Transkripce přepis genetické informace z DNA do RNA, při které DNA slouží jako matrice pro syntézu RNA. Reakci katalyzuje RNA-polymeráza (transkriptáza) Zpětná transkripce (RT) - přepis genetické informace z RNA do DNA. Reakci katalyzuje zpětná (reverzní) transkriptáza Transkripce DNA do RNA DNA 3'-TACC AACGCGAATTC • • • • AUGG 5 RNA 3'-TACCCAACGCGAATTC • •• •• •• • AUGGGUUG 5' 3' Značení řetězců DNA podle jejich funkce dsDNA 5' 3' kódující (pozitivní) [nepřepisující se] ■3'* 5 3 antikódující (negativní) (-DNA) [přepisující se] 5' transkripce i m RNA 3'* 5' GATC 3' 3' CTAG 5' 5' GAUČ 3' Směr syntézy mRNA pří transkripci, směr translace mRNA a směr syntézy polypeptidů Syntéta polypeptidů N-konec.....C-konec 4 Transkripce u prokaryot je spřažena s translací, u eukaryot jsou tyto procesy odděleny Prokaryota Eukaryota J RNA polymerase ^ Polycistronic mRNA mRNA is translated while it is still being transcribed (5') I (5') Monocistronic mRNA Poly(A) Addition (5') AAAAAA{3' Tail mRNA must exit from the nucleus before it can be translated AAAAAA (3') 5 Srovnání prokaryotické a eukaryotické mRNA Prokaryotní mRNA kódující sekvence \ PXPXP 1 nekódující sekvence \ 1 I 3' Polygen ní mRNA protein a protein ß protein y Eukaryotní mRNA 5' -čepička kódující sekvence \ I nekódující sekvence 3' "Iaaaaa Monogen ní mRNA (A} protein 6 Srovnání prokaryotických (jednoduchých) strukturních genů s eukaryotickými (složenými) geny kódující oblast dna I__ bakteriální gen kódující oblasti nekódující oblasti (exony) {introny} eukaryontní gen Geny mohou být transkribovány z obou řetězců; jako templát je na daném úseku DNA využíván obvykle jen jeden z řetězců RNA-transkripty 5000 nukleotidových párů 8 Typy RNA vznikající při transkripci u různých typů organismů Total RNA Codin, 4% ol l RNA total Pre-nr (hnR iRNA NA) Noncoding RNA 96% of total Pre-rRNA Pre-tRNA snRNA snoRNA scRNA mi tmRNA and various other types mRNA rRNA tRNA KEY All organisms Eukaryotes only Bacteria only Molekulární druhy molekul RNA vytvářené transkripcí u eukaryot Transkripce a úpravy RNA probíhají v Jádře, Translace probíhá v cytoptamé. Enzymy katalyzující transkripci A. DNA-dependentní RNA-polymeráza (RNA-polymeráza, transkriptáza) matricí je řetězec DNA (prokaryota, eukaryota, DNA-viry) B. RNA-dependentní DNA-polymeráza (zpětná/reverzní transkriptáza) matricí je řetězec RNA (retroviry, retrotranspozony, retroelementy) Primární transkripty tvořené na řetězci DNA O přepisy strukturních genů (mRNA, pre-mRNA/hnRNA) O přepisy genů pro funkční typy RNA • pre-rRNA • pre-tRNA • malé RNA (snRNA, snoRNA, scRNA, miRNA, ...) 11 Funkce podjednotek RNA-polymerázy u E. coli podmiňuje vazbu ribonukleotidů na polymerázu udržuje stabilitu molekuly podmiňuje vazbu RNA-polymerázy k promotoru podmiňuje spojení RNA-polymerázy s matricovým řetězcem 12 Struktura RNA-polymerázy newty synthesized short region of RNA transcript DNA/RNA helix 13 Strukturní gen prokaryot s vyznačením signálů pro transkripci a translaci transkripčné regulačné signály translačné regulačné signály -*-1,-,-*- oblasť -35 PRIBNOWOV BOX iniciácia -10 transkripcie SD iniciačný kodón rozpoznávacia sekvencia vazbové miesto pre RNA-polymerázu pre RNA-polymerázu + 1 DNA TGTTGACA 12 13 ± 2 4-9 m RNA vazbové miesto pre ribozóm TATAATG ... A TAAGGAG 3-9 2 - 11 18-129 í tga h_ oblasť kódujúca terminučný terminátor polypeptidový kodón transkripcie reťazec protein Transkripce strukturních genů Schéma bakteriální mRNA a transkripční jednotky obsahující strukturní geny -transkripční jednotka (vyjádřená v negativním DNA-řetězci) startovací nukleotid ■r ^ promotor TCCT vedoucí sekvence TAC AGGA AUG ATC UAG TAC ATC AUG UAG TAC ATC terminátor AUG UAG -Na ribozomu se překládá jen tento úsek- koncová sekvence 3' mRNA Úseky obsazené geny A, B, C jsou mnohonásobně delší než ostatní! Schéma upozorňuje jen na složení transkripční jednotky a mRNA. Neupozorňuje na délku jednotlivých úseků. Shineova-Dalgarnova sekvence mRNA je multigenní Slouží bezprostředně jako matrice pro syntézu proteinů velmi rychle se rozkládá ribonukleázou (1-2 min) 15 Funkční elementy bakteriálního promotoru -35 -10 + KA.G) I TTGACAT 16-18b promotor < silný slabý TATAAT P * Pribnowův startovací box nukleotid box = krátká sekvence o stejné funkci sekvence -10 templátové vlákno sekvence -35 A 5-9 nebo transkripce - AACTGT TŤGÄČÁ 16-19 bp 3- netemplátové vlákno ■*— sekvence proti směru transkripce nebo AAT 4*- sekvence po směru transkripce lokální rozvíjení Sekvence přirozených a hybridních promotorů -35 Region -10 Region 1 23456789 1011121314151617 consensus • • • T TG A C A.................T A T A A t • • lac G G CT TTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTA TA T T G T trp CT GTTG ACAATT A A TC AT CGA AC T AGTTAACT AG XPL G T G T T G A C AT AA AT AC C A C t G G C G G T G AT ACTG A recA CA CT TG AT AC t G T A t G A A G C A t A C A G T A T A AT TG rad tacll C TG T T GACAAT T AATCAT CGGCTCGTAT AATG T CTGT TGACAAT T AATCAT CGAACTAGT T T A A TGT 15-18 bp 5-9 bp + 1 r Hybridní promotory tac = lac x trp 17 Základní schéma typů transkripčních jednotek bakteriálního genomu Neoperonová transkripční jednotka a operony 4.1" NEOPERONOVÁ TRANSKRIPČNÍ JEDNOTKA startovací nukleotid t promotor operátor _.1 J strukturní gen strukturní gen termjnátor OPERONY strukturní gen strukturní gen +1 1 strukturní gen strukturní gen 1 t operátor překrývající se s promotorem 18 Transkripce bakteriálního genu RNA-polymerázou 1. iniciace 2. elongace 3. terminace 5'l 3'l 51 3'l sigma-faktor rostoucí řetězec RNA /... terminace a uvolnění polymerázy a hotového řetězce RNA 3!] DNA i 3' i5' znovunavazam sigma-faktoru 19 Vytváření molekul mRNA na prokaryotické transkripční jednotce a spřažení transkripce a translace u prokaryot transkripty (RNA) genů podléhají translaci na mnoha ribozomech současně směr transkripce 20 Výměna podjednotek vázajících se na RNA-polymerázu v průběhu transkripce sigma-faktor ILfcRNA-polymeráza a- faktor rozeznává sekvenci -35 na promotoruA Po skončení této funkce se z RNA-polymerázy I uvolňuje. RNA-polymeráza katalyzuje transkripci i bez sigma-faktoru, který je v průběhu elongace nahrazen NúsA-proteinem i Term i nace RNA-polymeráza se z terminátoru uvolní a NusA-protein je opět nahrazen sigma-faktorem. Obr. 148 Vzájemné výměny sigma-faktoru a NusA-proteinu na RNA-polymeráze Terminace transkripce nezávislá na Ró-faktoru Zastavení pohybu RNA-polymerázy Uvolnění hotové RNA Uvolnění RNA-polymerázy z DNA 21 Vazba prokaryotické RNA-polymerázy na promotor RNA-polymeráza (holoenzym) -50 -40 -30 + -20 RNA-polymeráza změní tvar i velikost ■ po rozpoznání promotoru sigma-faktorem. uzavřený binární komplex Obr. 144a Iniciace transkripce -50 -40 (351 -30 -20 +20 bp ^^(+^ +10 +20 bp a - stabilita holoenzym u P - vazba rNTP na polymerázu P'- spojení s matricovým řetězcem a - vazba k promotoru otevřený binární komplex Obr. 144b Iniciace transkripce 22 Iniciace transkripce Sgma-faktor se uvolňuje z RNA-polymerázy. Iniciační fáze transkripce u prokaryot Rozpoznání sekvence a -35 sigma faktorem Core enzyme negativní (templátový) řetězec Prodlužování mRNA lliiii lili;;,. 5' * 3' 24 Typy terminátorů transkripce u prokaryot a) Sekvence bohatá na GC 1 1 I I I I U A A C A r=G < OG C=G 1 G=C -vlásenka 5e smyčkou 1TTTT u uuu u u b) U A C C A U C A A U C A A terminátor nezávislý na ró—faktoru terminátor závislý na r ó—faktoru Strukturní rozdíly mezi dvěma typy prokaryotických terminátorů (jejich transkriptů) 25 Struktura terminátorů nezávislých na ró-faktoru a jejich přepis do mRNA jedinečná sekvence 26 Struktura transkripčnftio terminátoru nezávislého na rho faktoru DNA ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ 5'- CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTTCTTTAATGA -3' 3'- GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAAGAAATTACT -5' transkripce templátovévlákno DNA RNA-transkript 5' CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU OH-3' rychlé skládání RNA složená RNA u c c 5'- C C C A C Složený řetězec RNA napomáha terminaci řetězce. U U U U OH-3' 27 Terminace transkripce mRNA mRNA DNA vlásenka I. Recognition IV. Termination DNA Sigma displaces NusA Výměna sigma faktoru a NusA proteinu na RNA-polymeráze - Sigma faktor: iniciace - NusA protein - terminace Terminace transkripce za účasti Rho faktoru RNA polymerase Elongační fáze transkripce Připojení Rho-faktoru a jeho pohyb po mRNA Připojení Rho-faktoru k sekvenci terminátoru Rho faktor rozmotává hybridní DNA-RNA Uvolnění Rho-faktoru, RNA-polymerázy a mRNA Terminace transkripce závislá na Rho-faktoru Elongační fáze Rho-faktor se pohybuje za RNA-polymerázou Rho-faktor je rozeznáván NusA-proteinem, který je přechodnou součástí RNA-polymerázy. Rho-faktor katalyzuje po vazbě na tento protein odvíjení mRNA z DNA-řetězce a uvolnění RNA-polymerázy. K tomu je zapotřebí ATP, který je hydrolyzován Rho-faktorem vyznačujícím se aktivitou ATPázy. Jakmile se RNA-polymeráza zastaví na terminátorové vlásence, Rho-faktor ji dostihne a oddělí RNA od DNA (Rho = helikáza) Transkripce transkripční jednotky pro rRNA (rrn operony) DNA geny tRNA FěŠ-rŘŇA | tRNA | 23s-rRNA |5s-rRNA| I tRNAl promotory pre-rRNA transkripce terminátory 1 posttranskripční úprava (vyštěpení funkčních produktů) s"\ 16S-rRNA tRNA 23S-rRNA 5S-rRNA tRNA 32 Transkripce transkripční jednotky pro tRNA promotor DNA pre-tRNA geny tRNA tRNA transkripce posttranskripční úprava (vyštěpení funkčních produktů) I I tRNA tRNA 4« tRNA tRNA mRNA 3' 33 Transkripce a úprava genů pro rRNA u bakterií a savců Bakterie Savci gen pro rRNA dna WAWAyAYA^A^AWwW transkripce prekruzor , rRNA30S | prekurzor 4S 16S rRNA tRNA i i I-1 (a) 16S 4S rRNA tRNA 1 štěpení endoribonukleázami prekurzor 23S rRNA prekurzor 5S rRNA H C druhotné štěpení endoribonukleázou a zkrácení exoribonukleázami 23S rRNA 5S rRNA gen rjro rRNA dna primární transkript - prekurzor rRNA45S 5' PPP transkripce 13 000 nukleotidů I i I lvi rozložené oblasti primárního transkriptu 1874 nukleotidů 5' 160 nukleotidů 3' 5' 3' 5' úpravy RNA 4718 nukleotidů (b) 18S rRNA 5,8S rRNA 28S rRNA J OH 3' 34 Úprava pre-tRNA u E. coli * probíhá působením enzymů xonu kleáza RNase P !► enaonukleáza -03' >I50 nudeotides RNase E/F endonukleáza o — (i (i — ii O tRNA-nukleotidyltransferáza dodatečné připojení ACC 35 Transkripce u eukaryot mRNÁ #i M A AAA jTRANSLACE protein i -■•ssswa Eukaryotícké DNA-dependentní RNA-polymerázy Matricí pro syntézu RNA je u všech těchto polymeráz negativní DNA-řetězec. Existují tři druhy těchto RNA-polymeráz: • RNA-polymeráza I, která katalyzuje syntézu pre-rRNA. Nachází se v ja-dérku a není citlivá k a-amanitinu Geny I. třídy • RNA-polymeráza II, která katalyzuje syntézu hnRNA a některých malých rRNA. Je citlivá k a-amanitinu. Vyskytuje se v karyoplazmě. Sestává přibližně z 10 protomerů, z nichž tři největší jsou homolo%ické s protomery a, B a B'prokaryotické RNA-polymerázy. Protomer 6 váže volné ribonukleotidy, 6' se váže k DNA a a spojuje protomery navzájem. Ostatní protomery se neliší od protomerů polymeráz I a III. Geny II. třídy • RNA-polymeráza III, která katalyzuje syntézu pre-tRNA, 5S-rRNA a některých malých RNA. Citlivost k a-amanitinu je druhově specifická. Vyskytuje se v karyoplazmě. Geny III. třídy Každá z uvedených tří RNA-polymeráz vyžaduje svůj specifický promotor, na který se váže. To je rozdíl proti prokaryotům, která mají jen jeden typ RNA-polymerázy a jeden typ promotoru Elementy eukaryotíckého promotoru (Pol II) +1 (startovací nukleotid + Inr-element) - iniciátor TATA-box (Hognessův b.) -34 až -26 - TATA-box CAAT-box -75 až -80 Elementy proti směru GC-box -90 ^transkripce Oktamer ATTTGCAT (upstream elements) oktamerový box počátek transkripce / ATTTGCAT konzervativní sekvence GGGCGG GGCCAATCT konzervativní konzervativní sekvence sekvence -20 / \ / \ GGGCGG TATAAAA konzervativní konzervativní sekvence sekvence +1 38 Struktura promotoru RNA-polymerázy II obecné trans kripční faktory SP1 bazálni trans kripční startovací faktor nukleotid TFIJD ATTTGCAT - GG G C GG—G GC C AATCT—T AT AA AA PyAPyPyPyPyPy -100 •90 ■75 30 Inr-element konvenční sekvence elementů eukaryotického promotoru (iniciátor) Promotory různých genů se liší počtem, umístěním a kombinací těchto elementů. Všechny promotory však musí obsahovat jeden nebo více elementů, aby mohly zahájit bazální transkripci Provozní geny mají jen fnr-efement bez TATA-boxu (Hognessův box). Poznámka Promotory RNA-polymerázy // u některých genů nemají ani TATA-box ani Inr-element Transkripce těchto genů může začít z různých míst seřazených za sebou. 39 Vazebná místa eukaryotického promotoru pro RNA-polymerázu II Initiator c i mém ní 11 fjJŮĚĚĚĚĚkí . element box box enC I_Promoter_I 0 Start of transcription Iniciace transkripce eukaryotních genů RNA-polymerázou II za účasti obecných transkripčních faktorů začátek transkripce TATAbox _I HUTP, ATP CTP, GTP TRANSKRIPCE ZAČÍNÁ pro zahájení transkripce je nutné navázáni TF na TATA-box a na RNA-polymerázu RNA-polymeráza je fosforylována TFIIH (+ATP), mění konformaci a zahajuje transkripci 41 Posttranskrípční úpravy hnRNA Úpravy konců • 5'-konec: připojení čepičky (angl. cap) • 3'-konec: polyadenylace Úpravy vnitřní sekvence • Metylace • Sestřih • Editace (redakční úprava) 42 Posttranskripční úprava transkriptů strukturních genů eukaryot intron transkripce pre-mRNA ..—N. 0 0 0 II II II CH, -O-P-O-P-O-P-0 —CH /OH HO\j 2 I I o- O A No 7-metylcjuanazin 0 O-CH, 1 3 K 5'-konci se připojuje 7-MG čepička. 1. Připojení čepičky 5'-čepička 5'-čepička 5'-čepíčka mRNA 5'-čepička! Připojuje se úsek poly(A). Intron se vyštěpí. -AAAAA(A^190 AAAAOH úsek 3'-poly{A} úsek 3'-poiy(A) úsek 3'-poly(A) 2. Připojení (poly)A konce 3. Sestřih 43 Struktura čepičky ľ "\H H/ OH 01 Hlť ťyi oh ( >_o_p. oh Ah O—C H 2 BÁZÍ: H OH m7G5 ppp5 -mRNA BA2E mRNA°-CH3 Rané stadium transkripce genu RNA-polymerázou II. RNA-polymeráza II 5' 3' pre-mRNA 5' 7-MG (a) 5'-čepička CH3-GpppNpNp CH, t 2'-0-metyltransferáza CH3-GpppNpNp <=> T guanin-7-metyttransferáza GpppNpNp □ 5'- konec primárního ^ PP. + P, guanylyltransferáza GTP pppNpNp transkriptu (b) Biosyntetická dráha 7-MG čepičky. 44 Připojení sekvence poly (A) k 3'konci mRNA transkripční jednotka 5'- čepička Q Štěpení endonukleázou. 5'- čepička ,*jgj2f Přidání úseku poly(A) " poly(A)-polymerázou. RNA-polymeráza MUAAA ^bohatá na GU endonukleolytické štěpení AAUAM 5'- čepička1 AAUAAA ■ AAAAA{A}195 3' úsek poly(A) 45 Schéma polyadenylace 3'-konce hnRNA Přepis polyadenylačního signálu část proti směru transkripce část po směru transkripce hnRNA /U^/VH ostatní proteiny komplexu faktor rozpoznávací přepis polyadenylačního signálu poly (A) ■ polymeráza été|ent^^ Ta to část se rozloží cxonukleázou Iniciační fáze polyadenylace elongační fáze polyadenylace 1 terminaee St 100 Proces vytváření poly A konce na mRNA RNA polymerase Signály na DNA pro uvolnení mRNA a připojení polyA konce Připojení dalších faktorů, uvolnění mRNA Připojení dalších proteinů vázajících se na polyA CstF - cleavage stimulation factor F CPSF - celavage and polyadenylation specificity factor Hotový 3- konec mRNA 47 Transport hotové eukaryotické mRNA z jádra do cytoplazmy TRANSLATION Některé z proteinů zůstávají v jádře, jiné jsou transportovány spolu s mRNA do cytoplazmy a zajišťují její stabilitu a iniciaci translace 48 Sestřih (splicing) - proces, při němž jsou odstraňovány introny Objev: 1977: v genu adenovirů 1978: P-globin, imunoglobulin, ovalbumin, tRNA and rRNA. Známé typy intronů Intron type Where found GU-AG introns Eukaryotic nuclear pre-mRNA AU-AC introns Eukaryotic nuclear pre-mRNA Group 1 Eukaryotic nuclear pre-rRN A, organelle RNAs, few bacterial RNAs Group lí Organelle RNAst some prokaryotic RNAs Group III Organelle RNAs Twintrons Organelle RNAs Pre-tRNA introns Eukaryotic nuclear pre-tRNA Ařchael introns Various RNAs 49 Důkaz přítomnosti intronů v genu pro ovalbumin Splicing diversity (a) Electron micrograph of ovalbumin DNA-mRNA heteroduplex. RNA Schéma intronu s vyznačením konzervativních sekvencí sekvence potřebné pro vyštěpení intronu část primárního transkriptu exon 1 exon 2 52 Schéma struktury intronu v hnRNA «- 5' 3' 5' exon 1 AAG.GUAAGU t S'-místo sestřihu R = purinový nukleotid Y = pyrimidinový nukleotid N = jakýkoliv nukleotid A r- = A nebo C intron- 31 •YNCUFSC-(Y)nN>S CUAAC