Gelová elektroforéza  - GELY
Jako nosiče se používá agaróza (100 – 50 000 bp)
nebo polyakrylamid (10 – 1 000 bp)
zakl jednot agarozy
nosiče vytvářejí síťovou strukturu polymerních  molekul s póry
Agaróza je lineární polymer (původ z mořské řasy)
Separace biomolekul (proteinů, NK) v gelech

6-2701086x%5C72cce7b5-7f53-416c-91ee-57db1c62293b



Polyakrylamid
1_3_1a


•Velikost pórů lze ovlivnit složením roztoku a koncentrací polymeru
•
•Optimální velikost separovaných molekul
–agarózové gely 100 bp až 50 000 bp
–polyakrylamidové 10 až 1000 bp
–
•
•
Koncentrace agarózy
Rozsah dělení ds DNA
0,3 %
5 – 60 kb
0,6 %
1 – 20 kb
0,7 %
0,8 – 10 kb
0,9 %
0,5 – 7 kb
1,2 %
0,4 – 4 kb
1,5 %
0,2 – 3 kb
2,0 %
0,1 – 2 kb
3,0 %
0,05 – 0,5 kb
4,0%
0,005 – 0,2 kb

Radioactive_Fluorescent_Seq
PAGE gely
– rozlišení až 1 nukleotid - sekvenace
Uspořádání elektroforézy
- Horizontální (agarózové gely)
-
-
-
-
-
- Vertikální (PAGE)
mod1_2_photo image_large

Princip DNA ELFO
pohyb DNA s negativním nábojem v neutrálním gelu
a elektroforetickém pufru v elektrickém poli k anodě
Složky gelu
+
-
jamky
DNA
ELFO pufry:
TRIS-acetátový (TAE): 0,04 M Tris-acetát, 0,002 M EDTA
TRIS-fosfátový (TPE): 0,08 M Tris-fosfát, 0,008 M EDTA
TRIS-borátový (TBE): 0,089 M Tris-borát, 0,089 M kyselina boritá, 0,002 M EDTA

AGARÓZOVÁ GELOVÁ  ELEKTROFORÉZA – příprava gelu
elfo gel priprava


Nanášecí (barvící pufr) - 6× koncentrovaný
- barevný
-Hustý - 40% (w/v) sacharóza
-
•               - Ficol 400
•               - glycerol
6097360280_d4ab81e6db_z GelLoadB

Faktory ovlivňující rychlost migrace v gelu
•Konformace DNA
•Složení elektroforetických pufrů (iontová síla-TAE a TBE)
•Složení bazí a teplota (u PAGE)
•Přítomnost interkalačních barviv
•Směr elektrického pole (PFGE > 50 kb)
•Napětí (5V/cm)
•Koncentrace gelu
•Velikost DNA

Pohyb fragmentů DNA v gelu a jejich separace
Graf migrace DNA v gelu


Metody detekce
•Interkalační barviva (ethidium bromid)
•Indolová a imidazolová barviva (DAPI)
•Stříbro
•Kyaninová barviva (SYBR Gold, SYBR Green)
•Radioaktivní značení NK
Gelred-GelGreen111 1d-fig2

Ethidium bromid
Mutagen a karcinogen
Interkalace do dsDNA (vazba i na helixy ssDNA a RNA)
Po interkalaci – 20-30x větší flourescence (fixní pozice v DNA)
Transiluminátor (UV ~ 302 nm), EtBr-DNA emise 590 nm
Citlivost 1-5 ng
EtBr tmp32C166_thumb1 134

Postup přípravy gelu pro ELFO a nanášení vzorků
•Navážit agarózu a smíchat s 1×TAE pufrem, tak
aby vznikl 1% gel
•Rozvařit agarózu  v mikrovlnce.
•Opatrně promíchat a vytemperovat na 50 °C
•Nalít do tvořítka, tak, aby nevznikly bubliny a výška gelu odpovídala 5 mm
•Nechat gel utuhnout (20 - 30 min)
•Přelít gel 1 × konc. TAE pufrem
•Opatrně vysunout hřeben z gelu
•Nanášet vzorky do kterých byl přidán nanášecí pufr
•Provést elektroforézu

Plazmid pUC18 -2,69 kbp
OC
Lds DNA
CCC
RNA
bp
10 000
3 000
2 000
1 000
500
100