, CO in Cell Biol, 2012 - common features: - long SMC arms, dimers=hinge, ATPase heads bridged by kleisin subunits, ring shape (trapping of DNA) - specific features: - Nse2 SUMO ligase, Nse1 ubiquitin E3-ligase SMC6 SMC5 Condensation looping/cohesion DNA-repair ubiquitin SUMO Losada & Hirano, 2005, Gen&Dev - aby se mohl chromatin dále kondenzovat musí být část kohesinu odstraněna Mehta et al, 2013, FEBS Lett. - CTCF se váže/kolokalizuje v oblastech s H3.3 a H2A.Z variantními histony -CTCF interaguje s kohesinem a spolu vytváří transkripční smyčky - - ZÁVĚR: struktura chromatinu je modulována mnoha proteinovými komplexy na různých stupních jeho organizace Millau a Gaudreau, Bioch. Cell Biol, 2011