Ústav experimentální biologie, Oddělení fyziologie a imunologie živočichů, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Kotlářská 2, Brno 61137, Česká republika
Imunologie hmyzu
www.sci.muni.cz/ofiz
Elektroforéza proteinů hemolymfy
SDS–PAGGE (Sodium dodecylsulfat polyacrylamide gradient gel electrophoresis) - metoda podle
Laemmliho (1970).
Polyakylamidové gely (Obr. 11) vznikají kopolymerací dvou monomerů, akrylamidu a N’,N’-methylenbisakrylamidu.
SDS (dodecylsulfát sodný) se váže shodně na všechny bílkoviny
v poměru 1,4 g/1g bílkoviny a předává jim silný záporný náboj, vlastní náboj je poté zanedbatelný.
Používáme 5% koncentrační gel a separační gel 14 x 10,5 cm s gradientem 7,5 – 20,0 %.
Vertikální elektroforéza s aparaturou SE 600 (Hoefer Scientific Instruments) (Obr. 12) probíhá
v prostředí running bufferu, pH 8,3 v automatickém dvoukrokovém režimu 7-8 hodin. Dělení
proteinů probíhá paralelně ve dvou gelech, každý z nich pro 15 vzorků, jedním vzorkem je vždy
standard molekulových hmotností (Bio-Rad).
Gely jsou barveny stříbrem podle Kirkeby et al. (1993). K vyhodnocení elektroforetogramů
používáme videodensitometr GS-670 a software Molecular Analyst (Bio-Rad).
Obr. 11: Polyakrylamidový gel znázorňující vývoj
samic B. mori: S – standard; 1. - 9. den V. instaru; PR
– prepupa; Z, S, K – začátek, střed a konec stádia
kukly. Šipky ukazují na determinované nebo
nedeterminované (označené jako PF 1-7) proteiny
s uvedenou molekulovou hmotností.
Obr. 12: Aparatura pro vertikální elektroforézu včetně
densitometru.
Stanovení lysozymu v hemolymfě
Množství lysozymu lze stanovit in vitro radiální difúzí v agaróze. Metoda využívá Micrococcus
luteus (CCM 169), který patří k nejcitlivějším mikroorganismům rozpouštěným tímto enzymem.
Agaróza je rozpuštěna v Britt.-Robinsonově pufru (pH 7,0), dále je přidán Micrococcus luteus
(CCM 169), vše je povařeno a nalito na skleněné plotny. Ke kalibraci používáme roztok lysozymu
(E.C. 3.2.1.17, Sigma) o koncentraci 2, 5, 10, 15 a 20 mg/ml. Inkubace probíhá ve vlhké komůrce
za laboratorní teploty 24 hodin. Průměry projasněných difúzních zón (Obr. 13) se odečítají
měřítkem IDP – SEVAC. Množství lysozymu ve vzorku se poté přepočítá podle kalibrační křivky
na mg/ml vzorku.
Orientační srovnání některých vzorků obsahujících LSM:
Galleria mellonella VII. instar, hemolymfa: 5-8 mg/ml
Bombyx mori V. instar: 4-10 mg/ml
y = 6,4625x + 93,928
0
50
100
150
200
250
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
lysozym mg/ml
Kalibrace Lineární (Kalibrace)
Obr. 13: Agarózový gel obsahující Micrococcus luteus a difúzní zóny vytvořené
v gelu po aplikaci vzorku s LSM, vpravo kalibrační křivka.
Obr. 1: Bombyx mori Obr. 2: Galleria mellonella
Buněčná imunita – hemocyty
Nodulace – po injikaci cizorodého materiálu malých rozměrů do těla hmyzu jsou pod preparačním
mikroskopem pozorovatelné nodule (např. bakterie obklopené hemocyty) (Obr. 5). Reakce je
doprovázena melanizací (viz stanovení
fenoloxidázy).
Enkapsulace – cizorodý materiál
větších rozměrů jako jsou například
entomopatogenní hlístovky je
rozpoznáván hemocyty, které adherují
na jejich povrch a snaží se opouzdřit
parazita (Obr. 6) - vzniká částečná
nebo úplná kapsule. Obr. 5: Nodule po injikaci bakterií
v těle larvy G. mellonella.
Obr. 6: Hemocyty G. mellonella
adherující na povrch hlístice H.
bacteriophora.
Obr. 3: Hemocyty Galleria mellonella
s MSH – barvení Leukodifem.
Obr. 4: Granulocyty G. mellonella s MSH – barvení akridinovou oranží.
Fagocytóza je základní reakcí hemocytů – plasmatocytů a granulocytů. Ke kvantifikaci lze použít
MSH partikule, které se inkubují s hemocyty. Poté se vytvoří roztěr, který se barví komerčně
dodávanou sadou barviv – Leukodif. Vyhodnocení se provádí mikroskopicky – počítání
fagocytovaných partikulí uvnitř hemocytů (Obr. 3). K pozorování lze také použít vitální barvení
akridinovou oranží (Obr. 4).
Stanovení aktivity fenoloxidázy v hemolymfě
Enzym fenoloxidáza (PO) je hlavní součástí PO kaskády (Obr. 7). Jeho aktivitu lze stanovit
kolorimetricky po přidání substrátu 3,4-dihydroxyphenylalaninu (DOPA) (Goldsworthy et al., 2002),
který je fenoloxidázou přeměňován na barevné produkty – tvorba melaninu. Aktivitu PO lze ovlivnit
mnoha způsoby, např. použitím látek ze skupiny inhibitorů biosyntézy eikosanoidů.
Hemolymfa je odebírána do fosfátového pufru (pH
7,0) a centrifugována pro oddělení hemocytů. Nárůst
absorbance vzorků při 492 nm po přidání DOPA,
který je v prvních 30 minutách reakce lineární,
zaznamenáváme v určených časových intervalech
pomocí ELISA readeru Tecan Sunrise (Obr. 8). Z
hodnot vynesených do grafu (Obr. 9) získáme aktivitu
PO jako změnu absorbance za minutu, tento
výsledek ještě vztáhneme na jednotku množství
hemolymfy.
Obr. 7: Schéma PO kaskády – PO katalyzuje
oxidaci mono- a difenolů. Konečným produktem
reakce je pigment melanin (podle Cerenius &
Söderhäll, 2004).
Obr. 8: Destičkový spektrofotometr používaný pro
měření změn absorbance vzorků.
Obr. 9: Graf pro kolorimetrické stanovení PO - směrnice
přímky vyjadřuje aktivitu PO (ΔA429/min). Vložený obrázek:
levý sloupec – změna zbarvení vzorku způsobená
přeměnou DOPA až na melanin; pravý sloupec – přidání
fenylthiomočoviny zabraňuje melanizaci.
y = 0,0148x + 0,0167
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0 5 10 15 20 25 30
Čas (min)
A492
Luminometrické stanovení antibakteriální
aktivity hemolymfy
Metoda je založena na luminometrickém měření viability bioluminescenční
Escherichia coli – analogicky jako stanovení savčího komplementu podle
Nikoskelainen et al. (2002).
Používáme E. coli K12pGFPluxBAmp, u nichž během několika hodin
měříme inhibici růstu způsobenou vlivem různé koncentrace hemolymfy
(Obr. 10). Výsledky naznačují, že hemolymfa hmyzu má vysokou
antibakteriální aktivitu.
Je možné také odlišit podíl lysozymu (blokací pomocí SDS a jiných
inhibitorů) od ostatních antibakteriálních složek. Tuto metodu lze doplnit
standardním měřením antibakteriální aktivity pomocí zónové difúze za
použití E. coli (ATCC 25922) podle Hou et al. (2007).
0
500
1000
1500
2000
2500
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000
Čas (s)
Kontrola H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11
Obr. 10: Luminometr Immunotech LM O1T pro měření bioluminiscence E. coli. Vpravo graf
úbytku viability E. coli v čase: modře kontrola bez hemolymfy; H1-H11 vzorky o různé
koncentraci hemolymfy.
Modelové organismy
• většina analýz se provádí v odebrané hemolymfě, jako antikoagulant
a blokátor PO používáme fenylthiomočovinu (PTU)
• dále je možno pracovat s tukovým tělesem a středním střevem
zavíječ voskový Galleria mellonella (Lepidoptera, Pyralidae) (Obr. 2)
- stálý laboratorní chov na umělé potravě podle Haydaka (1936)
bourec morušový Bombyx mori (Lepidoptera, Bombycidae) (Obr. 1)
- chov sezónně, krmení morušovým listím
• Cerenius L. & Söderhäll K.: Immunological Reviews, 198, 116-126, 2004.
• Goldsworthy G., Opoku-Ware K. & Mullen L.: Journal of Insect Physiology, 48, 601-608, 2002.
• Haydak M. H.: Journal of Economic Entomology, 29, 1026, 1936.
• Hou L., Shi Y., Zhai P. & Le G.: Journal of Ethnopharmacology, 111, 227-231, 2007.
• Kirkeby S., Moe D. & Bog-Hansen T. C.: Electrophoresis, 14, 51-55, 1993.
• Laemmli, U. K.: Nature, 227, 680-685, 1970.
• Nikoskelainen S., Bylund G. & Lilius E. M.: Developmental and Comparative Immunology, 28, 581-592, 2004.
Literatura