uchovaní genetických zdroju 12. definice, metody, použití Jaroslava Dubová ^Z^^ I MINISTERSTVO ŠKOLSTVÍ, EVROPSKÁ UNIE k^^m I mládeže a tělovýc OP Vzdělávání mládeže a tělovýchovy pro konkurenceschopnost Ittl INVESTICE DO ROZVOJE VZDELÁVANÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky Uchovaní genetických zdroju ztráta genetických zdroju je nenahraditelná uchováváme: • původní rostlinné druhy - výskyt v přirozených ekosystémech - jejich ohrožení je určeno podle míry ohrožení těchto ekosystému vyšlechtěné kultivary - udržovací šlechtění je pracné a nákladné Uchovaní genetických zdroju uchovaní semen = nej běžnější a nejstarši metoda uchování vegetativních orgánu - hlízy, kořeny, cibule, řízky (rizika akumulace viru a jiných patogenu) ucnovani genetických zdroju: A. semena uchování semen klasicky = při normální teplotě (max. 1 - 5 let) semenné banky = uchování semen na delší dobu ( při - 20°C) ortodoxní semena - přežívají snížení obsahu vody na 5-10% rekalcitrantní semena - dehydratace nesmí klesnout pod limit 12 -30% ' ^> nelze skladovat pod 0°C, tropické druhy pod 10°C (kávovník, kakaovník, kokosová palma, kaučukovník, z našich: dub, buk, jírovec, kaštanovník) Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i. Praha - Ruzyně . založen v roce 1951 . Odbor genetiky a šlechtění - Genová banka - zajištění hodnocení, konzervace a využívání genofondu rostlin v ČR „Národní program konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin a agrobiodiversity" http://www.vurv.cz/index.php?p=odbor_genetiky_slechteniásite=vyzkum Semenná banka v Botanické zahradě v Semenná banka na Špicberkách zdroju Uchovaní genetických B. vegetativní orgány uchovávání vegetativních orgánu (hlízy, kořeny, cibule, řízky) rizika: • choroby (houbové, virózy) škůdci nepříznivé podmínky (teplota, vlhkost...) pracné a nákladné (prostory, manipulace) Genové banky in vitro uchování aktivně rostoucích kultur uchování kultur v minimálním růstu kryoprezervace Uchovaní aktivně rostoucích kultur - pracné - pasáže: dny, týdny, měsíc - nákladné (energie, prostory) - nebezpečí infekce - nebezpečí somaklonální variability představují paralelu ke klasické polní bance hledaly se podmínky pro prodloužení subkultivačního intervalu Uchovaní kultur v minimálním růstu metody založené na kultivaci při snížené teplotě rostliny z mírného pásma: 20 - 25° C 4 - 10°C rostliny z tropu: 20°C 25 - 30°C 15 - • metody založené na modifikaci složení kultivačního média - snížení koncentrace solí (MS1/2 - MS1/4), přídavek osmotika - 3% manitol, 5% sacharóza, ABA • metody založené na modifikaci plynného složení atmosféry v kultivačních nádobách Uchovaní kultur v minimálním růstu Výhody: možnost vizuální kontroly testování na patogeny - možnost mezinárodní výměny menší nároky na prostor (2m2 x 1 ha) Problémy: stres muže mít vliv na regenerační schopnost muže být ovlivněna genetická stabilita - nutnost kontrol (kritéria morfologická, cytologická, biochemická, molekulárně-biologická = DNA) So lanům, Med i c ago, Fragaria, Prunus, Malus, Beta • uchovaní materiálu při nízkých teplotách, nejčastěji v tekutém dusíku (-196°C) (P. Ďebergh) • neletální skladování pletiv nebo tkání při ultra-nízkých teplotách (E. E. Benson) uchovaní rostlinného materiálu po delší dobu za účelem ■ minimalizace růstu a vývoje in vitro ■ uchování životaschopnosti a genetické stability ■ zachování plného vývojového a funkčního potenciálu ■ šetření pracnosti a nákladu Mechanismy kryo-poškození tvorba ledu ■ extracelulární - začíná dříve ■ intracelulární (nukleace) - velké ledové krystaly poškozují struktury organel = snaha o zmenšení velikosti krystalu ledu vlivy poškození různými roztoky Přístupy ke kryoprezervaci tradiční = aplikace chemických kryoprotektiv a kontrolované, pomalé zmrazování 0,5 - 1°C/ min (vyžaduje speciální přístroje) novější = rychlé zmrazování vitrifikace enkapsu I ace/de hydr atace (relativně dostupnější) • penetrující - ovlivňují biochemické a strukturální vlastnosti membrán a tak zvyšují toleranci k mrazu (ĎMSO, glycerol, prolin) • nepenetrující - mají vliv většinou jako osmoticky dehydratační (sacharóza, manitol, sorbitol) Krátkodobé skladovaní dospělých řízku révy Vitis vinifera odebírání řízků v zimě skladovaní při -3°C = řízky rašily až po 1,5 roce hodnocení tolerance kryoexpozice meristémů vybraných linií z axenických kultur vývoj metod pro dlouhodobé uchování genetických zdrojů révy http://www.ars-grin.gov/ncgrp/pi_research_extra_projects.htm#grapepres Pomalé kontrolované zmrazovaní • aplikace chemických kryoprotektiv • postupné kontrolované ochlazování pod bod mrazu (-30 až -60°C), pak vložení do tekutého dusíku - pomalé ochlazování zvyšuje dehydrataci buněk, což snižuje bod mrznutí - po zkoncentrování buněčných roztoku pomalým ochlazováním muže být zbývající voda vitrif ikována rychlým zmrazením • zpětné rozmrazování má být co nejrychlejší ukládání vzorků do tekutého N2 Prístroj KryolO pro klasickou kryoprezervaci Průběh zmrazování vzorku kalusu t/°c/ netěsnosti ventilu při napouštění N2 h+ h+ h+ i -i + «■*+ hhiJiiiin^i 50 63 teplota uvnitř ampule teplota uvnitř chlazeného prostoru 70 ■----- ampule do N2 proces velmi rychlého zmrazení, při kterém je zabráněno tvorbě ledových krystalu, protože vodný roztok je příliš koncentrovaný = zabránění nukleace ledových krystalu voda tuhne do tzv. sklovitého amorfního tvaru negativně muže působit na životaschopnost materiálu vysoká koncentrace kryoprotektiv, která je nutná pro navození vitrif ikace vitrif ikace = nestabilní stav - muže vést při zahřívání k tvorbě krystalu Postup: „Enkapsulace / dehydratace" otužení materiálu - zvýšená osmotická hodnota média, snížená teplota kultivace izolace meristému enkapsulace: přenos do 3% alginátu nasátí alginátu s meristémem do špičky pipety nakapání alginátu do 0,1 M roztoku CaC\2 polymerace alginátu 30 min. dehydratace: osmotická (0,75M sacharóza) 1-5 dní osušení ve sterilním vzduchu flow-boxu 1-4 hod přenos vysušených kuliček do kryozkumavky rychlé zmražení - vhození do N2 J Alginátová perla s vyrostajícími prýty -i brambor (Solanum tuberosum cv. Kera) z enkapsulovaného meristému 13 ] Alginátové perly s vyrostajícími prýty brambor -i (Solanum tuberosum) z enkapsulovaných meristémů Příklady využití kryoprezervace meristému Německá sbírka mikroorganismu a buněčných kultur (ĎSMZ, Braunschweig, Německo) - meristémy 519 starých kultivaru brambor - metoda mrazení perel International Potato Centre (CIP, Lima, Peru) - 345 kultivaru brambor - vitrifikace K.U. Leuven, Belgie - 306 kultivaru banánu (1/4 ze světového počtu kultivaru) - vitrif ikace kasava, česnek, máta a australské ohrožené druhy Odbor genetiky a šlechtění - Fyziologie a kryobiologie - studium vlivu nízkých a ultra-nízkých teplot na rostliny pro rozvoj metod kryoprezervace a využití těchto metod při uchovaní vybraných genotypu s požadovanými vlastnostmi při ultra-nízkých teplotách a pro eliminaci vybraných patogenů rostlin. Problematika kryobiologie je studována pomocí biotechnologických postupu s využitím technik in vitro a ex vitro. Používaní metody kryoprezervace v Kew Medusagyne oppositifolia Paralophia epiphytica Pteris adscension http://www.kew.org/ksheets/pdfs/ K31_cryopreservation.pdf http: //scieng. abcrtay. ac. uk/plant/genebanking. htm http: //www. ars. usda. gov/Main/docs. htm?docid=8100 http: //www. ars -gr in. gov/ncgrp/volk_lab. htm http: //www. kcw. org/kshccts/pdf s/K3 l_cryopreservation. pdf histórie semenné banky na Sval bardu: http: //www. regjer ingen. no/en/dep/lmd/campain/svalbard -global -seed - vau I t/h istory. htm I ? id=489075 . Benson E.E., Betsou F., Fuller B.J., Harding K et Kofanova O. (2013): Translating Cryobiology Principles into Trans-disciplinary Storage Guidlines for Biorepositories and Biobanks: A Concept Paper. - CryoLetters 34/3: 277 - 312. . Teixeira A.S., Faltus M., Zámečník J., Gonzalez-Benito M.E., Molina-García A.Ď. (2014): Glass Transition and Heat Capacity Behaviors of Plant Vitrification Solutions. Thermochimica Acta 593, 43-49, doi:/10.1016/j.tca.2014.08.015)