Obr.: Agarózový gel obsahující Micrococcus luteus a difúzní zóny vytvořené v gelu po
aplikaci vzorku s LSM.
Stanovení obsahu lysozymu v kožním mukusu ryb
Množství lysozymu lze stanovenovit in vitro radiální difúzí v agaróze. Metoda
využívá Micrococcus luteus (CCM 169), který patří k nejcitlivějším
mikroorganismům rozpouštěným tímto enzymem. Agaróza je ropuštěna v Britt.Robinsonově
pufru (pH 7,0), dále je přidán Micrococcus luteus (CCM 169), vše je
povařeno a nalito na skleněné nebo plastové plotny. Ke kalibraci se používá roztok
lysozymu (E.C. 3.2.1.17, Sigma) o množství 2, 5, 10, 15 a 20 mg/ml. Inkubace
probíhá ve vlhké komůrce za laboratorní teploty 24 hodin. Průměry projasněných
difúzních zón se odečítajíměřítkem IDP – SEVAC. Množství lysozymu ve vzorku
se přepočítá podle kalibrační křivky na mg/ml vzorku.
Orientační srovnání některých vzorků
obsahujících LSM:
lidské sliny 0,1-0,5 mg/ml
lidské slzy cca 6 mg/ml
kožní mukus Leuciscus 8-15 mg/ml
kožní mukus Gobio 5-7 mg/ml
kožní mukus Cyprinus 0-2 mg/ml
y = 53,084x + 7,804
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 0,5 1 1,5 2
lysozym mg/ml
průměrdifúznízóny/
2
kalibrace Lineární (kalibrace)
Luminiscenční analýza oxidativního vzplanutí fagocytů v plné rybí krvi
Heparinizovaná krev je po naředění v HBSS smíchána s luminolem a aktivátorem (OZP opsonizovaný
zymozan). Prostřednictvím opsoninů navázaných na zymosanové částice se
OZP váže na komplementové a imunoglobulinové receptory fagocytů. Tím spouští signální
dráhu vedoucí k aktivaci proteinkinasy C, která katalyzuje fosforylaci endogenních proteinů
a následnou aktivaci NADPH-oxidasy, klíčového enzymu respiračního vzplanutí. Aktivita
plné krve se měří do dvou hodin po odběru. Luminolem zesílená luminiscence je
analyzována v mikrotitračních destičkách v luminometru při 20-25°C. Kinetika
luminiscenční odpovědi každého vzorku je sledována po dobu maximálně 60 min.
Nejdůležitějšími ukazateli oxidativního vzplanutí fagocytů jsou vrchol luminiscenční
odpovědi, čas jeho dosažení a celkové vyprodukované množství reaktivních metabolitů
kyslíku (integrál plochy pod naměřenou křivkou). Spontánní respirační vzplanutí fagocytů
bývá obvykle na úrovni pozadí luminometru.
Obr.: Typická křivka oxidačního vzplanutí fagocytů (délka měření 3600s), luminometr a
mikrotitrační destička se vzorky.
Odběry vzorků:
- krev je rybám odebírána z kaudální vény
- pro experimenty se používá plná heparinizovaná (50 U/ml) krev
- nebo je zpracovaná na plasmu / sérum
Hematologické parametry:
- krevní diferenciál
- počet erytrocytů a leukocytů
- hematokrit a leukokrit (Svobodová et al., 1986)
Literatura:
Hakkila K., Maksimow M., Karp M., Virta M.: Reporter genes lucFF, luxCDABE, gpf and dsred have different characteristics in whole-cell bacterial sensors. Analytical
Biochemistry, 301, 235-242, 2002.
Nikoskelainen S., Lehtinen J., Lilius E-M.: Bacteriolytic activity of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) complement. Developmental and Comparative Immunology, 26, 797–
804, 2002.
Svobodová Z., Pravda D., Paláčková J. (1986): Jednotné hematologické metody hematologického vyšetřování ryb. Vodňany: Edice Metodik: 36.
Toman a kolektiv: Veterinární imunologie. Grada, Praha, 2000.
Stanovení bakteriolytické aktivity komplementu v séru ryb
Tato luminiscenční metoda založená na principu bioluminiscence využívá
rekombinantní bakteriální kmen Escherichia coli (K12pGFPluxBAmp), jehož
plasmid obsahuje gen pro enzym luciferázu a její substrát aldehyd (Nikoskelainen
et al.,2002). Světelná emise je výsledkem následující reakce (Hakkila et al., 2002):
FMNH2 + O2 +RCHO ↔ FMN + RCOOH + H2O + světlo (490 nm),
která je katalyzována enzymem luciferázou a vyžaduje přítomnost ATP, ten je
produkován pouze živými buňkami. Intenzita produkovaného světla odpovídá
viabilitě bakterií. Kinetika reakce je měřena po dobu 3 hodin v laboratorní teplotě.
Z grafu znázorňujícího závislost luminiscence na čase je odečtena doba potřebná
pro usmrcení 50% bakterií. Tato hodnota je použita jako parametr pro srovnání
aktivity komplementu jednotlivých vzorků rybího séra (popř. plasmy) o stejné
koncentraci.
Hodnocení výsledků:
Na ukázkovém grafu byla nejvyšší aktivita komplementu u kapra č. 3 (2592
sekund), nižší u kapra č. 2 (4284 sekund) a nejnižší u kapra č. 1 (6012 sekund).
Obr.: Graf závislosti luminiscence (tj. viability bakterií) na čase. Červenená křivka –
kontrola viability bakterií. Mikrotitrační destička s nanesenými vzorky (triplikáty).
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2 1711 3420 5130 6840 8550 10259 11969 13678
Čas (s)
Luminescence(RLU)
Kapr 1 Kapr 2 Kapr 3 Kontrola
BUNĚČNÁ IMUNITA
Fagocyty - fagocytóza, oxidativní vzplanutí → luminiscenční
metoda
- monocyty
- makrofágy
- neutrofily
- retikulární buňky
Cytotoxické buňky – obdoba savčích NK buněk
T lymfocyty
B lymfocyty – produkce specifických protilátek IgM
NESPECIFICKÁ
SPECIFICKÁ
HUMORÁLNÍ IMUNITA
Lektiny
C-reaktivní protein
Lytické enzymy – např. lysozym → difúzní metoda
Komplement – bakteriolytická aktivita → luminiscenční metoda
Protilátky – pouze třída IgM (tetramer) → metoda ELISA
NESPECIFICKÁ
SPECIFICKÁ
Obr. 1: ELISA reader,
96-jamková destička.
Obr. 2: Zjednodušené schéma EIA
testu, vyhodnocení EIA testu.
Obr. 3: Standardní
ELISA test.
Stanovení IgM z rybího séra/plasmy pomocí ELISA metody:
Ke stanovení imunoglobulinů ze séra či plazmy se využívá turbidimetrická nebo ELISA
metoda, v případě ELISA metody se využívá dvou základních vlastností rybího IgM vaznosti
k povrchu umělých hmot a schopnosti nést na svém povrchu enzymy umožňující
jejich obarvení. Metoda využívající tyto vlastnosti se nazývá ELISA (Enzyme-LinkedImmunoSorbent
Assay). Při standardním (,,sandwich“) ELISA testu je použita 96-jamková
destička, na kterou je navázána neznačená monoklonální anti-rybí IgM (nejčastěji myší či
králičí IgG2b). Po navázání anti IgM na stěny jamek je zbytek povrchu jamek vysycen
sušeným mlékem – pro zablokování nespecificky navázaných shluků imunoglobulinů. Poté
je napipetováno sérum/plasma o potřebné koncentraci. Nyní je do všech jamek přidána
druhá monoklonální anti-rybí IgM značená křenovou peroxidázou. Na závěr je přidán
chromogen (např. OPD), který je oxidován kyslíkem produkovaným reakcí peroxidázy s
peroxidem vodíku a mění barvu na žlutou až oranžovou. Po vyvinutí reakce je přidána 2M
H2SO4, která reakci zastaví a celá destička je změřena na ELISA readeru při vlnové délce
450 nm (obr. 1). Existují i další typy ELISA testů, např. kompetitivní. Tato se pak liší hlavně
ve složení tzv. ,,sendviče“ (obr. 3) v jamkách destičky. Kompetitivní ELISA se dá využít
také při stanovení koncentrace hormonů v krvi ryb, např. 11-ketotestosteronu. V takovém
případě mluvíme o kompetitivním EIA testu (Enzyme Immunoassay, obr. 2).
Upraveno podle: http://www.caymanchem.com http://www.interferonsource.com
Imunitní systém ryb
Imunologie ryb
Ústav experimentální biologie, Oddělení fyziologie a imunologie živočichů, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Kotlářská 2, Brno 61137, Česká republika
www.sci.muni.cz/ofiz
Imunitní orgány ryb
(Toman et al., 2000).
Cyprinus carpio
http://www.naturfoto.cz/kapr-obecny-fotografie-1073.html