ÚVODNÍ POZNÁMKY k přednášce Bi4060 FYZIOLOGIE ROSTLIN Fyziologie rostlin je nauka o procesech či funkcích, které probíhají v rostlinách a zajišťují jejich přežívání a reprodukci. Právě tyto procesy, rozvinuté v průběhu evoluce u autotrofních rostlin do jedinečné podoby, umožňují velmi efektivně přeměňovat energii slunečního záření na energii chemickou, využívat ji k syntéze obrovského množství energeticky bohatých organických látek ze zcela jednoduchých anorganických sloučenin uhlíku, dusíku a dalších biogenních prvků. Tyto suroviny pro svoji syntetickou činnost jsou schopny si opatřovat i z velmi omezených a těžko dostupných zdrojů v půdním prostředí. Rostliny mají proto naprosto prvořadé postavení ve všech terestrických ekosystémech - na jimi produkované biomase je bezprostředně závislá existence ostatních (heterotrofních) organismů včetně člověka. Poznatky o procesech probíhajících v rostlinách, shromažďované v oboru fyziologie rostlin mají tudíž dalekosáhlý význam jak pro pochopení a predikci změn probíhajících v přírodních ekosystémech, tak i pro další racionalizaci a intenzifikaci zemědělské výroby, která je nutná pro zajištění dostatku potravin pro stále rostoucí počet obyvatel naší Země. I přes tyto obecně známé skutečnosti jsou rostliny, ve srovnání s živočichy, značně přehlíženou skupinou organismů, a to nejen laiky, ale i mnoha studenty se zájmem o biologii. Je to dáno nejen jejich zvláštní stavbou, přisedlým způsobem života a zdánlivou neschopností komunikovat s okolím, ale i jejich masovým výskytem v přírodě, kde vytvářejí jakýsi trvalý krajinný rámec, u lidských obydlí zase plní funkci jakýchsi pomalu se měnících dekoračních předmětů. Až teprve při bližším náhledu do vnitřního života rostlin s údivem zjišťujeme, že ta jejich "cizorodost" není zas tak velká - vždyť celá řada základních životních funkcí na buněčné úrovni probíhá u rostlin vcelku shodným způsobem jako v našem těle a jsou do nich zapojeny zcela shodné enzymy a metabolity. Mají ale ještě ve své výbavě řadu věcí navíc například složité metabolické komplexy pro asimilaci anorganických forem uhlíku a dusíku. Pravda, na druhé straně nemají nervovou soustavu - to ale vůbec neznamená, že by neměly jiné, alternativní systémy pro vnímání a přenos signálů i na dlouhé vzdálenosti, schopnost velmi jemně koordinovat aktivity všech svých orgánů a provádět složité rozhodovací procesy směřující k optimalizaci svých funkcí pod vlivem náhlých změn vnějšího prostředí. A také k přežití i za krajně nepříznivých podmínek na svých stanovištích, ze kterých na rozdíl od živočichů nemohou uniknout do příjemnější skrýše. K bližšímu pochopení vnitřního života rostlin, a snad i k probuzení jistého zájmu o jeho další pozorování i po ukončení studia, by právě měly přispět přednášky z fyziologie rostlin. Není to ale jednoduchý úkol. Během dlouhého vývoje, kterým obor fyziologie rostlin prošel, rozrostl se v mimořádně rozsáhlou vědní disciplínu s řadou samostatně se rozvíjejících podoborů (např. fyziologie fotosyntézy, fyziologie minerální výživy, fyziologie růstu a vývoje, stresová fyziologie, aj.), přičemž každý z těchto směrů má vlastní okruh specializovaných odborných časopisů, knih a vědeckých konferencí. A také každý z nich by k uspokojivému představení vyžadoval samostatný přednáškový cyklus. Při studiu a výuce problematiky procesů v rostlinách se navíc neobejdeme bez znalosti a vhodné aplikace moderních poznatků z jiných oborů, zejména z biofyziky, biochemie a z molekulární biologie. Přitom ale je stále nutné neztrácet ze zřetele, že konečným cílem a nezastupitelnou úlohou oboru fyziologie rostlin by mělo být uspokojivé vysvětlení chování rostliny jako celku (tedy komplexního biologického systému na úrovni individua), a to nejlépe formou kvantitativního popisu všech jeho dílčích složek, vzájemných vazeb a regulačních mechanismů. K naplnění tohoto cíle však máme bohužel ještě daleko. V této souvislosti je potřeba uvést, že v současné době je největší úsilí (měřeno počtem vědeckých pracovníků, projektů a publikací) soustředěno na stále hlubší analýzu mechanismu (hlavně na buněčné úrovni) některých dílčích fyziologických procesů v rostlinách. Především díky masivní aplikaci molekulárně biologických metod se daří získávat obdivuhodné výsledky, zcela zásadně důležité pro pochopení určitých funkčních komplexů. Bohužel jsou to stále jen drobné, byť velmi cenné fragmenty celkového obrazu fungování rostliny. Pro jejich žádoucí syntetickou interpretaci, spočívající ve správném zasazení do složité mozaiky systémových vazeb, je nutné mít znalostí o obecných principech chování rostlin na vyšších organizačních úrovních (orgánové, organismové). Ty lze získávat i vhodně volenými experimenty na těchto úrovních. Pouhá pozorování chování rostlin za měnících se podmínek prostředí či v průběhu ontogeneze mohou být sice inspirativní, ale nemohou sloužit ke stanovení skutečně příčinných (kauzálních) vazeb. Semestrální přednáška Bi4060 pro studenty biologických oborů na přírodovědecké fakultě Masarykovy univerzity v Brně je koncipovaná s cílem podat vyvážený přehled všech významných oblastí oboru fyziologie rostlin. Zahrnuje tedy: a) transportní procesy (příjem a transport vody, rozpuštěných látek a plynů), b) metabolické procesy (fotosyntéza, respirace) a minerální výživa, c) růstové a vývojové procesy, d) stresové procesy a biotické interakce. K těmto částem přednášek budou postupně dávány na IS i odpovídající čtyři části aktualizovaných učebních textů s kontrolními otázkami. Tyto texty lze považovat za jistý minimální souhrn znalostí, který by si měl student z přednášek odnést. Je nutno důrazně upozornit, že studium těchto učebních textů nemůže plně nahradit návštěvu vlastních přednášek, ve kterých jsou jednotlivá témata rozebíraná detailněji a s bohatší názornou dokumentací (obrázky, grafy, schémata, animace). K hlubšímu studiu lze doporučit zejména následující učebnice: Procházka, S. et al. (1998): Fyziologie rostlin.- Jediná novější česká učebnice, v rozsahu a členění jednotlivých kapitol se sice poněkud liší od přednášky, ale obsahuje řadu doplňujících materiálů. Teiz, L., Zeiger, E. (1998): Plant Physiology.- Asi nejlepší (americká) učebnice klasického typu s vyváženým obsahem a členěním podobným přednášce. Obsahuje velmi detailní informace a obrázky, velmi vhodně doplňující přednášku. Lze si ji vypůjčit ve fakultní ústřední knihovně. Buchanan, B. B., Gruissem, W., Jones, R. L. (2000): Biochemistry and Molecular Biology of Plants.- Špičková americká učebnice obsahující (kromě jiného) i velmi detailní a bohatě ilustrovaný výklad některých témat „klasické“ fyziologie rostlin, které budou probírány na přednášce. Vřele doporučuji ke shlédnutí internetové stránky http://5e.plantphys.net/ , na kterých je systematicky prezentováno velké množstvím zajímavých doplňků k novému vydání shora uvedené učebnice (Teiz, L., Zeiger, E. (2010): Plant Physiology). Zkouška z předmětu Bi4060 bude prováděna na konci semestru formou písemného testu, v případě potřeby doplněného ústním zkoušením. Kladené otázky budou rovnoměrně pokrývat všechny hlavní části probrané látky. Při zkoušce budou vyžadovány znalosti svým rozsahem a mírou podrobností odpovídající látce vysvětlené na přednáškách. V Brně dne 15. února 2012. Jan Gloser. Učební text k přednášce Bi4060 na přírodovědecké fakultě MU v Brně. Určeno pouze ke studijním účelům. Autor textu Jan Gloser. 1. ČÁST - TRANSPORTNÍ PROCESY Předkové dnešních rostlin žijící v pravěkých mořích postupně získali velmi dobrou funkční výbavu k fotoautotrofnímu způsobu života, ovšem k pobytu mimo vodní prostředí to zdaleka nepostačovalo. Jejich další vývoj, vrcholící úspěšnou kolonizací všech kontinentů, byl záležitostí neobyčejně složitou a dlouhodobou. V prvé řadě bylo potřeba získat dostatečnou schopnost vzdorovat stále hrozícímu nedostatku vody: buď tolerovat její velkou ztrátu v buňkách a obnovovat veškeré funkce i po téměř úplném vyschnutí, nebo umět lépe s nedostatkovou vodou hospodařit. To znamenalo především osvojit si způsob jejího získávání v hlubších vrstvách půdy specializovanými orgány, rychle ji přivádět do nadzemních částí, a účinně omezit její ztráty. Nemenší problémy měly první terestrické rostliny i se získáváním minerálních živin. Difuse jakožto převažující transportní mechanismus u vodních rostlin nebyl zdaleka schopen zabezpečit potřeby nových obyvatel souše. Postupné strukturní změny umožňující dálkový transport vody a rozpuštěných látek cévními svazky, syntéza nových materiálů zvyšujících mechanickou pevnost a odolnost rozměrnějších těl (lignin a některé další sekundární metabolity), či dokonalá regulace výměny plynů pomocí kutikuly a průduchů na povrchu listů - to všechno mělo obrovský dopad na zrychlení a dlouhodobou stabilitu fotosyntetických procesů a s nimi spojenou rychlost růstu. Transportní procesy u evolučně vyspělejších cévnatých rostlin jsou v mnoha ohledech komplikovanější než u živočichů. Už proto, že toky transportovaných látek, zejména vody a CO2 mezi rostlinou a jejím okolím, jsou mnohem větší (vztaženo např. na jednotku biomasy), a také proto, že jsou uskutečňovány současně ve dvou zcela odlišných typech prostředí (půda – atmosféra). U rostlin je na rychlém vnitřním transportu roztoků také závislé šíření regulačních signálů, neboť ty jsou převážně chemické, nikoli elektrické povahy. Přitom rostliny nemají k dispozici žádnou mechanickou „pumpu“, která by uváděla transportované látky do pohybu. To vše je dobrým důvodem k tomu, abychom se seznámili alespoň se základními principy, na kterých je založena jednak výměna látek mezi rostlinou a jejím okolím, a také mezibuněčné a meziorgánové přesuny životně důležitých sloučenin. TRANSPORTNÍ PROCESY 1 TRANSPORTNÍ PROCESY 2 Příjem a transport vody Voda je základní složkou všech živých rostlin, nutnou pro udržení jejich struktury i funkcí. Naprostá většina transportních procesů v rostlinách se odehrává ve vodných roztocích, stejně tak všechny biochemické reakce. Voda v těle rostlin není dlouhodobě zadržována, ale neustále odchází ve formě vodní páry do atmosféry. Za průměrného letního dne dosahuje množství přijaté a opět vydané vody několikanásobku celkového obsahu vody ve všech orgánech. Suchozemské rostliny jsou totiž obvykle vystaveny silně "výparným" podmínkám, tedy vzduchu se značným deficitem vodní páry. Přitom nemohou mít povrch svých orgánů neprodyšně uzavřený, neboť potřebují přijímat ze vzduchu životně důležitý oxid uhličitý. Schopnost tolerovat větší ztráty vody má jen poměrně malá skupina poikilohydrických rostlin (např. lišejníky a některé mechy). Naprostá většina ostatních (které se označují jako homoiohydrické) musí stále udržovat obsah vody v pletivech na vysokých hodnotách. Již při ztrátě asi poloviny z celkového obsahu vody (při plném nasycení) jsou tyto rostliny nevratně poškozeny a hynou. Proto také zabezpečení rychlého příjmu a transportu vody i regulace jejího výdeje patří mezi prioritní fyziologické funkce rostlin. Chemický potenciál vody - základní vztahy Správné pochopení podstaty a průběhu transportních procesů v rostlinách je možné pouze tehdy, máme-li alespoň základní znalosti o energetice fyzikálně-chemických soustav a o obecných vlastnostech roztoků. Tato problematika je podrobně popsána v celé řadě běžně dostupných učebnic fyzikální chemie, kde v případě hlubšího zájmu lze najít příslušné informace. Připomeňme si jen několik těch skutečně nejdůležitějších principů. Samovolný tok vody mezi dvěma místy v rostlině může nastat pouze tehdy, jestliže voda na těchto místech má rozdílný chemický potenciál. Voda vždy proudí z místa o vyšším potenciálu do místa s potenciálem nižším (pochopitelně za předpokladu, že mezi těmito místy existuje spojení umožňující průtok). Toto základní pravidlo by nám však v praxi příliš nepomohlo, pokud bychom nebyli schopni posoudit, jaké okolnosti mohou měnit hodnotu chemického potenciálu vody v jednotlivých částech rostliny. Voda v rostlinách se obvykle nevyskytuje v čistém stavu, ale jako součást roztoků. Hodnota chemického potenciálu vody v roztoku závisí především na množství látek v ní rozpuštěných a dále na tlaku, kterému je v buňkách vystavena. Čím vyšší je vnitrobuněčný, hydrostatický tlak v buňkách (označovaný též jako turgorový tlak či turgor), tím vyšší hodnotu má i chemický potenciál vnitrobuněčné vody. S koncentrací rozpuštěných látek (solutu) naopak chemický potenciál vody klesá, neboť aktivita molekul vody je omezována interakcemi s molekulami solutu. Z dalších faktorů ovlivňujících za izotermálních podmínek chemický potenciál vody může přicházet v úvahu gravitace, ale pouze v případě transportu do větších výšek (viz str. 5). Elektrická složka chemického potenciálu se při transportu vody téměř neuplatňuje a proto ji můžeme při výpočtech zanedbat. Snížení chemického potenciálu vody vlivem rozpuštěných látek lze nejsnadněji odvodit ze snížení tlaku vodních par nad roztokem. Pokud se mezi vodou v kapalné a v plynné fázi ustaví rovnováha, pak i chemické potenciály obou fází musí být shodné. Pokles chemického potenciálu je snáze měřitelný u vody v plynné fázi, a sice ze snížení tlaku vodních par v nasyceném stavu (či z dalších charakteristik, které jsou na tomto tlaku přímo závislé, jako je např. hustota vodních par nebo relativní vlhkost vzduchu). Kromě přímého měření můžeme snížení tlaku vodních par také vypočítat z koncentrace roztoku vyjádřené molárním zlomkem vody. Podle Raoultova zákona musí být tlak nasycených vodních par nad roztokem (pv r ) roven součinu tlaku nasycených vodních par nad čistou vodou (pv o ) a molárního zlomku vody (Xv): pv r = pv o . Xv Hodnotu chemického potenciálu vody v roztoku (µv r , za všech ostatních podmínek ve standardním stavu) pak můžeme vypočítat ze vztahu: µv r = µv o + RT ln Xv µv o = chemický potenciál čisté vody (J mol-1 ), R = plynová konstanta (8,314 J mol-1 K-1 ), T = absolutní teplota (K). Je dobré snad připomenout, že chemický potenciál vody je hodnotou relativní (což ostatně platí o potenciálech obecně), udává tedy vždy jen rozdíl mezi energetickým stavem vody za aktuálních podmínek a za podmínek standardních. Hodnota µv o a příslušné standardní podmínky za kterých platí jsou věcí dohody. Snížení chemického potenciálu vody vlivem rozpuštěných látek lze odvodit také jiným způsobem, a sice z měření (či výpočtu) osmotického tlaku. Osmotický tlak je definován jako tlak, kterým musíme působit na roztok, abychom zabránili samovolnému pronikání molekul rozpouštědla, které je v čistém stavu odděleno od roztoku polopropustnou membránou. U roztoků, které nemáme uzavřené v takovéto měrné soustavě, vyjadřují hodnoty osmotického tlaku pouze jejich potenciální schopnost tento tlak za vhodných podmínek manifestovat. Proto se také někdy používá termín osmotický potenciál. Závislost osmotického tlaku (či osmotického potenciálu) na koncentraci roztoku, který je v kontaktu s čistou vodou, popsal na základě přímých měření van't Hoff: π = RT C i π = osmotický tlak (Pa) C = koncentrace vyjádřená molalitou roztoku (počet molů rozpuštěné látky na 1 kg vody), i = parametr zohledňující disociaci (ionizaci) molekul rozpuštěné látky a jiné odchylky od ideálního roztoku. TRANSPORTNÍ PROCESY 3 TRANSPORTNÍ PROCESY 4 Vodní potenciál a jeho dvě hlavní složky Chemický potenciál vyjadřujeme obvykle v jednotkách energie na jednotku množství látky, zatímco v biologických systémech jsou z řady důvodů praktičtější jednotky tlaku. Nejde jen o zmíněný a snadno měřitelný osmotický tlak. Aktivitu vody v rostlinách velice ovlivňuje i hydrostatický tlak a adhezní síly, také lépe měřitelné v tlakových jednotkách. Proto se v biologii častěji používají jako měřítko volné energie vody transformované hodnoty chemického potenciálu, označované jako vodní potenciál (Ψ): Vodní potenciál je chemický potenciál vody v systému vyjádřený v jednotkách tlaku a srovnávaný s chemickým potenciálem čisté vody za atmosférického tlaku a téže teploty. µv r - µv o Ψ = Vv Ψ = vodní potenciál (Pa) µv r = chemický potenciál vody v roztoku (obecně v systému), µv o = chemický potenciál čisté vody, Vv = molární objem vody (18.016 cm3 mol-1 ). Převedení na jednotky tlaku bylo umožněno vztažením rozdílu chemických potenciálů na objemovou jednotku (Vv). Mezi vodním potenciálem a chemickým potenciálem vody existuje prakticky lineární závislost, neboť molární objem vody je veličinou téměř konstantní. Je proto samozřejmě možné popisovat stejné děje v rostlinách jak hodnotami vodního potenciálu, tak i původního chemického potenciálu. Referenční hodnota chemického potenciálu čisté vody (µv o ), je pro výpočet vodního potenciálu konvenčně brána jako nulová (za atmosférického tlaku a téže teploty, jako má voda v systému), což zjednodušuje výpočty. Současně to ovšem znamená, že hodnoty vodního potenciálu v rostlinách jsou téměř vždy záporné. Pro vodní potenciál v rostlinách platí totéž, co již bylo řečeno na začátku této kapitoly ve spojitosti s chemickým potenciálem vody: je zvyšován působením hydrostatického tlaku (obvykle jde o turgorový tlak v buňkách), a naopak snižován vzrůstající koncentrací rozpuštěných látek. Vliv koncentrace lze na společné tlakové jednotky převést nejsnadněji pomocí osmotického tlaku (π), jak již bylo vysvětleno. Potom platí (zjednodušeně): Ψ = p - π Je důležité si uvědomit, že hydrostatický tlak (p) v tomto vztahu považujeme za nulový, pokud má stejnou hodnotu jako tlak vzduchu v okolní atmosféře (i když v absolutním měřítku nemá tlak vzduchu v atmosféře nulovou hodnotu, ale přibližně +0,1 MPa!). Pokud tedy tlak v buňkách poklesne na hodnotu tlaku vzduchu v okolí rostliny (např. při ztrátě turgoru za nedostatku vody, který se projeví vadnutím rostliny), pak vodní potenciál buněk bude číselně roven osmotickému tlaku (ovšem se záporným znaménkem). Pokud ovšem dojde ještě k většímu poklesu tlaku, a sice až pod hodnotu tlaku vzduchu v okolní atmosféře (což označujeme jako podtlak nebo též napětí), hodnota p pak bude záporná a to způsobí pokles vodního potenciálu pod hodnotu danou osmotickým tlakem. K tomu skutečně běžně dochází při transportu vody ve vodivých elementech xylému. Hodnoty koncentrační (osmotické) i tlakové složky vodního potenciálu se mohou v různých částech rostliny poměrně rychle měnit, a tudíž i jejich relativní významnost pro výsledný vodní potenciál může být různá. Dosti užitečné je vycházet z představy (i když poněkud zjednodušené) buňky jako osmotického systému, odděleného od apoplastového okolí polopropustnou plazmatickou membránou. V takovém případě musí dojít v ustáleném stavu k vyrovnání chemického potenciálu vody (vodního potenciálu) uvnitř buňky s chemickým potenciálem vody ve vnějším prostředí. Pokud tedy mají buňky ve svém okolí dostatek „čisté“ vody (mám teď na mysli vodu s minimálním obsahem solí, jaká obvykle bývá v apoplastu), pak i při velkém obsahu osmoticky aktivních látek ve vakuole či v cytosolu může vodní potenciál těchto buněk dosáhnout téměř maximální (nulové) hodnoty. Osmotickým příjmem vody se může uvnitř buněk zvýšit hydrostatický tlak natolik, že zcela kompenzuje negativní působení osmotické složky na snížení vodního potenciálu (p - π = 0). Při dostatečně pevných, téměř neroztažných buněčných stěnách (které jsou charakteristické právě jen pro rostlinné buňky), stačí k tomuto zvýšení hydrostatického tlaku příjem velmi malého množství vody. Ale také při velmi malé ztrátě vody rychle poklesá vodní potenciál. TRANSPORTNÍ PROCESY 5 TRANSPORTNÍ PROCESY 6 Další, méně významné složky vodního potenciálu Při transportu vody do velkých výšek, tedy především u stromů, se také uplatňuje vliv gravitace na celkovou hodnotu vodního potenciálu: voda (čistá či v roztoku) ve větší výšce než je referenční vzorek (téhož složení a za téhož tlaku) má vodní potenciál zvýšený o gravitační složku (g) . Platí tedy: Ψ = p - π + g Při transportu vody do výšky 10 metrů nad povrch půdy je hodnota vodního potenciálu této vody zvýšena přibližně o 0,1 MPa, při transportu do 100 m pak o 1 MPa.. Kromě tlakové, osmotické a gravitační složky vodního potenciálu se někdy uvádí ještě další, označovaná jako složka matriční, která způsobuje snížení vodního potenciálu při interakci molekul vody s povrchy pevných látek. Nejde však o principiálně novou sílu, spíše o smíšený projev osmotické a tlakové složky. V běžném vodním režimu rostliny má vcelku zanedbatelný význam. K matriční složce vodního potenciálu se například počítá snížení vodního potenciálu vazbou molekul vody na koloidní částice v půdě, na struktury uvnitř buňky (např. proteiny, membrány), a v buněčných stěnách (fibrily celulozy). Molekuly vody mohou vytvářet velmi tenké hydratační obaly kolem pevných částic, ve kterých jsou poutány silami o velikosti i několika desítek MPa. Pokud je ovšem přítomna také voda hydratačně nevázaná (což je vždy kromě případů extrémního vyschnutí), pak její vodní potenciál určuje celkový vodní potenciál v příslušné struktuře. Vazba vody v buněčných stěnách, zahrnovaná též do matričního potenciálu, může být i jiného charakteru. Jde o vodu poutanou kapilárními silami (o kterých se ještě zmíním později) v jemných pórech těchto stěn. Vlivem adheze molekul vody k pevným stěnám pórů (tedy v podstatě kapilár), dochází ke snížení hydrostatického tlaku ve vodním sloupečku pod úrovní menisku. Proto lze její vliv na snížení vodního potenciálu v buněčné stěně zahrnout do tlakové složky (p). Tlakový rozdíl způsobený kapilárními silami ve vysychajících buněčných stěnách (i u mrtvých buněk, např. dřeva) může dosáhnout opět řádově desítky MPa. Prakticky se projevuje zejména při botnání dřeva a suchých semen (imbiční síly). Pomocí hodnot vodního potenciálu (Ψ) můžeme poměrně jednoduchým způsobem kvantifikovat termodynamický stav vody nejen v rostlině, ale i v jejím okolí. To má zvlášť velký význam pro ekologickou fyziologii, která studuje interakce rostlin s prostředím. Při studiu vodního režimu rostlin se obvykle snažíme o kvantifikaci celého toku vody z půdy přes rostlinu do atmosféry. Voda protéká tímto jen v tom případě, pokud existuje stálý rozdíl mezi hodnotami Ψ půdní vody v okolí kořenů (kde musí být nejvyšší), Ψ vody v orgánech rostliny (postupně klesající od kořenů k listům) a Ψ vody ve vzduchu v okolí listů (nejnižší, viz obrázek na str. 12). Hodnoty Ψ půdy jsou za příznivých vlhkostních podmínek velmi vysoké (blízké nule), neboť koncentrace solí v půdním roztoku je velmi malá a tlaková složka se zde prakticky neuplatňuje - vzduch v půdních pórech má stejný tlak, jaký je v okolní atmosféře. Naopak vodní potenciál vzduchu v okolí nadzemních částí rostlin bývá v denních hodinách velice nízký. Jeho hodnotu lze vypočítat z naměřené relativní vlhkosti vzduchu (w, vyjádřené desetinným zlomkem v logaritmickém tvaru) a teploty (T, v Kelvinech), protože poměr mezi plynovou konstantou (R) a molárním objemem vody(Vv) je téměř stálý: RT Ψ (MPa)= Vv ln w = 0,4618 . T . ln w Je-li tedy např. relativní vlhkost vzduchu 0,5 (tedy 50%, což je běžné) a teplota vzduchu 20 oC (= 293,15 K), pak Ψ = -93,8 MPa. V nočních hodinách však často bývá vzduch nasycen vodní parou (100% relativní vlhkost spojená s výskytem rosy) - v tom případě Ψ vzduchu se radikálně zvýší (viz tabulka na následující straně) na hodnotu blízkou nule a tok vody celým systémem se zastaví. Příklady hodnot vodního potenciálu (vše v MPa). 1 M roztok glukózy -2,5 1 M roztok NaCl -4,4 vlhká půda -0,01 až -0,05 půda vyschlá k bodu trvalého vadnutí -1,5 kořeny -0,1 až -1,5 listy (v průběhu dne, bez plné turgescence) -0,2 až -2,0 vzduch při relativní vlhkosti 100 % vzduch při relativní vlhkosti 98 % vzduch při relativní vlhkosti 70% -0,0 -2,7 -48,3 Příjem vody kořeny a radiální transport Kořeny jsou hlavním místem vstupu vody z vnějšího prostředí do rostliny. Nejaktivnější zóna příjmu vody u mladých kořenů leží asi 10 až 50 mm od kořenové špičky, tedy tam, kde obvykle dochází k největší tvorbě kořenových vlásků. V této části kořene bývají již dokonale vyvinuty vodivé elementy xylému. U starších částí kořene sorpční aktivita klesá, hlavně v důsledku suberinizace (zkorkovatění) jejich povrchových pletiv. Avšak i u těchto kořenů je obvykle příjem vody měřitelný a vzhledem k jejich ploše i dosti významný. Kořenové vlásky jsou modifikované epidermální buňky, ale jejich schopnost přijímat vodu pro vodu (vztaženo na jednotku povrchu) není o nic větší než u ostatních epidermálních buněk. Výrazně se však podílejí na zvětšení celkového sorpčního povrchu kořenů i na zvětšení objemu půdy, který může celá kořenová soustava využívat. Vzhledem ke svým rozměrům pronikají i do velmi malých pórů v půdních strukturách, ve kterých se v suché půdě nejdéle udržují zbytky vody. Příjem vody z půdy do kořenů je možný pouze tehdy, je-li vodní potenciál půdního roztoku vyšší než vodní potenciál vody v kořenech (v opačném případě by mohlo docházet i k toku vody z rostliny do suché půdy!). Rychlost příjmu vody závisí jednak na velikosti rozdílů (gradientu, spádu) vodních potenciálů, jednak na hydraulické vodivosti kořenových pletiv v příčném (radiálním) směru, tedy od epidermis ke xylému. Obvykle se rozlišují dvě hlavní možnosti pohybu vody v radiálním směru: symplastová cesta, kdy voda vstupuje do cytoplazmy již v epidermis a pokračuje v dalším pohybu pouze v symplastu, a apoplastová cesta, při které voda do cytoplazmy nevstupuje, ale pohybuje se pouze buněčnými stěnami a volnými mezibuněčnými prostory, Schema symplastové a apoplastové cesty transportu vody a rozpuštěných látek v kořenových pletivech. Vstup vody do symplastu (tedy z buněčných stěn do protoplastů kořenových buněk přes jejich plasmatické membrány) je možný podél celého apoplastového toku. TRANSPORTNÍ PROCESY 7 TRANSPORTNÍ PROCESY 8 Obvykle se současně využívají obě cesty. Přesto odpor, který musí voda překonávat při poměrně krátkém radiálním transportu, může být někdy vyšší než při dálkovém toku vodivými elementy xylému. Souvislý tok vody apoplastovou cestou buněčnými stěnami z epidermis až do xylému (který je také apoplastovou strukturou), tedy bez jediného přestupu přes cytoplazmatickou membránu, není možný. V cestě tomuto toku stojí totiž suberinem impregnované (a tudíž pro vodu nepropustné) radiální části buněčných stěn v endodermis (Caspariho proužky). Navíc, jak bylo nyní dokázáno, u kořenů většiny rostlin (88% druhů z dosud zkoumaných 52 čeledí) je vyvinuta kromě endodermis ještě exodermis, což je podpokožková vrstva buněk s obdobnou stavbou jakou má endodermis. Tyto buňky nejsou samozřejmě zcela nepropustné pro vodu - ta ovšem musí nejprve vstoupit přes plasmatickou membránu do jejich vnitřního roztoku (cytosolu), tady do symplastu. Další pohyb v symplastu usnadňují hojná plazmodezmata, což jsou volně propustné kanálky v buněčné stěně nepokryté plazmatickou membránou. Podrobnější popis stavby a funkce plazmodezmat je uveden na str. 31-32. Na vytvoření nezbytného gradientu (snížením vodního potenciálu v blízkosti xylému) má hlavní podíl podtlak v xylému (zejména v denních hodinách při výparu vody z listů). Někdy však lze naměřit v cévách pozitivní hodnotu tlaku (zejména v nočních hodinách při malém výparu) a na snížení vodního potenciálu xylémové tekutiny se pak může významně podílet i osmotická složka. Transmembránový transport vody Příjem vody do rostliny i vnitrobuněčné přesuny vody mezi cytosolem a organelami jsou neodmyslitelně spojeny s transportem přes biologické membrány. Jedině díky membránám mohou rostlinné buňky (ale i jejich součásti, zejména vakuoly) fungovat jako osmoticky aktivní systémy. Biologické membrány ovšem nejsou propustné pouze pro vodu, ale též, i když mnohem méně, pro rozpuštěné látky. Nemohou být propustné jen pro vodu už z toho důvodu, že rostlina musí přijímat a transportovat ionty solí i menší organické molekuly. Odchylky od vlastností ideálně polopropustné membrány způsobují, že buňky nemohou nikdy dosáhnout takového turgorového (hydrostatického) tlaku, který by odpovídal teoretické hodnotě osmotického tlaku, i kdyby byla v jejich okolí čistá voda. Většina molekul vody proniká přes biologické membrány přes póry vytvářené speciálními transmembránovými proteiny (akvaporíny), s vysokou transportní kapacitou a specifitou právě jen pro molekuly vody. Jejich struktura a funkce je blíže popsána na str. 26 a 27. Rostliny mohou jejich počet (plošnou hustotu) v membránách poměrně rychle měnit (syntézou či rozkladem) podle aktuální potřeby, tedy zda je za daných okolností žádoucí zrychlit či zpomalit transport. Akvaporínů je celá řada typů (= proteinů kódovaných odlišnými geny) i u téže buňky. Akvaporíny v rostlinných buňkách (na rozdíl od živočišných) nejsou pouhé trvale otevřené kanálky (tedy pravé poríny), jak se dříve soudilo, ale mají schopnost se v případě potřeby zavírat (např. za nedostatku vody v půdě či při zaplavení půdy). V otevřeném stavu je však jejich transportní kapacita neobyčejně vysoká, řádově asi jedna miliarda (109 ) molekul vody za sekundu. V každém případě se jedná o transport pasivní, prostou difusí, který není spojen se spotřebou metabolické energie. Hybnou silou transportu vody přes membrány je rozdíl vodních potenciálů roztoků na obou stranách membrány (∆Ψ), který je ovšem daný rozdílem tlaků (∆p) a koncentrací roztoků (vyjádřené rozdílem jejich osmotických tlaků, ∆π ). K tomu ještě přistupují specifické vlastnosti membrány (např. plošná hustota a stupeň otevřenosti akvaporinů) vyjádřené v hodnotách její hydraulické vodivosti, Lp) Rychlost toku vody přes membránu (J, m.s-1 ) je pak: J = Lp. ∆Ψ = Lp.(∆p - ∆π ) Transport vody v xylému Dálkový (meziorgánový) transport vody v rostlinách probíhá v daleko největší míře ve specializovaných transportních pletivech. Vodivé složky dřeva (xylému) jsou tvořeny u krytosemenných rostlin cévami (tracheje) a cévicemi (tracheidy), u nahosemenných pak jen tracheidy. Tok vody xylémem je v podstatě fyzikální proces, a proto jeho mechanismus je dnes již docela dobře znám. Podle všeobecně uznávané kohezní teorie je hybnou silou transportu vody podtlak (tlak menší než atmosférický) ve vodivých elementech xylému, způsobený vypařováním vody v nadzemních částech, tedy na samém konci vodivých drah. Tato teorie byla navržena již na počátku minulého století (Münch 1930), avšak bylo nutné postupně ověřovat základní předpoklady pro fungování celého mechanismu, jako například: - může vůbec vzniknout v zakončení xylému dostatečně velký podtlak a jakým způsobem ? - má vodní sloupec v cévách natolik velkou soudržnost, aby při velkém snížení tlaku nedošlo k jeho přetržení? - jakým mechanismem je zabezpečen celý systém proti náhodným poruchám (například proti ucpání cév a cévic bublinkami plynů)? Hlavní síly, které táhnou dlouhé sloupce vody v cévách směrem vzhůru, je nutno hledat v buněčných stěnách listového mezofylu. Voda v úzkých pórech mezi mikrofibrilami celulózy má velmi ostrý úhel smáčení, daný vysokou přilnavostí (adhezí) molekul vody k celulózovým povrchům. Vezmeme-li ještě v úvahu vysoké povrchové napětí vody, pak negativní tlak, který se v těchto pórech (mikrokapilárách) může pod sloupečky vody vytvořit, je značný (viz rámeček na další straně). Zvláštní význam má malý průměr kapilárních pórů, neboť velikost negativního tlaku je na něm úzce závislá. Voda může zajisté vzlínat do jisté výšky i v izolovaných kapilárních trubicích xylému bez napojení na listový mezofyl. V cévách o průměru např. 100 µm se kapilaritou sníží tlak asi o 0,003 MPa pod hodnotu tlaku atmosférického, což postačuje k vyzdvižení sloupečku vody do výšky pouze 0,3 m. To by bylo ovšem pro transport vody u většiny vyšších rostlin nedostatečné. Kapilární póry v buněčných stěnách jsou však mnohem TRANSPORTNÍ PROCESY 9 tenčí - mají průměr jen asi 10 nm. V tom případě lze dosáhnou snížení tlaku až o 30 MPa, což by čistě teoreticky mělo postačovat na transport vody až do výšky 3000 m. V dynamickém systému se stálým tokem (při výparu z listů) však takovýchto hodnot nelze dosáhnout, neboť je potřeba vynaložit jistou sílu i na překonání tření transportované vody o stěny vodivých elementů. Nicméně pro transport i do korun těch nejvyšších stromů (což je asi 100 metrů) by měl být vytvořený podtlak naprosto dostatečný. Obecné schéma rozložení sil určujících velikost "samovolného" vzestupu sloupečku vody v kapilárách. Velmi zjednodušené znázornění principu funkce xylémové soustavy v rostlinách, složené ze dvou typů kapilár. Na velmi úzké a krátké kapiláry (tvořené póry v buněčných stěnách listového parenchymu) jsou napojeny široké a dlouhé kapiláry xylému. Systém tenkých kapilár v buněčných stěnách, ve kterém lze dosáhnout velkého snížení tlaku, je ale samostatně (bez napojení na širší kapiláry v xylému) nepoužitelný pro transport vody na delší vzdálenosti, neboť klade toku vody velký odpor (třením molekul vody o stěny). Ten totiž vzrůstá nejen se zmenšováním průměru kapiláry, ale i s délkou transportní dráhy. TRANSPORTNÍ PROCESY 10 A nyní se podívejme, jaká je soudržnost vodního sloupce v cévách. Molekuly vody jsou navzájem spojeny vodíkovými můstky, a k jejich narušení by mělo teoreticky dojít až při hodnotách podtlaku přibližně 30 MPa. V praxi ale takové hodnoty soudržnosti nelze dosáhnout z řady důvodů. Jedním z nich je vliv rozpuštěných látek (včetně plynů), které mohou soudržné síly molekul vody značně snižovat. Z výsledků mnoha pokusů a pozorování vyplývá, že soudržnost vodních sloupečků v cévách je také značně závislá na jejich šířce (průměru). V cévách velmi širokých (400 až 500 µm) může dojít k přetržení sloupce již při podtlaku asi 2 MPa, ve velmi úzkých cévách a cévicích (o průměru 10 až 50 µm) pak při hodnotách mnohem nižších (10 až 20 MPa). TRANSPORTNÍ PROCESY 11 Vidíme tedy, že úzké vodivé elementy jsou provozně bezpečnější, ovšem na druhé straně kladou toku vody velký odpor(= mají malou hydraulickou vodivost). Vodivost totiž vzrůstá se čtvrtou mocninou poloměru kapiláry. Je proto zřejmé, že nejčastější vnitřní šířka vodivých elementů u rostlin (50-100 µm) je výsledkem kompromisního "řešení" dvou protichůdných požadavků (či lépe řečeno optimalizačního procesu v průběhu evoluce), kdy je zaručena jednak dostatečná vodivost, ale současně i dostatečná bezpečnost provozu. Často je kompromisu dosaženo také zastoupením cév či cévic různé šířky v tomtéž cévním svazku. Přesto se však může stát (a je to dosti častý případ), že ve vodivých elementech xylému dojde k přetržení některých sloupečků vody a vytvoří se v nich dutiny vyplněné plyny (kavitace, plynová embolie). K tomu může dojít jednak při extrémním suchu, kdy hodnoty podtlaku v xylému vzrostou až za kritickou mez soudržnosti molekul vody. Častěji však způsobují kavitaci bublinky plynů, které byly rozpuštěny ve vodě přijímané kořeny a v xylému za velmi sníženého tlaku se z ní uvolňují. K vyloučení plynů může dojít i při zvýšení teploty nadzemních částí (ve srovnání s kořeny), neboť rozpustnost plynů s teplotou klesá. Další velmi častou příčinou kavitace je zamrznutí vody v xylému (spojené se zmenšením jejího objemu) u vytrvalých rostlin v průběhu zimního období. Samozřejmě jakékoli poranění vodivých pletiv (v extrémním případě úplné přerušení, např. u řezaných květin) vede okamžitě ke kavitačnímu ucpání cév a cévic. Nápravné mechanismy, které umožňují zajistit transport vody i v případě vzniklé kavitace, jsou několikerého druhu. Většina je ale založena na strukturních adaptacích (zvláštnostech stavby) xylému. Perforované přepážky na koncích jednotlivých článků cév či cévic jsou účinnou ochranou proti šíření bublinek na větší vzdálenosti (při velkém podtlaku mají původně malé bublinky tendenci rychle expandovat). Jednotlivé cévy či cévice jsou zřídkakdy uloženy paralelně vedle sebe na delším úseku kmene, spíše se složitě proplétají. Proto voda, která vchází do kmene z jedné části kořene, může být současně rozváděna do mnoha větví koruny. Také kapacita vodivých cest je obvykle natolik velká, že vyřazení i značného procenta cév z provozu ještě neohrozí život rostliny. Některé druhy řeší poškození velkého množství cév v důsledku mrazové kavitace rychlou tvorbou nových vodivých pletiv na jaře (jarní přírůstek dřeva). Kromě strukturních předpokladů ještě existují i funkční mechanismy nápravy kavitačního poškození cest pro vedeni vody. Jsou založeny v prvé řadě na vytvoření pozitivního tlaku (přetlaku ve srovnání s okolní atmosférou). K tomu může dojít několika způsoby. Především v nočních hodinách, kdy vzhledem k vysoké vzdušné vlhkost je zastaven výpar z rostlin (transpirace), je zastaven i xylémový tok. Přesto však dochází k membránovému transportu iontů (hlavně minerálních živin) do zakončení xylému v kořenech, neboť jejich transport je řízen zcela jinými mechanismy než transport vody, jak bude ještě blíže popsáno v další části tohoto textu. Osmoticky aktivní látky se v xylému hromadí neboť jejich pohyb pouze difusí (bez toku celého roztoku) je velice pomalý. Následuje osmoticky podmíněný přesun vody z okolního parenchymu do cév a tím i zvyšování tlaku v cévách, někdy až na hodnotu 0,02 MPa. Tento jev je běžný zejména u většiny bylin. Vytvořený přetlak ve vodivých elementech xylému, označovaný také jako kořenový vztlak vede k opětovnému spojení většiny přerušených sloupečků. U některých druhů rostlin, zejména u většiny dřevin, nebývá kořenový vztlak v nočních hodinách měřitelný. Přesto i u nich existuje možnost dočasného vytvoření přetlaku v xylému. Principem je opět aktivní (metabolickou energií podmíněný) transport osmoticky aktivních látek do poškozených cév a cévic ze sousedících parenchymových buněk spojený s pasivním (osmotickým, tedy difusním) příjmem vody. K tomuto přestupu nedochází v kořenech, ale přímo v nadzemních částech v blízkosti poškozeného místa. Na rozdíl od kořenového vztlaku, ke kterému za příznivých podmínek (dostatek vody a živin v půdě) dochází „samovolně“, tedy bez ohledu na potřebu odstranění kavitace, osmotické zvyšování tlaku přímo ve stoncích bývá obvykle kavitačním poškozením části xylému indukováno. Transportní obchvat (bypass) článku cévy ucpaného vzduchovou bublinkou Zdaleka ne všechny mechanismy nápravy poškozených cév a cévic (včetně regulace tlakových změn) jsou v současné době uspokojivě prozkoumány a výzkum této problematiky je proto velmi živý. Je také potřeba upozornit, že odstraňování kavitace nemusí být ve všech případech úspěšné. U většiny stromů bývá pozorován v průběhu vegetační sezóny postupný úbytek plně funkčních vodivých elementů xylému, které jsou v následujícím roce nahrazovány novými. Ještě zbývá uvést několik údajů o maximální rychlosti transportu tekutin v xylému. Za předpokladu, že tok vody není omezován na vstupu a výstupu, je jeho rychlost závislá na rozdílu hydrostatického tlaku mezi začátkem a koncem vodivých cest a dále na hydraulické vodivosti cév a cévic, která, jak již víme, je dána především jejich vnitřní šířkou (světlostí). Maximální rychlosti toku vody, naměřené u listnatých stromů se širokými cévami (100 až 500 µm, jaké mají např. dub, jasan, jilm) dosahují až 45 metrů za hodinu. Ještě vyšší rychlost byla naměřena u některých lian. U druhů s úzkými cévami (nejčastěji 40 až 80 µm, např. bříza, ovocné stromy) a u všech jehličnatých stromů (tracheidy jsou zvláště úzké, jen asi 10 až 25 µm) bývají maximální rychlosti toku vody jen 1 až 6 m.h-1 . TRANSPORTNÍ PROCESY 12 Metody stanovení hlavních charakteristik stavu vody v rostlinách Vodní potenciál je velmi obtížné stanovit nedestruktivně, tedy u neporušených rostlin či jejich částí. Obvykle proto pracujeme s odříznutými vzorky různé velikosti. K vlastnímu stanovení se nejčastěji požívají dva principiálně odlišné přístupy. (1) Metoda hygrometrická vychází ze vztahu mezi relativní vlhkostí vzduchu a jeho vodním potenciálem, který byl již uveden. Uzavřeme-li vzorek rostliny (nebo půdy, roztoku či jiného materiálu) do vhodné nádobky, pak se v ní po jisté době ustaví relativní vlhkost odpovídající vodnímu potenciálu ve vzorku. K přesnému měření vlhkosti vzduchu v nádobce (nejméně na 0,1%, a to ještě v oblasti blízké úplnému nasycení) se používají různé speciální postupy. K nejčastějším patří komůrky vybavené miniaturními teplotními čidly (termočlánky), jimiž se nejprve změří psychrometrický rozdíl (= rozdíl mezi teplotou suchého a ovlhčeného čidla) a z tohoto rozdílu se pak vypočítá či odečte v psychrometrických tabulkách hodnota relativní vlhkosti. Jiné (modernější) typy aparatur jsou vybaveny miniaturními čidly pro měření teploty rosného bodu, ze které lze snadno vypočítat relativní vlhkost vzduchu. V tom případě je čidlo (obvykle miniaturní kovové zrcátko, umístěné v komůrce nad měřeným vzorkem) elektricky zchlazováno a při počátku orosení se odečte jeho teplota (= teplota rosného bodu vzduchu nad vzorkem). Při praktickém použití uvedených přístrojů se hodnoty vodního potenciálu měřených vzorků obvykle nezjišťují výpočtem z naměřených hodnot vlhkosti vzduchu, ale odečítají se z kalibrační křivky daného měřícího zařízení, získané měřením série vzorků o známém vodním potenciálu (obvykle roztoků solí o různé koncentraci). Podmínkou přesného měření jsou přísně izotermické podmínky (čidlo, vzorek a vzduch v nádobce). (2) Metoda tlaková je založena na měření tlaku který je nutno vynaložit, aby se kompenzovalo snížení vodního potenciálu v pletivech rostliny. Část rostliny se uzavře do silnostěnné kovové nádobky, ovšem tak, aby řezná plocha (obvykle řapíku listu či stonku) procházela víkem na vnější stranu. V nádobce pak pomalu zvyšujeme tlak (z připojené nádoby se stlačeným vzduchem) a současně pozorujeme řeznou plochu. Jakmile se na ní objeví první kapičky vytlačené šťávy, odečteme hodnotu tlaku v nádobě se vzorkem. Tato hodnota numericky odpovídá vodnímu potenciálu vzorku. Při přesné práci je nutno ještě od ní odečíst hodnotu osmotického tlaku vytlačené šťávy. Ta ovšem bývá obvykle blízká nule, neboť šťáva je z buněk vytlačována v podstatě procesem reverzní osmózy, a mělo by tudíž jít o téměř čistou vodu. Tlaková metoda je v současné době využívána i pro stanovení řady dalších charakteristik stavu vody v rostlině (osmotické a tlakové složky vodního potenciálu, obsahu vody při nulovém tlakovém potenciálu, specifické vodivosti xylému pro transport kapalné vody a k získávání vzorků xylémové tekutiny pro chemické analýzy). Schéma aparatury pro měření vodního potenciálu tlakovou metodou. TRANSPORTNÍ PROCESY 13 Existuje i řada starších metod, které se dnes používají zřídka. Patří k nim např. testování, jaká koncentrace vhodného osmotika (o známém osmotickém tlaku, a tudíž i známém vodním potenciálu) způsobí počínající plazmolýzu. Při hledání izotonického roztoku můžeme také postupovat tak, že ponecháme série shodných vzorků ponořené ve vhodně odstupňovaných koncentracích osmotika a po jisté době měříme změnu jejich délky či hmotnosti, nebo též změnu koncentrace roztoků pod vlivem expozice vzorků. Osmotický tlak (π) se dnes už neměří pomocí klasických membránových osmometrů (zejména pro potíže s vhodnou membránou a časovou náročnost). Nejčastěji používáme metodu kryoskopickou. Při kryoskopii měříme snížení bodu tuhnutí roztoku (b, ∆°C), tedy v našem případě buněčných šťáv vylisovaných z rostliny. Bod tuhnutí je koligativní (= na množství částic v roztoku závislá) vlastnost roztoků, stejně tak jako osmotický tlak (π), a vztah mezi nimi je prakticky lineární: π (MPa) = 1,22 b K měření osmotické složky vodního potenciálu lze využít i hygrometrickou metodu, zmíněnou v souvislosti s měřením celkového vodního potenciálu. Vzorek rostliny však nejprve usmrtíme (např. krátkým zmrazením). Poškozením membrán poklesne turgor na nulu a je tudíž vyloučena spoluúčast tlakové složky vodního potenciálu. Turgorový tlak (= tlakovou složku vodního potenciálu, p) můžeme nepřímo stanovit z rozdílu mezi celkovým vodním potenciálem a osmotickým tlakem. V současné domě však nabývá na stále větším významu přímé měření hydrostatického tlaku v buňkách (turgoru) pomocí tlakových sond. Při tomto postupu opatrně zavedeme tenkou skleněnou kapiláru naplněnou silikonovým olejem do nitra buňky. Kapilára je napojena na přesný elektrický tlakoměr. Při zavádění kapiláry a v průběhu vlastního měření se nesmí změnit původní objem buňky, neboť by to vážným způsobem ovlivnilo hodnoty měřeného tlaku. Rychlosti toku vody rostlinou lze principiálně zjišťovat měřením jejího příjmu (např. z úbytku objemu živného roztoku, ve kterém pokusnou rostlinu pěstujeme), nebo z výdeje vody z rostliny ve formě vodní páry (např. gazometricky ze zvýšení vlhkosti vzduchu v okolí rostliny). To je ovšem vhodné spíše pro laboratorní pokusy s poměrně malými rostlinami Pro terénní měření jsou metody stanovování rychlosti xylémového toku založené na principu přenosu tepla. Jestliže bodově ohřejeme jistou část stonku, šíření tepla ve směru toku vody bude rychlejší než v opačném směru neboť teplo bude částečně přenášeno i konvekčně, proudící vodou). Proto také teplota stonku v jisté vzdálenosti nad místem ohřevu bude vyšší než ve stejné vzdálenosti od místa ohřevu směrem dolů. Známe-li množství dodávaného tepla, pak ze zjištěného teplotního rozdílu můžeme vypočítat množství protékající vody a z rychlosti reakce po tepelném impulzu také rychlost proudění. Stonek musí být v místě měření velmi dobře izolován proti ztrátám tepla do vzduchu. TRANSPORTNÍ PROCESY 14 TRANSPORTNÍ PROCESY 15 Příjem a transport iontů solí Rostliny svými kořeny přijímají nejen vodu, ale i celou řadu jiných chemických látek, ze kterých daleko nejhojnější jsou ionty jednoduchých anorganických solí. Ty nejdůležitější z nich, nezbytné pro metabolismus rostliny, označujeme jako minerální živiny. Představa, že rostlina nasává kořeny půdní roztok, tedy že přijímá rozpuštěné látky do svých buněk ve stejné koncentraci, v jaké jsou v půdním roztoku, by byla krajně nesprávná. Není to možné už z toho důvodu, že poměrný podíl jednotlivých látek v půdním roztoku naprosto neodpovídá jejich zastoupení v rostlinné biomase. Neregulovaný příjem by velmi rychle vedl ke vzniku toxicky vysokých koncentrací jedněch prvků a k vážnému nedostatku jiných prvků v těle rostliny. Mechanismus příjmu a transportu iontů solí se tedy nutně musí lišit od procesů spojených s příjmem a transportem vody a splňovat tyto základní předpoklady: a) Vzhledem k velmi nízké koncentraci většiny iontů v půdním roztoku (často mnohem nižší, než nacházíme v buňkách kořenů), musí existovat možnost transportu těchto iontů z nižší koncentrace do vyšší (obecněji - z místa, kde mají menší chemický potenciál do míst s potenciálem vyšším). b) Vzhledem k velkým rozdílům mezi koncentracemi jednotlivých iontů v půdním roztoku a potřebami rostliny, musí mít kořeny schopnost regulovat příjem každého iontu odděleně od ostatních. Podívejme se nyní, jakým způsobem je u rostlin zajištěno, že uvedené požadavky budou skutečně uspokojeny. Buněčné membrány jako předpoklad řízeného příjmu iontů solí Příjem iontů solí kořeny začíná jejich vstupem ve vodním roztoku do buněčných stěn epidermis, odkud mohou buď přecházet přes plazmatickou membránu (plazmalemu) do cytoplazmy, nebo pokračovat v putování apoplastem až k endodermis a přitom postupně vstupovat do cytoplazmy korových buněk. Část iontů může být do buněk kůry vnášena i hyfami mykorrhitických hub. Dříve nebo později však musí dojít k přestupu iontů přes plazmalemu a často i přes další buněčné membrány. Jsou to právě membrány buněk, které mají hlavní podíl na řízení příjmu a transportu iontů solí a na zmíněných odlišnostech od příjmu vody. Poznání stavby a funkce buněčných membrán má proto klíčových význam pro pochopení celého mechanismu. Obecnými vlastnostmi membrán se zabývají detailně jiné vědní obory, zejména buněčná biologie a biofyzika. Připomeňme si alespoň několik nejdůležitějších údajů, které jsou pro náš další výklad skutečně nezbytné. Základní stavba u všech biologických membrán je podobná, i když v detailech lze nalézt rozdíly, a to jak uvnitř téže buňky, tak i mezi orgány a druhy. Z hlediska hrubého látkového složení jde o směs proteinů a lipidů přibližně ve stejném poměru. Na některé z nich (2 až l0%) bývají navázány sacharidy. Lipidovou složku membrán rostlinných buněk tvoří zejména: - fosfolipidy (nejčastěji to bývá fosfatidylcholin, fosfatidyletanolamin, fosfatidylinositol a fosfatidylglycerol), - glykolipidy (monogalaktosyldiglycerid a digalaktosyldiglycerid) - steroly (hlavně sitosterol, stigmasterol, campesterol a jen poměrně vzácně cholesterol, který je naopak velmi hojný v živočišných buňkách). Základní hmota membrány je tvořena dvěma vrstvami molekul lipidů, které k sobě přisedají hydrofobními řetězci mastných kyselin a zbylá hydrofilní část je orientována k vnějšímu povrchu. Na délce řetězců a počtu dvojných vazeb mastných kyselin jsou značně závislé fyzikální vlastnosti celé membrány. Lipidová dvojvrstva je pro ionty a větší polární molekuly prakticky napropustná, takže velmi dobře odděluje buňku od vnějšího prostředí (funkce bariéry). Přitom je ale natolik tekutá, aby v ní mohlo docházet ke snadným výměnám, přemísťování a konformačním změnám membránových bílkovin. Strukturní vlastnosti lipidové dvojvrstvy zásadním způsobem ovlivňuje přítomnost sterolů. Udržují uhlíkové řetězce fosfolipidů v uspořádaném stavu a tím snižují tekutost a propustnost membrány. Podíl molekul sterolů velice kolísá jak u membrán různých rostlinných druhů, tak i u různých orgánů téhož druhu. Mění se a také působením rozdílných faktorů vnějšího prostředí. Klasická představa buněčné membrány jako fluidní mozaiky. Membránové proteiny můžeme rozdělit z funkčního hlediska do několika skupin: - transportní proteiny umožňují transport iontů i větších molekul organických látek přes membránu. Patří k nim poríny, selektivní kanály a přenašeče (včetně protonových pump), - receptory signálů a rozlišovače cizích molekul. Přenášejí signály z vnějšího prostředí k přenosovému řetězci v buňce. Dále rozlišují, které molekuly proteinů a polysacharidů budou odmítnuty nebo naopak přijaty pro další zpracování (obvykle jde o transport). Domníváme se, že k této rozlišovací funkci slouží především glykoproteiny. - strukturní proteiny, které zpevňují a stabilizují strukturu membrán, Z hlediska lokalizace v membráně rozdělujeme proteiny na transmembránové (integrální), prostupující celou lipidovou dvojvrstvou, a periferní, které poměrně volně přisedají na povrch jedné strany membrány. Ještě jednu významnou složku nelze pominout, a sice ionty vápníku (Ca2+ ), bez kterých membrány ztrácejí schopnosti aktivního i selektivního transportu a stávají se pro ionty volně prostupné. Způsob vazby iontů vápníku v membránách není zcela jasný, ale nejspíše budou napojeny jako spojovací elementy k hydrofilním částem fosfolipidů. Velmi pravděpodobná je i vazba k proteinům. Vnitřní dvojitá vrstva lipidů dává biologickým membránám vlastnost elektricky izolujícího materiálu (dielektrika). Již velmi malá odchylka od elektroneutrality v buněčném prostředí vytváří významný rozdíl v elektrickém potenciálu roztoků na obou stranách membrány. Tento rozdíl může dosahovat až několika set milivoltů, přičemž cytosolová strana má negativní hodnoty elektrického potenciálu, zatímco elektrický potenciál vnějšího prostředí bývá považován konvenčně za nulový (standardní). TRANSPORTNÍ PROCESY 16 Význam elektrochemického gradientu pro transport iontů Obdobně jako u transportu vody, i ionty rozpuštěných látek se mohou pohybovat jak difuzí, tak i hromadným (konvekčním) tokem, v tom druhém případě ovšem jen ve společném proudu s molekulami vody. Hromadný tok je mnohem rychlejší než difuze a tudíž neobyčejně důležitý při dálkovém transportu nejen vody, ale i v ní rozpuštěných látek. Ovšem hromadný tok se v rostlinách uplatňuje převážně jen ve vodivých elementech cévních svazků. Buněčné membrány představují nepřekonatelnou překážku pro hromadný tok, a proto transmembránový transport se děje buď difuzí, nebo zvláštními, energeticky dotovanými mechanismy. Pro "samovolný" transport iontů solí difuzí přes buněčné membrány je zásadně důležitý rozdíl v chemickém potenciálu těchto iontů mezi místy oddělenými membránou. To ostatně platí obecně, nejen pro ionty, jak již víme z výkladu o transportu vody. V případě vody byla zdůrazňována koncentrační a tlaková složka chemického potenciálu. O chemickém potenciálu iontů solí rozhoduje také jejich koncentrace, ale navíc má velký význam i složka elektrická. Chemický potenciál iontu n v roztoku (µn) můžeme tedy zjednodušeně vyjádřit: µn = µn o + RT lnCn + znFE µn o = chemický potenciál iontu n za standardních podmínek, RT = součin plynové konstanty a absolutní teploty, Cn = koncentrace iontu n v roztoku (přesněji jeho aktivita), zn = valence iontu n, F = Faradayova konstanta (9,65.104 J V-1 mol-1 ), E = celkový elektrický potenciál roztoku (V). TRANSPORTNÍ PROCESY 17 TRANSPORTNÍ PROCESY 18 Chemický potenciál, ve kterém hraje významnou úlohu elektrická složka, označujeme také jako elektrochemický potenciál. Uvažme nyní, za jakých podmínek může docházet k difuzi iontu n z roztoku na vnější straně membrány, kterou si označíme jako strana a, do roztoku na vnitřní straně membrány (strana b). Je užitečné vyjít z podmínek rovnovážného stavu, kdy k difusi nedochází. Pokud je membrána pro daný iont prostupná, pak ve stavu rovnováhy musí být elektrochemický potenciál iontu n na obou stranách membrány shodný: µn a = µn b µn o + RT ln Cn a + znFEa = µn o + RT ln Cn b + znFEb což lze upravit na tvar Nernstovy rovnice: RT Cn a Eb -Ea = znF ln Cn b Rozdíl elektrických potenciálů na obou stranách membrány (Eb -Ea ) se někdy také označuje jako Nernstův potenciál (EN). Pokud je dosažen na obou stranách membrány shodný elektrochemický potenciál příslušného iontu, vůbec to neznamená, že by také musela být na obou stranách membrány jeho stejná koncentrace. O tom se můžeme snadno přesvědčit po dosazení numerických hodnot konstant do Nernstovy rovnice. Pro jednomocný kationt (zi= 1) a teplotu 25 ºC (= 298,15 K) platí: Ca EN [V] = 0,0257 ln Cb a po úpravě na dekadický logaritmus a pro napětí v milivoltech: Ca EN [mV] = 59,2 log Cb Je tedy zřejmé, že desetinásobný rozdíl v koncentraci jednomocného iontu mezi oběma stranami membrány (log 10/1 = 1) je úměrný rozdílu elektrických potenciálů o velikosti 59,2 mV mezi oběma stranami membrány. Pokud tedy je například uvnitř buňky (v cytosolu) desetkrát vyšší koncentrace iontů draslíku než ve vnějším prostředí, pak snížením elektrického potenciálu na vnitřní straně membrány na -59,2 mV se zcela kompenzuje vliv rozdílu v koncentracích na hodnotu celkového transmembránového elektrochemického potenciálu (bude nulová a nebude probíhat difusní tok). Při dalším snižování elektrického potenciálu v cytosolu pod uvedenou hodnotu dojde dokonce k difusi K+ z vnějšího prostředí do buňky, tedy do roztoku s desetinásobně vyšší koncentrací K+ . Je tedy zřejmé, že velké transmembránové elektrické potenciály, které vznikají např. činností protonových pump (viz další kapitola, běžně přes 120 mV) mohou velmi podstatně napomáhat samovolnému toku (difuzi) iontů i proti koncentračnímu gradientu, tedy z míst o malé koncentraci do míst s koncentrací až stokrát vyšší. Při všech úvahách o ovlivňování transportu iontů (či jiných elektricky aktivních částic) určitou hodnotou elektrického potenciálu je potřeba mít stále na zřeteli jaká je polarita těchto částic, zda mají kladný či záporný náboj (viz spodní rámeček na předešlé straně)!. Rozdíl v elektrických potenciálech roztoků oddělených biologickou membránou vzniká nejčastěji činností protonových pump (viz další kapitola). Může k němu ale docházet i v důsledku rozdílů ve schopnostech difuzního pohybu různých druhů iontů v dané membráně ne všechny ionty totiž procházejí membránami stejně snadno. Až dosud jsme uvažovali o difuzi pouze jednoho druhu iontu (např. K+ ), ale za normálních podmínek dochází v buňkách k difuzi více různých druhů iontů současně. TRANSPORTNÍ PROCESY 19 Představme si tedy případ, kdy na jedné straně membrány budeme mít roztoky disociovaných solí o jiné koncentraci než na straně druhé, ale počet opačně elektricky nabitých částic (kationtů a aniontů) bude v obou roztocích vyrovnaný. Difuze bude zpočátku probíhat pouze pod vlivem koncentrační složky chemického potenciálu, neboť elektrická složka nebude významná. I za situace, kdy gradient koncentrací jednotlivých druhů iontů bude stejný, nemusí být stejná rychlost jejich difuze. Tuto rychlost totiž ovlivňuje také velikost iontů a jejich specifické interakce se složkami membrány. Všechny faktory které ovlivňují mobilitu iontu v membráně (kromě rozdílů v chemickém potenciálu!) shrnujeme do hodnoty koeficientů permeability. Ty jsou specifické pro jednotlivé druhy iontů a pro daný typ membrány. Pokud existují rozdíly v koeficientech permeability mezi kationty a anionty v roztocích na obou stranách membrány, vede to k rozdílné rychlosti jejich toků přes membránu, k porušení elektroneutrality roztoků, a tím i ke vzniku transmembránového elektrického potenciálu. Velikost tohoto potenciálu, který bývá označován jako EM, lze vypočítat pomocí Goldmanovy rovnice. Na rozdíl od dříve uvedené Nernstovy rovnice jsou v ní koncentrace iontů na obou stranách membrány korigovány příslušnými koeficienty permeability (P). Ve velmi zjednodušené podobě (jeden jednomocný kationt n, jeden jednomocný aniont m na obou stranách membrány, které jsou opět označené jako a, b), ji můžeme psát: RT PnCn a + PmCm a EM = F ln PnCn b + PmCm b Výpočet EM pro více různých iontů je možný rozšířením počtu členů ve zlomku na pravé straně. Vliv vzniklého elektrického potenciálu na průběh transportních procesů i jiných iontů, které bychom k soustavě přidali, je evidentní, ovšem detailní popis těchto složítých procesů již přesahuje rámec našeho výkladu. Koeficienty permeability malých jednomocných iontů pro difuzi plazmatickou membránou mají hodnotu řádově 10-9 m s-1 . Ionty s větší molekulovou hmotností a ionty divalentní jsou ještě mnohem méně pohyblivé. Až dosud jsme se zabývali pouze otázkou difuzního toku iontů přes biologické membrány. Rychlost difuze v rostlinných buňkách však ovlivňují i jiné struktury, než jsou membrány. Jisté komplikace mohou způsobovat některé pevné látky (zejména v buněčné stěně), které snadno vytvářejí elektricky nabité povrchy. Patří k nim například pektin a jiné makromolekuly, z jejichž karboxylových skupin disociují ionty vodíku. Struktury v buněčné stěně se tím stávají elektronegativní a mohou k sobě elektrostaticky vázat kationty solí. Elektricky nabité povrchy v buňkách bývají označovány jako Donnanova fáze a elektrický potenciál mezi touto fází a okolním roztokem jako Donnanův potenciál. Donnanova fáze se vytváří i v cytoplazmě na povrchu velkých molekul proteinů a nukleových kyselin. Může zajisté ovlivňovat dynamiku difuzních výměn jednotlivých iontů, ovšem pro celkovou rychlost toku za delší časový interval nemá rozhodující význam. Funkce transportních proteinů A nyní se podívejme trochu podrobněji na přenosové cesty pro ionty a jiné rozpuštěné látky v buněčných membránách. Navíc k dosud uvedeným hybným silám transportu látek (elektrochemický potenciál u prosté difuse, tlakový rozdíl u hromadného toku) si přidáme ještě další, vycházející z vlastní metabolické energie buněk. Jak již víme, základní fosfolipidová vrstva (matrix) membrán je sice dosti dobře propustná pro plyny, ale prakticky nepropustná pro ionty a větší polární molekuly, i pro molekuly organických látek. Jejich přestup přes membránu je možný pouze díky specializovaným transportním bílkovinám, které si můžeme rozdělit do několika skupin. . Schematické znázornění nejčastějších způsobů průniku různých molekul a iontů přes buněčné membrány. Selektivní kanály jsou integrální (transmembránové) proteiny s možností měnit svoje prostorové uspořádání. Změna konformace není součástí transportního mechanismu, pouze ovlivňuje prostupnost kanálu, tedy rychlost transportu. Schematicky si to lze představit jako přivírání a otvírání regulační klapky, ovšem pravděpodobnější je představa proměnlivé šířky celého póru (kanálku), či rychlého střídání dvou konformačních stavů s otevřenou a zavřenou difuzní cestou, přičemž na frekvenci výskytu a souhrnné době stavu "otevřeno" závisí prostupnost kanálu. Vlastní výkonný protein selektivního kanálu je řízen celou řadou jiných odděleně umístěných membránových proteinů, které fungují jako selektivní příjemci signálů, Přijaté signály jsou od nich přenášeny řetězcem druhotných mediátorů (viz obrázek na str. 25). K významným signálům pro otevírání a zavírání kanálů patří zejména: - gradient elektrického napětí mezi oběma stranami membrány, - vnější fyzikální podněty (záření, teplota, tlak na membránu aj.), - chemické látky regulační povahy. Hustota selektivních (hlavně iontových) kanálů v buněčných membránách je sice velmi malá (řádově asi 100 na ploše 1 mm2 ), ovšem jejich přenosová kapacita je neobyčejně vysoká (asi 106 až 108 iontů za sekundu). K významným a vysoce selektivním iontovým kanálům v membránách rostlinných buněk patří kanály pro K+ a Ca+ , z aniontů pak pro Cla malát. Transmembránové přenašeče (transportéry) jsou značně různorodou skupinou transportních bílkovin, které při své činnosti obvykle prodělávají vratné strukturní změny. Způsob vazby transportovaných částic k přenašečům a charakter vratných změn v jejich konformaci je dosud znám jen částečně. Obvykle se však nejedná o navazování transportované látky do nějakého komplexu a přesun tohoto komplexu na druhou stranu membrány, ale spíše přenášená látka migruje vytvořeným pórem s několika mezivazbami na stálých vazebných místech transportního proteinu. Víme také, že u některých přenašečů je transport spojen se spotřebou metabolické energie (obvykle získané hydrolýzou ATP, vzácněji i z jiných, např. oxidačních reakcí). V tom případě se jedná o aktivní transport a příslušný přenašeč lze řadit mezi enzymy. Aktivní transport tak může probíhat zcela nezávisle na gradientu elektrochemického potenciálu přenášené látky. TRANSPORTNÍ PROCESY 20 Jistá skupina přenašečů však dodání energie pro svoji funkci nevyžaduje. Jde tedy o pasivní transport, který probíhá pouze ve shodě s gradientem elektrochemického potenciálu. Bývá také označován jako zprostředkovaná či usnadněná difuse. Na rozdíl od prosté difuse iontovým kanálem je tento typu transportu, byť z energetického hlediska pasivní, spojen s přechodným navazováním přenášeného iontu na transportní protein. Proto také transportní kapacita přenašečů je vždy podstatně menší, než u iontových kanálů (přibližně 102 až 103 iontů za sekundu). TRANSPORTNÍ PROCESY 21 Nejčastějším případem aktivního transportu je činnost přenašečů využívajích energie z hydrolýzy ATP. Tyto transmembránové proteiny označujeme jako adenosintrifosfatázy, zkráceně ATPázy. Jsou hojnou součástí všech biologických membrán. Z hlediska příjmu iontů jsou zvláště důležité ATPázy cytoplazmatické membrány a tonoplastu. O zvláštnostech ATPáz v membránách chloroplastů a mitochondrií si povíme v kapitolách o metabolismu. V plazmatické membráně i v tonoplastu jsou asi vůbec nejhojnější ATPázy označované jako protonové pumpy, které transportují (s využitím energie ATP) vodíkový iont z jedné strany membrány na druhou, a to i z místa kde mají koncentraci (přesněji: elektrochemický potenciál) malý do míst s potenciálem vyšším. Tyto "pumpy" (jako ostatně i jiné ATPázy) netvoří jediná molekula bílkoviny, ale celý komplex se zřetelně asymetrickou stavbou: na užší "krček" pevně uložený v membráně, přiléhá kulovitá "hlavička", která již zcela vystupuje z roviny membrány. Asymetrickou stavbou je dána i jednosměrnost transportu. Naprostá většina protonových pump transportuje vodíkové ionty z cytosolu do buněčné stěny (přes plazmalemu), a z cytosolu do vakuoly (přes tonoplast). Celý proces začíná zachycením molekuly ATP vystupující částí ATPázy a po její hydrolýze se vytváří volná cesta pro vstup protonu. Při rozštěpení jedné molekuly ATP je přes plazmalemu přenesen vždy jen jeden proton. ATPázy v tonoplastu jsou energeticky efektivnější - na jednu molekulu ATP transportují dva protony. Jejich činnost také není závislá na přítomnosti draslíkových iontů, jako je tomu u ATPáz v plazmalemě, vyžadují však k aktivaci hořčík. V membráně vakuol rostlinných buněk se nachází ještě další typ protonové pumpy, která k přenosu vodíkových iontů nevyužívá energii uvolněnou z ATP, ale z hydrolýzy anorganického difosfátu (= pyrofosfátu) na fosfátové ionty (H+ -difosfatáza, dříve označovaná též jako H+ -pyrofosfatáza či zkráceně H+ -PPáza), která může po jistou dobu udržovat gradienty na membránách i za kritického nedostatku ATP v rostlinné buňce. Činností protonových pump dochází k těmto zásadním změnám: a) Vytváří se velký rozdíl v koncentraci vodíkových iontů mezi buněčnou stěnou, cytosolem a vakuolou. Hodnota pH buněčné stěny i vakuolárního roztoku obvykle klesá na 5,5 až 5, zatímco v cytosolu se zachovává přibližně neutrální reakce (pH 7,0 až 7,5), neboť jsou tam přítomny látky se značnou ústojnou (pufrovací) schopností. Větší koncentrace vodíkových iontů v buněčné stěně a ve vakuole současně znamená i jejich vyšší chemický potenciál v těchto kompartmentech než v cytosolu. b) Dochází ke zvýšení membránového elektrického potenciálu, neboť v cytosolu je méně kationtů a je tedy negativnější než buněčná stěna a roztok ve vakuole. Proto se tento typ ATPáz označuje jako elektrogenní. Vytvořený rozdíl v elektrickém potenciálu a rozdíl v chemickém potenciálu vodíkových iontů má zcela zásadní význam pro transport mnoha dalších iontů přes buněčné membrány, jak uvidíme z následujícího výkladu. Spřažený transport a kinetika výměn pomocí přenašečů Vlivem rozdílů v pohyblivosti kationtů a aniontů při difuzi přes biologické membrány, ale zejména v důsledku činnosti protonových pump je cytosol vždy negativněji nabitý než jeho okolí (tedy roztoky v buněčné stěně a ve vakuole). Vzhledem k takto orientovanému rozdílu elektrického potenciálu jsou vytvořeny velmi příznivé podmínky pro pasivní transport kationtů z okolí do cytosolu, a to buď pomocí selektivních iontových kanálů (prostá difuze), nebo pomocí přenašečů pasivního typu (usnadněná či zprostředkovaná difuze). Nikterak to ale nevylučuje i spoluúčast aktivního transportu pomocí přenašečů. Transport aniontů stejným směrem (z okolí do cytosolu) či kationtů opačným směrem (z cytosolu do okolí) však pasivním způsobem obvykle není možný. Transport v tomto případě lze uskutečnit pouze pomocí aktivních přenašečů, tedy za dodání jistého množství chemické energie. Při transportu aniontů do buňky (či z cytosolu do vakuoly) není možné dodávat chemickou energii přímo hydrolýzou ATP v příslušném aniontovém přenašeči, ale nejčastěji se využívá energie pomocného, současně transportovaného iontu, jehož chemický potenciál byl zvýšen dříve uskutečněnou metabolickou reakcí. V tom případě hovoříme o sekundárním aktivním transportu. Jako pomocné ionty v těchto společných (spřažených) transportech figurují nejčastěji protony. Je přitom využit jejich vyšší chemický potenciál na vnější straně plazmalemy a ve vakuole, vytvořený transportní ("zahušťovací") činností vodíkových pump. Vodíkové ionty za vyšší koncentrace a v „kladněji“ nabitém prostředí (= s vysokým elektrickým potenciálem) mají vyšší chemický potenciál než ve zředěném stavu a v prostředí se sníženým elektrickým potenciálem. Zvýšení jejich chemického potenciálu je tedy dáno jak koncentrační, tak i elektrickou složkou. Při transportu aniontů z vnějšího prostředí přes plazmalemu do cytosolu jsou protony transportovány stejným směrem (přičemž přenašečem prochází současně vždy jeden aniont a jeden či několik protonů), což se označuje jako symport. Je však možné využít přebytek energie vodíkových iontů k energetické dotaci transportu jiného iontu současně pronikajícího tímtéž přenašečem opačným směrem (antiport). Spřažený transport je v rostlinných buňkách neobyčejně hojně využíván pro výměny nejen iontů minerálních živin, ale i nízkomolekulárních organických látek (elektrolytů i neelektrolytů, např. organických kyselin, cukrů, adenylátů, aj.) mezi cytosolem a okolím buňky či mezi cytosolem a buněčnými organelami. TRANSPORTNÍ PROCESY 22 Studium funkce transportních proteinů – metody, nové poznatky Studiem kinetiky příjmu jednotlivých iontů, např. měřením rychlosti příjmu za různé koncentrace ve vnějším prostředí, můžeme podle tvaru zjištěných závislostí rozlišit transport pomocí přenašečů (saturační typ křivky, rychlost transportu může dosáhnout jen jisté hodnoty, kterou nelze překročit) od prosté difuse (vzestupné křivky bez zřetelného nasycení). Tato měření se provádějí s buňkami či celými kořeny s předem navozeným nedostatkem zkoumaného iontu. Rozlišit pasivní transport od aktivního lze na základě srovnání teoretické hodnoty rychlosti a směru difusního toku (vypočítané z gradientu chemického potenciálu příslušného iontu) a porovnáním této hodnoty s experimentálně zjištěnými rychlostmi toku či s koncentracemi v ustáleném stavu. Studium transportních procesů na buněčné úrovni je nesmírně obtížné. Nejen proto, že studovaný iont může být současně transportován oběma směry a navíc různým mechanismem (aktivně i pasivně), ale může být také kontinuálně odváděn do různých buněčných struktur, či přímo v cytosolu vázán do chemických sloučenin. Velké potíže vyplývají z proměnlivosti biologických membrán a z možnosti regulace jejich struktury a funkce, kterou buňka má. Životnost transportních proteinů je velmi krátká (obvykle jen několik dní), jsou tedy ve stálé obměně. Jejich počet se může rychle měnit podle okolností (naléhavost potřeby určitého iontu pro buňku, vnější koncentrace iontů, aj.). Velký pokrok ve výzkumu transportu iontů přes buněčné membrány byl umožněn zavedením metody označované anglickým termínem "patch clamp". Při této metodě se ústí velmi tenké kapiláry přisaje na studovanou membránu a za různých experimentálně navozovaných podmínek se pak studují její vlastnosti. Je dokonce možné opatrnou manipulací s kapilárou vytrhnout kousek přisáté membrány a v umělém prostředí zkoumat funkce jednotlivých transportních proteinů. Ještě významnější jsou v současné době některé aplikace metod molekulární biologie, vycházející ze znalosti genů kódujících jednotlivé transportní proteiny a v přenosu genetické informace do buněk jiných organismů, v nichž se tyto proteiny nevyskytují. Tedy např. cRNA zkoumaného transportního proteinu je pomocí vhodného vektoru vpravena do vajíčka žáby Xenopus laevis, a funkce vytvořeného transportního proteinu jsou zkoumány pomocí elektrofyziologických a izotopových metod. Nicméně ani uvedené moderní metody nepostačovaly k detailnímu objasnění vlastního transportního mechanismu jednotlivých transportních proteinů, zejména pak jakým způsobem je zajištěna selektivita transportu, tedy například proč procházejí otevřeným pórem TRANSPORTNÍ PROCESY 23 v draslíkovém kanálu jen ionty draslíku a nikoli také třeba velmi podobné (dokonce o něco menší) ionty sodíkové. K řešení těchto problémů již nepostačují biochemické či molekulárně biologické metody studia struktury jednotlivých transportních proteinů po jejich separaci z membrán (i to je velmi pracné!), neboť jejich správná konformace a tím i funkčnost je možná jen při jejich přirozeném uložení v membráně. Zde je tedy potřeba aplikovat nedestruktivní biofyzikální metody, např. rentgenovou krystalografii. Nové poznatky, za které vděčíme zejména pracovním skupinám amerických badatelů (Peter Agre a Roderick MacKinnon, oba získali za svoje objevy Nobelovu cenu v roce 2003), se týkají především vysvětlení struktury a funkce iontových kanálů a akvaporínů. Jak je patrné z níže uvedených obrázků, ionty vstupují do kanálu v hydratovaném stavu, ovšem v úseku transportní cesty, označovaném jako „filtr selektivity“, molekuly vody se odpojují. Místo hydratace nastupuje dočasná elektrostatická vazba iontu k aminokyselinovým zbytkům transportního proteinu. Iont je propuštěn kanálem jen v tom případě, že dojde k dokonalé shodě vazebných sil mezi ním a aktivními body ve filtru selektivity, jejichž prostorové uspořádání je specifické pro každý typ iontového kanálu: TRANSPORTNÍ PROCESY 24 Dalším intenzivně zkoumaným problémem je mechanismus zajišťující otvírání a zavírání iontových kanálů (angl. gating), o kterém již byla zmínka na str. 21. Jde zejména o podrobné poznání různých cest přenosu signálu od receptorových proteinů k iontovému kanálu. Jedna z možností je naznačena na následujícím obrázku: Způsob zajištění selektivity při transportu molekul vody akvaporíny byl také dlouho zcela nejasný. Dnes již víme, že tyto transportní proteiny mají filtr selektivity poněkud odlišný od filtrů v iontových kanálech. Akvaporíny propustí pouze ty molekuly, které jsou schopny se dočasně spojit ve stísněném hydrofobním úseku póru s aminokyselinovými zbytky pomocí vodíkových můstků, a které navíc mohou být donorem i akceptorem této vazby. Celý mechanismus je již znám velmi podrobně, a je pochopitelně značně složitější, než jak je schematicky znázorněno na přiloženém obrázku: TRANSPORTNÍ PROCESY 25 Výzkumu akvaporínů je v současné době věnována mimořádná pozornost jak v rostlinné, tak i v živočišné fyziologii, neboť se zjistilo, že jich existuje v každém organismu celá řada typů, a že jsou jisté odlišnostmi nejen ve struktuře, ale i v regulaci jejich tvorby a funkce. Genů kódujících tyto transportní proteiny je známo několik desítek. V membránách se obvykle vyskytují v tetramerních shlucích, ovšem každá ze čtyř částí je samostatnou funkční (transportní) jednotkou. V jednom shluku se nemusí vždy vyskytovat totožné proteiny. Je také zajímavé, že zatímco v živočišných buňkách fungují akvaporíny jako pravé poríny (tedy s trvale otevřeným transportním kanálkem), u rostlin mají schopnost se za jistých okolností uzavírat. Dokonce jsou známy dva možné mechanismy vedoucí k jejich zavření: (1) pod vlivem nedostatku vody v buňce či za vysoké teploty dochází k defosforylaci určitého serinového zbytku (a v důsledku toho pak k zavření kanálku), (2) při anaerobním stresu (při zaplavení kořenů) zprostředkovává zavírací reakci protonace jednoho histidinového zbytku. Tetramerní struktura akvaporínů Transmembránový transport organických látek Uvnitř buňky i mezi buňkami panuje čilá výměna nejen vody a iontů solí, ale i větších organických molekul, včetně proteinů. Tomu musí odpovídat i dokonale fungující transportní systémy, které ale mohou být velmi odlišné nejen u různých vnitrobuněčných struktur, ale i u různých typů buněk. Transport proteinů je zvlášť významný u organel. Velké množství proteinů, které buněčné organely obsahují ve svých vnitřních strukturách, a které ještě navíc potřebují neustále obměňovat, není totiž syntetizováno jejich vlastním aparátem. Především do chloroplastů a mitochondrií musí být velké množství (často více než 50%) proteinů transportováno přes dvojitou membránu z cytosolu. Také přes tonoplast a cytoplazmatickou membránu je transportována řada složitých organických molekul. Transport proteinů přes specifické aktivní přenašeče v membránách je možný pouze v nesloženém (lineárním) tvaru. K udržení nesložené struktury před vlastním transportem a naopak k vytvoření složené funkční konformace molekuly proteinu po transmembránovém transportu je nutná spoluúčast specifických pomocných proteinů označovaných jako chaperony, které se dočasně navazují na transportovaný protein. Udivující je specifita vazby (je nutné rozlišovat mezi stovkami různých proteinů) a přitom u transportních proteinů v membránách chloroplastů a mitochondrií nebyly zjištěny žádné glykoproteiny, jejichž polysacharidové řetězce tuto rozlišovací schopnost u jiných membrán zajišťují. Transport proteinů (i jiných látek) mezi organelami uvnitř buňky je neobyčejně zrychlován prouděním cytoplazmy a váčkovým přesunem na vláknech cytoskeletu. TRANSPORTNÍ PROCESY 26 TRANSPORTNÍ PROCESY 27 Transport cukrů (zejména sacharózy) a dalších nízkomolekulárních organických látek (aminokyselin, amidů, bezdusíkatých organických kyselin, atd.) přes biologické membrány se děje nejčastěji spřaženým transportem s vodíkovými ionty ve specifických přenašečích. Tento sekundárně aktivní transport může být za vysokých koncentrací příslušné látky provázen i pasivním transportem. Zdaleka ne pro všechny metabolity ale musí být v buněčných membránách vhodné transportní proteiny - někdy je nutný rozklad složitějších na jednodušší, transportovatelné složky a jejich resyntéza na opačné straně membrány. V některých případech jsou sice v membránách transportní proteiny pro daný metabolit, ale transport je možný pouze v jednom směru, což obvykle má svoje opodstatnění. Transmembránový transport sekundárních metabolitů, jako např. flavonoidů, anthokyanů, rozkladných produktů asimilačních barviv, alkaloidů a mnoha dalších sloučenin, využívá zvláštní transportní proteiny označované jako ABC přenašeče (angl. ATP - Binding Casette transporters). Jedná se o primárně aktivní transport, přímo využívající ATP jako zdroje energie (nikoli tedy zprostředkovaně přes tvorbu protonového gradientu). Výzkum mechanismu přenosového procesu u transportních proteinů tohoto typu u rostlin je však teprve v začátcích. Radiální a xylémový transport iontů solí Jako radiální transport iontů v kořenech označujeme jejich tok od epidermis až po xylém. Tento tok probíhá stejně tak jako u vody souběžně symplastem i apoplastem, s výjimkou prostupu přes endodermis a exodermis, kde se oba proudy dočasně spojují. Za nízkých koncentrací iontů obvykle převažuje symplastový tok. Jeho rychlost je asi 10 až 60 mm za hodinu, což je podstatně více než rychlost prosté difuze za takového koncentračního spádu, který může v buňkách vzniknout. K rychlejšímu radiálnímu transportu přispívá proudění cytoplazmy. Zrychlený tok vody v apoplastu či symplastu za silně výparných podmínek může také výrazně napomáhat transportu iontů solí. V celém úseku transportu napříč kořenem jsou zřejmě dvě klíčová místa: jednak při vstupu iontů do symplastu (nejčastěji přes plazmatickou membránu buněk pokožky), a potom vstupu iontů do vodivých elementů xylému z parenchymových buněk středního válce sousedících s xylémem. Tedy, jinými slovy, jde o vstup a výstup iontů přes membrány symplastu. Ty ionty, které již v epidermis vstoupily přes plazmalemu do cytosolu, mohou procházet buňkami kůry a středního válce pomocí plazmodezmat, tedy bez přestupu cytoplazmatické membrány dalších buněk. Tento symplastový transport však nutně končí u vodivých elementů xylému, které, jakožto mrtvé struktury, nemají spojení se sousedními buňkami pomocí plazmodesmat. Ionty zde tedy musí podruhé být transportovány přes plazmatickou membránu. V xylému bývá koncentrace solí velmi nízká, a proto při tomto transportu jsou podmínky téměř opačné, než tomu bylo při příjmu z půdního roztoku. Vlastnosti plazmalemy parenchymových buněk hraničících s xylémem musí být tudíž podstatně odlišné od vlastností plazmalemy buněk epidermis a kůry. Existují také důkazy, že regulační signály ovlivňující činnost iontových kanálů a přenašečů v membráně epidermis neovlivňují činnost transportních proteinů v membránách přiléhajících ke xylému. Ty mají zřejmě svůj vlastní regulační mechanismus. Podélný (xylémový) transport iontů solí v cévách a cévicích je již vcelku méně zajímavý. Ionty, stejně tak i některé organické látky transportované z kořenů do nadzemních částí (zejména aminokyseliny), jsou unášeny proudem vody, a tudíž rychlost jejich transportu je zcela závislá na rychlosti toku vody. Stěny cév mají sice mírně negativní náboj a tudíž zde může docházet k elektrostatické vazbě části kationtů. Protože však tato vazba je poměrně slabá a rychle saturovatelná, nemá z dlouhodobějšího hlediska na vedení iontů vliv. Transport látek v lýku (floému) Kromě rychlého dálkového rozvodu roztoků v xylému má rostlina ještě další výkonný a na xylému nezávislý transportní systém - lýko (floém). Stavba i funkce floémové soustavy je zcela odlišná od xylému a proto představa, že hlavní rozdíl mezi těmito dvěma soustavami je jen ve směru proudění (xylémem vzhůru a lýkem dolů), je krajně nesprávná. Jak již víme, xylémový tok probíhá v mrtvých strukturách na základě působení fyzikálních sil a má prakticky vždy vzestupný směr. Floémová transportní soustava obousměrně propojuje všechny orgány rostliny a je proto mnohem univerzálnější než xylémový transport. Tok v lýku má rostlina pod velmi dokonalou kontrolou, neboť je úzce vázán na metabolické procesy. Lýko je tvořeno dlouhými řetězci živých, avšak bezjaderných buněk, sítkovic. Jsou navzájem spojeny hustě proděravělými buněčnými stěnami, označovanými jako sítka. Délka sítkovic je přibližně čtvrt až půl milimetru, pouze u nahosemenných bývají delší (1,5 mm). Při vzniku dospělé sítkovice nejen degeneruje jádro, ale mizí i vakuoly a plazmatická membrána v oblasti sítek. K sítkovicím přiléhá jednak lýkový parenchym, a jednak zvláštní buňky průvodní, které jsou se sítkovicemi propojeny hustou sítí plazmodezmat a tvoří s nimi vlastně jeden funkční celek. Na rozdíl od sítkovic mají průvodní buňky vysokou metabolickou aktivitu (často vyšší než buňky v meristémech!). U některých skupin druhů, zvláště z čeledí hvězdnicovitých (Asteraceae) a bobovitých (Fabaceae), mají průvodní buňky zvlněný (tedy i zvětšený) povrch plazmatické membrány, což lze považovat za důkaz jejich velkého významu pro komunikační spojení lýka s okolními pletivy (laterální transport). Uvnitř sítkovic, kromě nástěnné cytoplazmy, bývají nápadná vlákénka bílkoviny, označované jako P-protein, která se obvykle shlukují v oblasti sítek. Funkce této bílkoviny je stále velmi záhadná. Vzhledem k tomu, že má snadnou schopnost koagulace, může rychle utěsnit otvory v sítku v případě poranění a zabránit tak výtoku cenné floémové tekutiny. Do jaké míry může sloužit také jako regulátor průtoku, eventuálně jako součást obranného mechanismu proti patogenům, není dosud jednoznačně dokázáno. Stavba sítkovic a jejich těsná vazba na průvodní buňky v lýku. Složení roztoků transportovaných ve floému je nejen druhově specifické, ale mění se i v závislosti na rychlosti růstových a metabolických procesů. Vždy však převažují neredukující cukry, z nichž bývá nejhojnější sacharóza. Její koncentrace může dosahovat až 150 g l-1 . Dále bývají hojně zastoupeny aminokyseliny (až 15 g l-1 , zejména kyselina glutamová, asparagová a serin) i jiné organické kyseliny, ale také např. ATP a fytohormony. Ve floémové šťávě lze často zjistit i ionty anorganických solí (např. K+ , Na+ , Ca2+ , Mg2+ , z aniontů zejména fosfáty). TRANSPORTNÍ PROCESY 28 TRANSPORTNÍ PROCESY 29 Sítkovice se udržují ve funkčním stavu zřídka déle než jednu vegetační sezónu, pokud ovšem je zachována kambiální aktivita. Ve starých nefunkčních sítkovicích se hromadí polysacharid kalóza, který slouží k jejich dokonalému utěsnění. Kalóza může být produkována i v mladých funkčních sítkovicích, a to jednak při jejich poranění, ale i v důsledku působení některých stresových faktorů (např. za vysoké teploty). Popis vlastního mechanismu floémového toku lze rozdělit na tři hlavní otázky: (1) co je hybnou silou celého toku, (2) jakým způsobem je řízen vstup látek do sítkovic (tzv. naplňování zdrojové části lýka), (3) jakým způsobem je řízen výstup („odběr“) látek ze sítkovic na místě jejich potřeby. Z vysokých rychlostí floémového toku (přibližně 1 m h-1 ) je zřejmé, že nemůže jít o prostou difuzi ani o přenos zrychlený prouděním cytoplazmy, který je běžný v jiných symplastových strukturách, neboť jeho rychlost bývá jen několik centimetrů za hodinu. Skutečnost, že lýko je tvořeno živými buňkami, vedla k intenzivnímu zkoumání dalších možností aktivního transportu v lýku, energeticky zásobeného především z průvodních buněk po celé délce floémové soustavy. Vycházelo se přitom z domněnky, že transport přes otvory v sítkách (po jejich vyplnění P-proteinem) může probíhat pouze za dodávání metabolické energie. Tato domněnka se nepotvrdila. Bylo naopak prokázáno, že u funkčních sítkovic jsou u většiny druhů rostlin sítka natolik volná, že umožňují hromadný tok. V neprospěch uvedené představy aktivního transportu svědčí také skutečnost, že uměle navozená inhibice metabolismu sítkovic a průvodních buněk (např. nízkou teplotou či chemickým blokováním enzymů ve stonku a v řapících listů, ne však v oblasti zakončení lýka!), nemá obvykle větší vliv na rychlost toku. V současné době se pro vysvětlení mechanismu transportu roztoků v lýku uznává jako nejpravděpodobnější teorie tlakového toku, která byla vypracována již ve dvacátých letech tohoto století, a od té doby bylo nasbíráno hodně důkazů na její podporu. Podle této teorie není nutné uvažovat o aktivním podílu všech sítkovic na transportu. Hromadný tok je dán tlakovým rozdílem mezi začátkem a koncem celé transportní cesty. Rozdílného tlaku je dosaženo propojením odlišných osmotických systémů. Ten první je umístěn u zdroje asimilátů (tedy obvykle v listech) a druhý na místech jejich spotřeby (v kořenech a v jiných energeticky nesamostatných orgánech či úložištích asimilátů). Asimiláty se hromadí ve zdrojovém zakončení floému, což je provázeno osmotickým vtokem vody do sítkovic ze sousedních buněčných stěn, které jsou napájeny xylémovým proudem. Vzniklý tlak (až 2,5 MPa) vede k toku tekutin na opačnou stranu floémových drah, kde je tlak nižší. V tomto druhém osmotickém systému dochází k výstupu rozpuštěných látek i vody. Výstup vody je dán vyšším vodním potenciálem vody v sítkovicích ve srovnání s vodou v apoplastu, a je nutnou podmínkou udržení stálého toku. V místech největšího odběru cukrů z floému se udržuje jejich poměrně vysoká koncentrace v apoplastu, což vede nejen ke tlakově, ale i osmoticky podmíněnému výstupu vody ze sítkovic. Část asimilátů je odebírána z lýka i v průběhu toku. V lýku se tedy udržuje stálý spád koncentrace osmoticky aktivních látek i spád hydrostatického tlaku od zdrojové části (začátek transportu) po místa spotřeby (zakončení transportu). Rychlost floémového toku závisí v prvé řadě na fungování osmotického systému v listech (= u zdroje asimilátů). Výkon tohoto systému je dán rozdílem vodního potenciálu mezi symplastem (koncentrovaný roztok na začátku floému) a apoplastem (zředěný xylémový roztok v buněčných stěnách). Popsaná teorie tlakem řízeného toku má i svoje slabá místa, která čekají na vysvětlení. V prvé řadě není jasné, proč jsou vodivé elementy lýka živé buňky s komplikovanou stavbou sítek, když pro čistě tlakový mechanismus transportu by lépe vyhovovaly mrtvé buňky, jak je tomu u xylému. Nejsme si také zatím jisti, zda tlakovou teorií lze vysvětlit floémový tok u nahosemenných (Gymnospermae). U této skupiny rostlin bývají sítka v sítkovicích pravidelně potažena membránami typu hladkého endoplazmatického retikula a není tedy vůbec jasné, zda a do jaké míry je vůbec možný hromadný tok. Znázornění hlavních rysů teorie tlakového toku tekutin v lýku v důsledku součinnosti dvou osmotických systémů (blíže viz text). Naplňování lýka (angl. phloem loading) je proces při kterém dochází k hromadění cukrů a dalších látek ve floému v blízkosti asimilujících buněk mezofylu do koncentrace, která je podstatně vyšší (až 40x) než v okolních buňkách zdrojového mezofylu. Tento proces zůstával po dlouhou dobu nevysvětlen. Na první pohled bylo zřejmé, že se sotva může jednat o transport čistě symplastovou cestou (přes plasmodesmata až do sítkovic), neboť v tom případě by nebylo možné zachovat tok rozpuštěných látek z nižší koncentrace do vyšší. To lze zajistit jen při energeticky dotovaném aktivním transportu přes membrány. Membránový transport cukrů se děje symportem s H+ ionty, které jsou zpětně přenášeny protonovými pumpami. Uvažovalo se tedy, že symplast lýka (sítkovice s průvodními buňkami) není propojen s okolním mezofylem plně funkčními plasmodesmaty, a že ze symplastu mezofylu přestupují cukry (převážně sacharóza) přes plazmalemu do apoplastu (do buněčné stěny a do mezibuněčných prostor) a odtud, opět přes membránu, do průvodních buněk a sítkovic (tzv. apoplastová cesta naplňování lýka). Novější výzkumy dokázaly, že k tomu tak skutečně u velkého počtu druhů rostlin dochází, ale zdaleka ne u všech. U některých taxonomických skupin rostlin (zejména evolučně starších, včetně mnoha druhů stromů a keřů) nebyl prokázán přestup cukrů do apoplastu, ale pouze přímý tok plasmodesmaty z mezofylových buněk až do lýka, který, jak jsme již naznačili, by teoreticky neměl být možný. Tato čistě symplastová cesta je ovšem podmíněna jedním zásadním požadavkem: transportovaná sacharóza se musí v průvodních buňkách lýka přetvořit na složitější cukry s větší molekulou (např. na rafinózu či stachyózu), jejichž transport plasmodesmaty zpět do mezofylových buněk není možný. Jedná se tedy o jakousi „polymerační past“, která umožňuje hromadění cukrů v lýku i bez účasti aktivního transmembránového transportu. Významnou úlohu zde ovšem také hrají strukturní a funkční TRANSPORTNÍ PROCESY 30 vlastnosti plasmodesmat, které musí být schopny účinně zabránit zpětnému transportu molekul rafinózy. Stavba a funkce plasmodesmat je v současné době intenzivně studována, neboť jejich zmíněné schopnosti selektivní regulace mezibuněčného transportu látek byly sice mnohokrát pozorovány, ale chybělo vysvětlení možného mechanismu. Dnes již víme, že regulační schopnosti má především oblast krčku – depolymerací aktiniových vláken se může zvýšit průměr transportovaných částic z běžných 1,5 - 2 nm až na 10 nm (tedy pak projdou molekuly až do velikosti 20 kDa!), ovšem na druhé straně je možné silné přivření až zavření kanálu v oblasti krčku. Navíc právě tam byla dokázána přítomnost zvláštních proteinů, které mohou hrát roli selekčních filtrů vylučujících z transportu některé látky. TRANSPORTNÍ PROCESY 31 Směrování transportu a výstup látek z lýka jsou v současné době intenzivně studované procesy, a to zejména pro jejich možné praktické využití. Pokud bychom například dokázali vhodnými zásahy (chemickými regulátory, genovou manipulací) lépe usměrňovat toky asimilátů do zásobních orgánů či do semen zemědělsky významných plodin, mělo by to nepochybně velký význam pro zvýšení jejich výnosů. Bohužel tak daleko ještě nejsme, protože naše základní poznatky o regulačních mechanismech floémového transportu jsou stále nedostatečné. Již dosti dlouho bylo známo, že z téhož místa (např. z určitého listu) mohou být jednotlivé typy sloučenin, současně vstupující do lýka, transportovány do odlišných orgánů. Tedy např. sacharóza převážně do kořenů, aminokyseliny do mladých listů, atd. Pozdější přesná měření ale dokázala, že tento zdánlivě směrovaný transport není dán existencí specifických transportních drah (tedy rozdílně směrovaných izolovaných sítkovic, které spojují jen některá místa). Elementy lýka jsou obvykle dosti složitě pospojovány (nejen podélně, ale i příčně), a na mnoha místech dochází k přestupu transportovaných látek do apoplastu a jejich resorpci zpět do lýka. To vše umožňuje směrově velmi plastický pohyb (svým způsobem cirkulaci) transportovaných látek po celé rostlině. Preferenční zásobení určitého orgánu určitou sloučeninou je obvykle dáno větší schopností „odběru“ dané látky z floémové tekutiny v daném místě. Mechanismy řídící výstup rozpuštěných látek z lýka jsou známy dosud nedostatečně. Principiálně jsou opět možné dvě rozdílné cesty, apoplastová a symplastová, tedy obdobně jak u naplňování lýka. Symplastová cesta výstupu je častější a je podmíněna značnou selektivitou a regulačními schopnostmi plasmodesmat. Přesnější údaje o regulaci rychlosti „odběru“ látek z lýka v určitém orgánu máme jen pro některé typy sloučenin, především pro sacharózu. Bylo zjištěno, že zcela zásadní úlohu má v tomto případě aktivita enzymu invertázy v těsné blízkosti lýka, která štěpí sacharózu na glukózu a fruktózu. Tyto redukující monosacharidy již nemohou být dále transportovány lýkem, ani do něho nemohou vstupovat, neboť v membránách sítkovic a průvodních buněk nejsou pro ně transportní proteiny. Naopak, nerozložená sacharóza vstupuje zpět do lýka velmi snadno protože sacharózových přenašečů je v membránách dostatek. Orgán, který má v jisté fázi vývoje nároky na zásobení sacharózou, začne pro zvýšení jejího odběru z lýka vytvářet více invertázy. Výzkumu podnětů a procesů spojených s regulací tvorby a aktivity různých typů invertáz (existuje jich celá početná skupina!) je nyní věnována zvláště velká pozornost. TRANSPORTNÍ PROCESY 32 TRANSPORTNÍ PROCESY 33 Metody pro stanovení látek vedených lýkem. Při studiu floémového transportu nás zdaleka nezajímá pouze jeho rychlost a směr (ty se nejčastěji určují pomocí stabilních či radioaktivních izotopů), ale také chemické složení a koncentrace transportovaných látek. K tomu však potřebujeme získat vzorky floémové tekutiny. Po naříznutí sítkovic se floémový tok velmi rychle zastavuje, takže tímto způsobem nelze odběry provádět. Naštěstí máme nyní k dispozici jinou, velmi účinnou metodu odběru, využívající savého hmyzu. Původně byla používána v entomologii k analýze potravy mšic, dnes je z ní ovšem rutinní metoda rostlinné fyziologie. Sající mšici, která svým sosákem proniká do sítkovice, nejprve zmrazíme (pevným CO2) a pak její tělo oddělíme tak, aby sosák zůstal v rostlině. Díky stálému přetlaku ve floému (2 až 3 MPa) nám ze zbytku sosáku po dlouhou dobu vytéká tekutina k analýze (asi 1 µl za hodinu). Další neméně vtipná metoda byla vymyšlena pro práci s bobovitými rostlinami. V mladém lusku vyřízneme okénko, abychom měli přístup k tvořícímu se semeni. U něho pak nařízneme vnější obal a vyjmeme embryo. Místo po embryu se vyplní rozehřátým agarem. Asimiláty z floému se do rostoucího embrya dostávají apoplastovou cestou přes endothel (protože floém není s embryem propojen), a tudíž velmi snadno difundují i do agaru. Agar pak ve vhodnou dobu vyjmeme a analyzujeme. Transport plynů v rostlinách a výměny s atmosférou Kromě transportu vody, iontů solí a organických látek jsou s životem rostliny spojeny i důležité výměny plynů. Veškerý uhlík, který je základem pro stavbu organických látek, přijímá rostlina ze vzduchu ve formě oxidu uhličitého. Nezbytný je i příjem kyslíku pro uvolňování chemické energie v respiračních procesech. Podle toho, zda převažují asimilační nebo disimilační procesy, může se směr transportu obou těchto plynů měnit. Třetí významnou plynnou složkou, jednosměrně vystupující z rostliny je vodní pára. Denní úhrn transportované vodní páry je obvykle více než stokrát větší než množství kyslíku a oxidu uhličitého. Některé další plyny transportované v rostlinách (např. endogenní etylen a amoniak) jsou z kvantitativního hlediska již mnohem méně významné. Hlavní cesty a mechanismus transportu plynů Plyny se mohou pohybovat v rostlině systémem vzájemně propojených mezibuněčných dutin naplněných vzduchem (interceluláry), které se obvykle vyskytují ve všech orgánech. V pletivech bez vzdušných intercelulár a uvnitř buněk je transport plynných látek možný pouze po jejich rozpuštění ve vodě. Tok plynů je udržován buď samovolným pohybem molekul po koncentračním spádu (difuze), nebo nuceným prouděním po spádu tlaku (hromadný tok). Difuze je pro transport plynů v rostlinách mnohem významnější než pro pohyb částic v roztocích. Jednak proto, že v intercelulárách se jen zřídka vyskytují větší rozdíly tlaku, vedoucí k hromadnému toku, ale hlavně proto, že difuze v plynném skupenství je zhruba desettisíckrát rychlejší než v roztocích. Podle prvního Fickova zákona platí, že rychlost difuzního toku (Jn, počet molů látky n, které projdou jednotkovou plochou za jednotku času) je úměrná koncentračnímu gradientu (δCn/ δx): Jn = -Dn. δCn/δx kde Dn je difuzní koeficient pro látku n je závislý na teplotě a některých dalších faktorech prostředí. Difuze probíhá od vyšší koncentrace k nižší, proto je výraz (podle zavedené konvence) záporný. Po úpravě uvedeného vztahu pro měřitelný rozdíl koncentrací (∆Cn) na místech od sebe vzdálených o ∆x dostáváme: ∆Cn Dn Jn = Dn ∆x = ∆x ∆Cn TRANSPORTNÍ PROCESY 34 Podíl Dn/∆x nazýváme difuzní vodivost pro látku n a označujeme ji zjednodušeně jako gn. Její převrácená hodnota (1/gn) se označuje jako difuzní odpor pro látku n (rn): Dn Jn 1 gn = ∆x = ∆Cn = rn Používané jednotky: J [mol.m-2 .s-1 ], C [mol.m-3 ], x [m], D [m2 .s-1 ], g [m.s-1 ], r [s.m-1 ]. Hodnoty difusní vodivosti mohou být také vyjadřovány v jednotkách [mol.m-2 .s-1 ], přičemž platí: 8,314.T g [m.s-1 ] = g [mol.m-2 .s-1 ]· pa kde T je absolutní teplota a pa je tlak vzduchu během měření . Hodnoty difuzního koeficientu jsou specifické pro jednotlivé plyny, např: CO2 D = 1,51.10-5 m2 .s-1 kyslík D = 1,95.10-5 m2 .s-1 vodní pára D = 2,42.10-5 m2 .s-1 Z uvedených příkladů je zřejmá závislost D na molekulové hmotnosti plynů - vyšší hodnota D u menších molekul znamená jejich rychlejší tok (za stejného rozdílu koncentrací). Nejmenší problémy bývají s transportem kyslíku. Jeho obsah ve vzduchu (přibližně 21 objemových %) je natolik velký, že i při omezených difuzních cestách (zavřené průduchy v listech, nebo u orgánů s epidermis bez průduchů) netrpí rostliny jeho nedostatkem. Kyslík poměrně snadno proniká kutikulou, buněčnými stěnami i membránami, mnohem pomaleji však proniká roztoky v pletivech. Hlavním místem spotřeby jsou mitochondrie a peroxisomy. U listů s aktivní fotosyntézou obvykle kyslík vznikající při fotolýze vody pokrývá potřeby respiračních procesů, či dokonce bývá nadbytek odváděn do atmosféry. Jisté potíže s transportem kyslíku mohou vzniknout pouze u rostlin, jejichž kořeny rostou v anaerobním prostředí (mokřady, zaplavené či zhutnělé půdy). U těchto rostlin mívají kořeny zvláště bohatě vyvinut systém intercelulár (až 70% plochy na příčném průřezu), zajišťující dostatečně rychlou difuzi kyslíku na vzdálenost několika desítek centimetrů. U některých vodních rostlin (např. čeledi stulíkovitých) byl objeven mechanismus vyvolávající hromadný tok vzduchu do submerzních částí (cirkulace řapíky různě starých listů v závislosti na změnách jejich teploty). Existují důkazy, že k hromadnému toku kyslíku do kořenů zaplavených rostlin (např. rýže) může docházet také v souvislosti s rozpouštěním oxidu uhličitého ve vodě. Pokud totiž není ten objem kyslíku, který se spotřebovává při dýchání, nahrazen stejným objemem CO2 (tedy v případě úniku CO2 do vody v okolí kořenů), pak v intercelulárách kořenů vzniká podtlak vedoucí k hromadnému toku vzduchu z nadzemních částí spojených s atmosférou. Transport oxidu uhličitého, který je produkován ve všech živých částech rostliny při aerobních respiračních procesech, je možné rozdělit na dvě fáze. Tou první je transport ve vodním prostředí (cytosol a hydratované buněčné stěny) a druhou pak difuze ve vzduchem naplněném prostoru intercelulár. Ve vodním prostředí je CO2 nejen rozpuštěn, ale část molekul reaguje s vodou za vzniku kyseliny uhličité, která při pH nad 4,5 rychle disociuje na hydrogenuhličitanové ionty. I malé zvýšení pH v buňce značně snižuje poměr mezi obsahem volně rozpuštěného CO2 a vázaného ve formě HCO3 iontů. Transport CO2 ve vzduchu naplňujícím interceluláry a přestup přes epidermis s kutikulou je obvykle velmi rychlý, neboť koncentrace CO2 vytvořená v intercelulárách respirací je poměrně vysoká (řádově několik objemových procent), zatímco ve vzduchu v okolí rostliny je velice nízká (0,036 objem. %), a tím i koncentrační spád, na kterém je závislá rychlost difuse je příznivě vysoký. U listů s probíhající fotosyntézou zdaleka nestačí výdej oxidu uhličitého z respiračních procesů (ty běží stále, i na světle!) krýt jeho spotřebu v asimilačních procesech. Je tedy nutný transport CO2 do listu, což je spojeno s řadou vážných problémů. Vzhledem ke zmíněné nízké koncentraci CO2 ve vzduchu je rychlost difuze obvykle nedostatečná k plnému uspokojení potřeby syntetických procesů. Rychlost difuze CO2 do listu je tedy vážným limitujícím faktorem celkové rychlosti fotosyntézy a je jí proto při fyziologických výzkumech věnována velká pozornost. Čím je vlastně omezována rychlost toku CO2 do listu? Pokud je kapacita biochemického zpracování CO2 v buňce vysoká a koncentrace CO2 ve vzduchu okolo listu konstantní, pak rozhodující slovo má vodivost difuzních cest, neboť koncentrační spád zůstává stejný. Naprostá většina CO2 vstupuje do listů průduchy, které jsou nejužším místem difuzní cesty a proto také nejvíce rozhodují o rychlosti difuze. Šířku průduchových štěrbin (a tím tedy i vodivost pro difuzi CO2) může rostlina ve značném rozmezí aktivně řídit. Funkci průduchů si v dalším textu podrobněji popíšeme, stejně tak jako metody, při kterých stanovení rychlosti toku CO2 využíváme k odhadu rychlosti fotosyntézy a respirace. Transport vodní páry je prakticky vždy jednosměrný, z rostliny do atmosféry, neboť vzduch v intercelulárách považujeme za téměř nasycený vodní parou. Teoreticky ovšem transport vodní páry ze vzduchu do rostliny možný je - např. u silně vyschlých či podchlazených orgánů ve vlhkém prostředí. To jsou však opravdu vzácné případy. Dráha difuze molekul vodní páry z rostliny bývá velmi krátká a gradient koncentrací obvykle neobyčejně velký - z toho vyplývá i velká rychlost difuzního toku. Gradient koncentrace či parciálního tlaku vodní páry mezi vzduchem a listem je nejen vyšší, ale i podstatně proměnlivější než tomu je u CO2. Na tomto kolísání se podílejí jak změny parciálního tlaku vodní páry ve vzduchu, tak i v listu, a to především pro jeho silnou závislost na teplotě. Teplota vzduchu i listů se mění v průběhu dne často nestejným způsobem, avšak každé zvýšení teploty (jak vzduchu, tak i listů) vede obvykle k prudkému zvýšení gradientu koncentrace vodní páry. Transport vodní páry z rostliny je možný všemi jejími částmi, ovšem daleko nejvýznamnější, tak jako v případě CO2, je opět u listů. Orgány ve kterých neprobíhá fotosyntéza mohou mít povrch pokrytý souvislou kutikulární vrstvou s voskovými impregnacemi, která velmi zpomaluje rychlost difuze vodní páry. Asimilující orgány se však TRANSPORTNÍ PROCESY 35 takto trvale uzavírat nemohou. Pro zajištění dostatečného přísunu CO2 ke chloroplastům je žádoucí, aby list kladl co nejmenší odpor difuznímu toku. Rostlina je tedy postavena před dilema, jak získat co nejvíce CO2 a přitom ztratit co nejméně vody. Stavba a funkce průduchového aparátu je příkladem velmi dokonalého optimalizačního řešení tohoto problému. Průduchová regulace výměny plynů Všechny orgány vyšších rostlin, ve kterých probíhá fotosyntetická asimilace CO2 mají v epidermis pravidelně rozmístěny zvláštní párové buňky, označované jako buňky svěrací. Ty části buněčné stěny, kterými se obě svěrací buňky spolu stýkají, nejsou srostlé, ale vytvářejí průduchovou štěrbinu, která v otevřeném stavu zásadním způsobem usnadňuje výměnu plynů mezi vzduchem v intercelulárách a okolní atmosférou. Kdybychom sečetli plochu otevřených průduchových štěrbin, zjistili bychom, že tvoří sotva jedno procento z celkové plochy listu. Rychlost difuzního toku plynů průduchovými štěrbinami však může být mnohem větší, než bychom očekávali - zhruba asi jako kdyby polovina plochy listu nebyla vůbec pokryta epidermis. Navíc velikost průduchové štěrbiny může rostlina aktivně a zcela spojitě měnit od stavu úplného uzavření až po plné otevření, průduchy jí tedy dávají možnost velmi dokonale řídit rychlost výměny plynů s okolím. Svěrací buňky průduchů při růstu listů sice vznikají ze stejného meristematického základu jako ostatní epidermální buňky, avšak při diferenciaci získávají zcela jiné strukturní znaky. Nejde jen o na první pohled zjevné tvarové rozdíly a zvláštní zesílené části buněčné stěny. Na rozdíl od běžných buněk pokožky mají vždy dobře vyvinuté chloroplasty, které však téměř neobsahují karboxylační enzym Rubisco. Zato v cytosolu je hojně přítomen jiný karboxylační enzym, PEP karboxyláza. Mají velký počet mitochondrií s vysokou aktivitou citrátového cyklu. Svěrací buňky nejsou propojeny se sousedními buňkami pomocí plasmodesmat, zato mají s nimi velmi dokonalé spojení pomocí transportních proteinů v plasmatické membráně. Všechny tyto zvláštní znaky stavby svěracích buněk podmiňují jejich správnou funkci. Mechanika pohybů průduchů je známa velmi dobře. Otevírání průduchové štěrbiny je způsobeno transportem vody z buněk listového mezofylu do svěracích buněk, tedy zvětšením jejich objemu. Tím, že ve stěnách svěracích buněk převažuje příčná (radiální) orientace celulózových vlákének (micel), nemají tyto buňky po příjmu vody tendenci zakulacovat svůj tvar (a tím tedy uzavírat štěrbinu), ale spíše protahovat se do délky. Vzhledem k pevnému ukotvení konců svěracích buněk do buněčných stěn sousedních buněk je výsledkem protahování jisté prohnutí ("vyboulení") svěracích buněk bočním směrem. Tím se štěrbina rozevírá. Toto základní schéma může být poněkud modifikováno u rostlin s atypickou morfologií svěracích buněk, např. u trav dochází ke zvětšení objemu pouze v rozšířených koncích svěracích buněk. Přivřený a plně otevřený průduch (nahoře). Vlevo dole je znázorněno příčné uložení celulosových (micel) v buněčných stěnách svěracích buněk, vpravo příčný řez svěracími buňkami v otevřeném a zavřeném stavu. TRANSPORTNÍ PROCESY 36 TRANSPORTNÍ PROCESY 37 Vysvětlením mechaniky pohybů jsme však teprve na úplném začátku řetězce příčin a následků. Čím je způsoben náhlý příjem vody do svěracích buněk při otvírací reakci? Bylo dokázáno, že jde o příjem vyvolaný zvýšením osmotického tlaku ve svěracích buňkách, a to v důsledku rychlého přesunu iontů draslíku. Náhlý tok draslíkových iontů do svěracích buněk je ovšem závislý na otevření iontových kanálů pro draslík v plazmatické membráně, a současně na stimulaci protonových pump, jejichž aktivitou dochází k přesunu vodíkových iontů na vnější stranu plazmatické membrány. Chybějící vodíkové ionty v cytosolu svěracích buněk jsou doplňovány disociací organických kyselin, především kyseliny jablečné a citrónové, jejichž tvorba z rezervních sacharidů je rovněž stimulována (= biochemický pHstat umožňující zachovat optimální pH pro enzymatické procesy v cytosolu). Vytvořený vysoký elektrochemický potenciál nahromaděním protonů v buněčné stěně je podmínkou rychlého difusního toku iontů K+ do cytosolu svěracích buněk. Přesun iontů draslíku bývá někdy provázen i přesunem jistého množství chloridových iontů. Při zavírací reakci průduchů je aktivita protonových pump inhibována, ale současně dochází k aktivaci membránových proteinů pro export malátových aniontů ze svěracích buněk. Tím dojde k depolarizaci plazmatické membrány a k samovolnému transportu iontů draslíku z cytosolu svěracích buněk do buněčné stěny a do buněk vedlejších. Stejným směrem začne osmoticky difundovat i voda, turgorový tlak se sníží a průduch se zavře. Existence malátového přenašeče v membránách svěracích buněk a jeho klíčová významnost pro zavírací reakci průduchů byla objevena teprve v roce 2008. Jaký signál však spouští celý otvírací a zavírací mechanismus do pohybu? Výsledkem mnohaletého usilovného hledání způsobu řízení pohybů průduchů je zjištění, že neexistuje jediný signál či řídící okruh, ale u každé rostliny je jich vždy několik a na zcela odlišných principech, ale působících často současně v koordinované souhře. Světlo (viditelné záření) je zcela evidentně jedním z významných signálů. Za tmy jsou průduchy u většiny rostlin uzavřeny (výjimku tvoří jen některé sukulentní rostliny metabolickou cestou CAM, ke kterým se ještě vrátíme v kapitole o fotosyntéze). Po osvětlení však dochází k rychlému otevírání. Vysvětlit přenos tohoto signálu však není jednoduché. Podle dřívějších představ měl být vliv světla zprostředkován jeho absorbcí v chlorofylu a posléze sníženou koncentrací CO2 v intercelulárách v důsledku aktivované fotosyntézy. Dnes však víme, že kromě tohoto nepřímého mechanismu může světlo působit na pohyby průduchů také přímo, nezávisle na fotosyntéze. Největší účinek má světlo modré (o vlnové délce 430 až 460 nm), které aktivuje činnost protonových pump v plazmatické membráně svěracích buněk. Tato aktivace je zprostředkována flavoproteinovým pigmentem označovaným jako kryptochrom, který je vázán v plazmatické membráně svěracích buněk. Koncentrace CO2 ve vzduchu v intercelulárách má neobyčejně významný vliv na pohyby průduchů (za nízké koncentrace se otvírají, vysoká naopak vede k zavírání). Koncentrace CO2 bývá velmi často hlavním řídícím signálem, a to především za nízkých a kolísavých hodnot záření, kdy se otvírání průduchů může v podstatě zpětnovazebně řídit rychlostí spotřeby CO2 ve fotosyntéze. Do jaké míry se na tomto řízení podílí i fotosyntéza přímo ve svěracích buňkách, není ještě bezpečně prokázáno - existuje řada prací svědčících pro, ale i proti. Nicméně změny koncentrace CO2 v intercelulárách vyvolávají pohyby průduchů i za tmy, což je důkazem, že musí existovat řídící mechanismus nezávislý na fotosyntéze. Nedostatek vody v listu (vodní deficit), provázený poklesem vodního potenciálu a turgoru, způsobuje za i jinak příznivých okolností (dostatek světla, potřeba dodávat CO2 pro fotosyntézu) zavírání průduchů, neboť ochrana listu před nadměrnou ztrátou vody má prioritu před maximalizací toku CO2 pro fotosyntézu. Jak již víme, průduchy se udržují v otevřeném stavu díky vysokému turgoru svěracích buněk a tak není obtížné si představit jejich pasivní zavření v důsledku většího snížení obsahu vody, a tím i ztráty turgoru, ve všech buňkách listu. TRANSPORTNÍ PROCESY 38 Existuje však ještě jiný, citlivější způsob reakce na nedostatek vody, který umožňuje rostlinám zavírat průduchy mnohem dříve, než dojde k větší ztrátě vody. Jde o reakci zprostředkovanou kyselinou abscisovou, která je jedním z důležitých fytohormonů. Kyselina abscisová se uvolňuje z mezofylových buněk již při velmi mírném poklesu jejich turgoru a je vedena ke svěracím buňkám. Působením kyseliny abscisové dochází k inhibici činnosti protonových pump, ovšem zprostředkovaně, pomocí vnitrobuněčných druhotných mediátorů, ke který patří v prvé řadě ionty vápníku. Koncentrace iontů vápníku ovlivňuje v buňce rychlost enzymově řízených reakcí (např. fosforylace), na nichž je závislá činnost protonových pump v membránách, a tudíž i rychlost transportu K+ do svěracích buněk. Je zajímavé, že ke zvýšení koncentrace kyseliny abscisové v listech (a tím i k zavírání průduchů) může dojít i jejím transportem z jiných orgánů, zejména z kořenů. Začínající nedostatek vody v půdě (ale i některé jiné stresové podněty, např. zasolení či nedostatek kyslíku) indukují v kořenech syntézu kyseliny abscisové, která je xylémovým tokem rychle transportována do listů. K zavírání průduchů tímto mechanismem může tedy dojít i za stavu, kdy listy mají ještě vody dostatek, tedy v předstihu před hrozícím nedostatkem. Vysoká citlivost průduchů na vlhkost vzduchu u některých druhů byla objevena poměrně nedávno. Velmi nízký parciální tlak vodní páry ve vzduchu okolo listu vede k zavírání průduchů zcela nezávisle na stavu vody v listu (i při plném nasycení listových pletiv!). Jde tedy o další velmi citlivý regulační mechanismus k včasnému zabránění ztrát vody, kromě popsané regulace pomocí kyseliny abscisové. Pokles vlhkosti vzduchu při otevřených průduších znamená vždy velké zvýšení výparu vody z listů a díky rychlé reakci průduchů lze těmto ztrátám zabránit hned v samém počátku. To je zvláště důležité pro rostliny, které mohou jen velmi obtížně a zřídka doplňovat ztracenou vodu (např. epifyty). U rostlin které mají zajištěno trvalé zásobení vodou z vlhké půdy není přímá reakce průduchů na koncentraci vodní páry ve vzduchu ani příliš významná, ani prospěšná. Unáhleným zavřením průduchů by se totiž zbytečně zkracovala doba příznivá pro rychlý příjem CO2. Závěrem tedy můžeme shrnout, že kromě přímého vlivu světla na otvírání průduchů existují ještě nejméně dva další účinné regulační systémy se zpětnou vazbou. První je řízen koncentrací CO2 v intercelulárách a zajišťuje tok CO2 přiměřený potřebám fotosyntézy, druhý systém řízený stavem vody v pletivech (s přenosem signálů pomocí kyseliny abscisové) přizpůsobuje tok vodní páry z listu možnostem příjmu vody rostlinou a chrání ji před nadměrnou ztrátou. Měření rychlosti výměny plynů a vodivosti průduchů Měření rychlosti výměny plynů (O2, CO2, vodní pára) je nejčastěji založeno na stanovení změn jejich koncentrace ve vzduchu v těsné blízkosti rostliny. Technicky nejschůdnější řešení spočívá v uzavření rostliny (častěji však jen její části, např.listu) do průhledné komůrky. Změny koncentrace plynů měříme buď v protékajícím vzduchu (otevřený systém, určujeme rozdíl v koncentraci před vstupem do komůrky a po výstupu), nebo v cirkulující smyčce (uzavřený systém, vyhodnocujeme rychlost poklesu či vzestupu koncentrace). Komůrka musí být konstruována tak, aby bylo možno řídit podmínky prostředí uzavřeného orgánu (teplotu, ozářenost, ventilaci). Pro analýzu plynů je k dispozici řada přesných analyzátorů a čidel (kyslík: paramagnetické analyzátory, čidla Clarkova typu. CO2: analyzátory infračerveného záření. Vodní pára: psychrometry, kapacitní čidla, měřiče rosného bodu, aj.). Rychlost výdeje vodní páry z rostlin můžeme také určovat z úbytku jejich hmotnosti krátce po odříznutí. Zjednodušené schéma aparatury pro měření rychlosti výměny plynů u rostlin. Pro měření difuzní vodivosti průduchů se používají přístroje označované jako difusní porometry. Základním principem je přesné stanovení rychlosti výdeje vodní páry z uzavřené části rostliny (z kontinuálního měření vlhkosti vzduchu v komůrce) a dále z měření teploty vzduchu a objektu (obvykle listu) v komůrce. Pak lze vypočítat za pomoci fyzikálních vztahů či tabulek i rozdíl mezi koncentrací vodní páry uvnitř listu (es , je považována za nasycenou při dané teplotě listu) a v okolním vzduchu (ea). Tok vodní páry z listu (JVP) lze vypočítat z měřené rychlosti vzestupu vlhkosti vzduchu v komůrce. Jak již bylo uvedeno na začátku této kapitoly, obecně pro rychlost difuzního toku platí, že je přímo závislý na rozdílu koncentrací a na difuzní vodivosti. Rychlost toku vodní páry z listu je tedy: JVP = (es - ea) gVP Difuzní vodivost epidermis pro vodní páru (gVP) lze tudíž vypočítat: JVP gVP = es - ea Při této metodě není stanovena pouze vodivost průduchů, ale celé epidermis, tedy i kutikuly. Ta je ovšem ve srovnání s vodivostí otevřených průduchů zanedbatelně malá (více než stokrát menší). Difuzní vodivost epidermis listů pro CO2 (gCO2) můžeme odvodit z vodivosti pro vodní páru (gVP), stanovené popsaným způsobem. Není s ní ovšem nikdy totožná. Molekuly CO2 mají totiž větší hmotnost než molekuly vodní páry, a proto i menší hodnotu difuzního koeficientu (difuze je pomalejší). Je proto nutné hodnoty gVP snížit úměrně ke vzájemnému poměru difuzních koeficientů: DCO2 gCO2 = gVP DVP = 0,62 gVP Ještě jeden rozdíl v rychlosti difuze musíme vzít v úvahu. Při difuzi CO2 do listu současně difunduje vodní pára z listu, přičemž počet vystupujících molekul vodní páry je až tisíckrát větší než počet vstupujících molekul CO2. Tím je rychlost difuze molekul CO2 poněkud zpomalena (až o 15%). Pro přesné výpočty je tedy nutné provést vhodnou korekci. TRANSPORTNÍ PROCESY 39 TRANSPORTNÍ PROCESY 40 Kontrolní otázky k 1. části učebního textu Fyziologie rostlin 1. Jak je definován vodní potenciál a jaké dílčí složky určují jeho celkovou hodnotu? 2. Rostlinné buňky se sice chovají jako osmotický systém, ale ne zcela dokonalý. V jakých funkčních znacích se odchylují od ideálního osmotického systému? 3. Pokud bychom buňku s osmotickým tlakem cytosolu π = 1,2 MPa ponořili do roztoku s hodnotou osmotického tlaku π = 0,4 MPa, jaký hydrostatický (turgorový) tlak by se v ní vytvořil? (za předpokladu, že by se chovala jako ideální osmotický systém). 4. Jakým způsobem mohou rostlinné buňky velmi rychle měnit osmotický tlak cytosolu? 5. Z jakých důvodů je pro rostliny důležité udržovat vysoký turgorový tlak v buňkách a na jakých buněčných parametrech závisí jeho nejvyšší dosažitelná hodnota v průběhu dne? 6. Zdůvodni, zda je, nebo naopak nikdy není možný tok vody z kořenů do půdy! 7. Může pronikat půdní roztok u některých druhů rostlin buněčnými stěnami (apoplastem) z půdy až do xylému? 8. Na jakých okolnostech závisí rychlost toku vody do buňky přes její plazmatickou membránu ? (vztaženo je jednotku plochy membrány). 9. Jak se obvykle mění hodnoty hydrostatického tlaku ve vodivých elementech xylému (zvyšují - snižují) v nočních hodinách? (ve srovnání s denními hodinami). 10. Za jakých okolností může dojít k samovolnému vytékání vody z pahýlu po odříznutí stonku (kořenový vztlak) a co je jeho příčinou? 11. Jaké jsou příčiny vzniku bublinek ve vodivých elementech xylému (kavitace, plynová embolie) a jaké mechanismy umožňují rostlinám zajistit i v tomto případě tok vody? 12. Jaké maximální rychlosti může dosahovat transport vody u našich listnatých stromů s širokými cévami ve srovnání s jehličnatými stromy? 13. Proč se nutně musí lišit mechanismus příjmu iontů živin z půdního roztoku do buněk kořenů od příjmu vody? Jaké problémy pro rostlinu by nastaly, pokud by probíhal shodně? 14. Jaké jsou rozdíly v mechanismu transportu a v přenosové kapacitě mezi selektivními kanály a přenašeči? 15. Jaké typy protonových pump se vyskytují v membránách rostlinných buněk a jaká je jejich efektivita (měřeno spotřebou energetických zdrojů na transport 1 molu protonů) 16. Jak probíhá sekundárně aktivní (spřažený) transport a k jakým transportům (co odkud kam) je u rostlinných buněk nejčastěji využíván? 17. Jakými podněty (signály) je nejčastěji aktivováno otvírání selektivních kanálů v membránách rostlinných buněk? 18. Zdůvodni, zda může nebo nikdy nemůže dojít k transportu iontů živin (např. K+ ) z půdy do kořenů prostou difuzí (přes selektivní kanály), je-li jejich koncentrace v kořenových buňkách desetkrát vyšší než v půdním roztoku okolo kořene! 19. Jaké sloučeniny bývají v největším množství transportovány v lýku? 20. Co je hybnou silou transportu roztoků v lýku a proč může i ve stejné sítkovici dojít v průběhu dne k obrácení směru proudění? TRANSPORTNÍ PROCESY 41 21. Popiš hlavní principy apoplastové a symplastové cesty naplňování lýka! 22. Jakým způsobem je řízen odběr sacharózy z foémové tekutiny v místech největší potřeby? 23. Jaké jsou hlavní rozdíly v transportních výměnách rostlin s jejich okolím mezi těmito plyny: vodní pára, oxid uhličitý a kyslík. 24. Jaké anatomické a biochemické zvláštnosti mají svěrací buňky průduchů ve srovnání s ostatními epidermálními buňkami a jaký je funkční význam těchto zvláštností? 25. Jakým způsobem jsou pohyby průduchů vázány na mezibuněčný transport draslíkových iontů a čím je směr tohoto transportu podmíněn? 26. Jakým mechanismem je zajištěno otvírání a zavírání průduchů v závislosti na aktivitě fotosyntetických procesů v mezofylových buňkách? 27. Jakým mechanismem je spouštěna zavírací reakce průduchů na začínající nedostatek vody v půdě, i když listy jsou ještě vodou zcela nasyceny? 28. Jakým způsobem bychom mohli vypočítat difuzní vodivost epidermis listů pro vodní páru a oxid uhličitý? Učební text k přednášce Bi4060 na přírodovědecké fakultě MU v Brně. Určeno pouze ke studijním účelům. Autor textu Jan Gloser. 2. ČÁST - METABOLICKÉ PROCESY Poznávání neuvěřitelně velkého množství chemických sloučenin a reakcí při přeměnách látek v živých buňkách je hlavní náplní vědního oboru biochemie. Pro rostlinného fyziologa jsou detailní znalosti o metabolických pochodech ovšem také velice cenné, a to především jako podklad k vysvětlení procesů na vyšších organizačních úrovních (orgány, celé rostliny). Fyziologie rostlin však nejen využívá biochemické poznatky, ale má vypracované i vlastní metodické přístupy, jak studovat metabolické projevy rostlin nedestruktivně (in vivo), a to i u rostlin rostoucích v přírodních podmínkách. K pochopení vztahům mezi metabolismem a ostatními funkcemi rostliny bude směřovat následující část učebního textu. Nemůžeme ale zcela vypustit přehled základních poznatků o metabolických procesech na buněčné úrovni. Fotosyntetická asimilace oxidu uhličitého - základní poznatky Naprostá většina rostlin získává veškerou energii pro své metabolické procesy z primárního energetického zdroje - slunečního záření, a veškerý uhlík z anorganické sloučeniny -oxidu uhličitého. Jsou to tedy fotoautotrofní organismy. Díky těmto schopnostem mají klíčové postavení v celé biosféře, neboť ostatní (heterotrofní) biotické složky ekosystémů, včetně člověka, pouze využívají energií bohaté organické látky vytvořené rostlinami. Procesy vedoucí k vazbě oxidu uhličitého do organických sloučenin s využitím radiační energie označujeme jako fotosyntetickou asimilaci CO2, zkráceně (i když ne zcela přesně) hovoříme o fotosyntéze. Obecněji lze definovat fotosyntézu jako souhrn procesů spojených s přeměnou energie fotonů (kvant záření) do volné chemické energie, která je dále využita při biologických syntézách. Chemická energie získaná ze záření může být totiž využita přímo v chloroplastu nejen k redukci anorganických sloučenin uhlíku, ale i k jiným biochemickým reakcím, např. k redukci anorganických sloučenin dusíku a síry. Fotosyntetická asimilace oxidu uhličitého, která je ústředním metabolickým procesem rostlin, zahrnuje velké množství dílčích reakcí, které lze rozdělit do tří skupin: • fyzikální procesy související s absorbcí zářivé energie v molekulách asimilačních pigmentů a s rezonančním přenosem zachycené energie k reakčním centrům, • primární fotochemické a redoxní procesy spojené s přenosem elektronů redoxními systémy k redukci NADP (nikotinamidadenindinukleotidfosfát) a k energetické podpoře vzniku ATP (adenosintrifosfátu) z ADP (adenosindifosfátu), • sekundární biochemické reakce, ve kterých dochází k vazbě CO2 do organických sloučenin s využitím energie produktů primárních procesů. Je potřeba poznamenat, že fotosyntetické procesy jsou z evolučního hlediska velmi staré vyvinuly se již u primitivních prokaryotních organismů před několika miliardami let, i když zpočátku jejich účinnost byla malá. V této původní podobě zůstaly zachovány např. u sirných baktérií. Ale již u sinic (což jsou ovšem také velmi staré prokaryotní organismy) evoluce fotosyntézy značně pokročila - složitější struktura protein-pigmentových součástí fotosyntetického aparátu vedla ke zvýšení jeho efektivity. Navíc nově nabytá schopnost využití uvolněných elektronů ze štěpení vody k tvorbě redukovaných sloučenin otevřela těmto organismům cestu ke kolonizaci širokého spektra stanovišť. Do nejdokonalejší podoby se ovšem fotosyntetické procesy rozvinuly až v buňkách eukaryotních rostlin, kde probíhají ve specializovaných organelách - chloroplastech. METABOLICKÉ PROCESY 1 Stavba hlavních funkčních celků v thylakoidech chloroplastů Chloroplasty jsou organely s dvojitou povrchovou membránou a s dalším, vysoce specifickým vnitřním membránovým systémem, označovaným jako thylakoidy. Thylakoidní membrány sice vznikají z vnitřní obvodové membrány chloroplastu, avšak vytvářejí zcela oddělenou soustavu uzavřených plochých váčků. Skupiny těsně na sebe přiléhajících thylakoidů nazýváme grana. Ty části membrán, které k sobě v granech přiléhají, označujeme jako granální (přitisknuté, stěsnané) thylakoidní membrány. Mají poněkud odlišnou skladbu a funkci než ty, které volně komunikují s okolím. Prostor uvnitř thylakoidů (lumen) - je vyplněn vodou s rozpuštěnými solemi. Thylakoidy jsou vysoce specializované struktury sloužící k efektivnímu zajištění krajně obtížných fotochemických procesů, tedy vlastní přeměny radiační formy energie v chemickou. Gelový roztok mezi thylakoidy (stroma) je dějištěm mnoha desítek biochemických procesů – probíhá zde např. tvorba bílkovin kódovaných v plastidovém geonomu, syntéza asimilačních barviv, mastných kyselin, ale hlavně biochemické reakce související s asimilací anorganických forem uhlíku, dusíku a síry. METABOLICKÉ PROCESY 2 V membránách thylakoidů je pozoruhodně vysoký obsah integrálních bílkovin - obvykle asi 60 až 65 % jejich hmotnosti. Na většinu z nich se váže velké množství molekul asimilačních barviv (chlorofylů a karotenoidů) za vzniku protein-pigmentových komplexů. Proteiny v thylakoidních membránách, ať už s navázanými pigmenty či bez nich, nejsou rozmístěny náhodně, ale sdružují se do velmi dokonale organizovaných shluků (funkčních celků), které mohou sice pracovat do značné míry samostatně, ale obvykle spolu navzájem spolupracují. Rozdělujeme je do čtyř hlavních skupin: fotosystém I, fotosystém II, cytochromový komplex a ATP-syntáza. Oba typy fotosystémů (I a II) se skládají z centrální části (reakční centrum, jádro fotosystému), která je obklopena světlosběrným protein-pigmentovým komplexem, označovaným zkratkou LHC (= Light Harvesting Complex), nebo též jako anténa. Funkcí antény je pouze zachycovat a induktivní rezonancí předávat excitační energii do reakčního centra, kde začíná vlastní přenos elektronů. Na transmembránových proteinech jádra bývají připojeny nejen asimilační barviva, ale i molekuly látek s redoxními vlastnostmi, které slouží jako přenašeče elektronů. Chemická stavba nejčastějších asimilačních pigmentů METABOLICKÉ PROCESY 3 Z asimilačních barviv, kterých bývá v každém z obou fotosystémů několik stovek molekul, má zcela výjimečné postavení chlorofyl a. Nejen proto, že je ho daleko největší množství (asi tři čtvrtiny všech barviv v chloroplastech), ale také pro schopnost přejít do ionizovaného stavu ztrátou elektronu při jeho excitaci zářivou energií. Tuto schopnost mají ovšem jen některé molekuly chlorofylu a umístěné v jádru fotosystémů. Chlorofyl a nacházíme ve všech částech fotosystémů, na rozdíl od chlorofylu b, který bývá zastoupen pouze v anténách. METABOLICKÉ PROCESY 4 Chlorofyl b má jen přídavnou (akcesorickou) funkci, pro fungování fotosyntetického aparátu není nezbytný. Chlorofyly jsou zelené, protože zelenou část viditelného spektra nejméně absorbují. Největší absorpci mají v oblasti modré (zhruba 400-500 nm) a červené (600-700 nm). Karotenoidy mají nejčastěji žlutou, oranžovou a červenou barvu. Absorbují hlavně krátkovlnnou část viditelného záření (mezi 400 - 500 nm). Nacházíme je jak v anténách, tak i v jádře fotosystémů. K nejhojnějším patří beta-karoten a ze skupiny xantofylů pak lutein. Mají jednak funkci světlosběrnou (jako doplňkové pigmenty), ale navíc velmi významnou funkci ochrannou. Pokud totiž molekuly chlorofylu absorbují více zářivé energie než může být využito pro přenos elektronů, pak může dojít k energetickému ovlivnění molekul kyslíku. Vzniklý "singletový" kyslík, i některé další „reaktivní“ formy aktivovaného kyslíku, mají destrukční účinky na stavební součásti thylakoidů. Pokud je ale nadbytečná energie převedena ke karotenoidům, může být zneškodněna přeměnou na teplo. Podrobněji jsou tyto procesy popsány ve čtvrté části těchto učebních textů, která je věnovaná stresové fyziologii. Karotenoidy jsou právě pro svoji ochrannou funkci pro život rostlin naprosto nezbytné. Bezkarotenoidní mutanti působením světla velmi rychle hynou. Dva zmíněné typy fotosystémů mají kromě uvedených společných znaků i řadu odlišností ve své stavbě a funkci. Existují i jisté rozdíly mezi druhy a navíc tentýž druh může složení fotosystémů poněkud měnit v závislosti na podmínkách prostředí. Níže uvedené charakteristiky mají proto značně pravděpodobnostní charakter. Fotosystém I (PS I)se nachází výlučně ve „volných“ částech thylakoidních membrán, které komunikují přímo se stromatem. Nevyskytuje se tedy v těch částech tylakoidů, které k sobě těsně přiléhají. Jádro fotosystému I (reakční centrum) obsahuje především dva velké polypeptidy (Ia, Ib), které na sebe vážou ionizovatelnou molekulu chlorofylu a (označovanou jako P700, neboť absorbuje nejvíce záření o vlnové délce 700 nm). Obvykle se však jedná o dimer, tedy o dvě spojené molekuly. Celkem je k proteinům reakčního centra připojeno ještě asi 50 až 130 dalších molekul chlorofylu a, společně s několika molekulami karotenoidů. K proteinům reakčního centra je připojeno celý řetěz redoxních sloučenin sloužících k přenosu elektronů. Anténní systém fotosystému I (světlosběrný komplex, LHC I) obsahuje asi 100 molekul chlorofylu a i b (v přibližném poměru 3:1), které jsou vázány na několik integrálních proteinů v těsné blízkosti reakčního centra. Fotosystém II (PSII) je lokalizován v granálních (přitisknutých, stěsnaných) membránách thylakoidů. Jeho hlavní část (bez vnější antény) je tvořena obvykle šesti integrálními a třemi periferními proteiny. Jádro (reakční centrum) fotosystému II tvoří dva integrální proteiny označované jako D1 a D2, na které bývá navázáno asi 50 molekul chlorofylu a, včetně jedné zvláštní ionizovatelné molekuly P680 označení opět vyjadřuje vlnovou délku světla s maximem absorpce). Dále je na proteiny jádra fotosystému trvale připojeno několik molekul přenašečů elektronů (feofytin, a dva plastochinony typu QA a QB). K fotosystému II patří i komplex ve kterém dochází k fotolýze vody. Bývá též označován jako OEC (Oxygen Evolving Center). Je tvořen několika malými periferními proteiny, připojenými z vnitřní strany (z lumen) thylakoidní membrány. Na nich jsou navázány 4 ionty manganu, dále ionty Cla Ca2+ K přenosu elektronů mezi komplexem oxidace vody a P680 slouží redoxní změny v molekule aminokyseliny thyrosinu. Na proteiny v těsné blízkosti reakčního centra fotosystému II bývá obvykle připojeno asi 100 molekul chlorofylů a + b, a také několik molekul beta-karotenu. Dohromady tak vytvářejí celek označovaný jako vnitřní anténa. Kromě toho je k fotosystému II volně připojena ještě další, vnější anténa (= vnější LHC II). Ta obsahuje celkem asi 100 až 200 molekul chlorofylů a + b, a také jisté množství karotenoidů (hlavně xanthofylů, např. violaxanthin a lutein). Pigmenty ve vnější anténě jsou také vázány na vhodné nosiče bílkovinné molekuly (vždy asi 10 molekul chlorofylu, a 1 až 3 molekuly karotenoidů na jeden polypeptid). Vnější antény nejsou pevně spojeny s vnitřními částmi fotosystému. Za nadměrně vysokých hodnot záření se mohou od fotosystému II odpojit, a tím zabránit jeho poškození nadbytečnou excitační energií. Cytochromový komplex (cyt b6 - cyt f) je složen ze čtyř proteinů. Tento komplex bývá zastoupen ve všech částech membrán thylakoidů. Jeho hlavní funkcí je zprostředkování transportu elektronů z fotosystému II na fotosystém I (ve spolupráci s mobilními přenašeči plastochinon a plastocyanin, viz dále). ATP-syntáza (dříve nazývaná "Coupling Factor", CF) je rozmístěna vždy v blízkosti fotosystému I, to znamená jen v těch částech thylakoidních membrán, které volně komunikují se stromatem.Tvoří ji komplex devíti polypeptidů - velmi podobný tomu, jaký nalézáme i v mitochondriích. Funkci má jednoznačnou, zprostředkovat tvorbu ATP z ADP při transportu protonů nahromaděných uvnitř thylakoidních váčků (= v lumen) do stromatu. Schéma uložení hlavních proteinových komplexů v thylakoidní membráně. Je také naznačena jejich součinnost při přenosu elektronů a protonů, blíže popisovaná v dalším textu. Organizace světlosběrných systémů (antén) u fotosystému II. METABOLICKÉ PROCESY 5 Průběh primárních procesů fotosyntézy Při dopadu kvant záření (fotonů) vhodné vlnové délky (přibližně od 400 do 700 nm) na asimilační barviva v anténách, dojde v jejich molekulách k excitaci elektronů. Jeden foton přitom excituje (= převádí do energeticky bohatějšího, ale nestabilního stavu) pouze jeden elektron v jedné molekule. Přebytek energie při návratu elektronu z excitovaného do základního stavu může být jednak přeměněn na teplo či vyzářen ve formě fluorescenčního záření, ale nejčastěji je využit k excitaci elektronu v jiné blízké molekule chlorofylu či karotenoidu. Tímto bezztrátovým přenosem excitační energie (excitonu) elektronů (nikoli tedy přenosem vlastních elektronů!), označovaným jako induktivní rezonance, může dojít až k transportu excitonu do reakčního centra k ionizovatelné molekule chlorofylu a. Jednosměrnost přenosu excitační energie z antén směrem k reakčnímu centru fotosystémů je zajištěna díky rozdílům ve vlastnostech barviv, které jsou velmi závislé na způsobu své vazby k molekulám bílkovin. Čím blíže k reakčnímu centru se barviva nacházejí, tím menší energii potřebují k excitaci (tedy i jejich maximum absorpce záření leží v poněkud větších vlnových délkách). Tím stoupá pravděpodobnost, že právě na ně bude excitační energie přenesena. Karotenoidy a chlorofyl b potřebují obecně vyšší excitační energii než molekuly chlorofylu a. Přenos excitační energie z antén do reakčního centra probíhá vcelku shodně v obou typech fotosystémů, stejně tak oddělení elektronu v centrální molekule chlorofylu a. Schematické naznačení excitace elektronu v molekule pigmentů a přenosu excitační energie Podívejme se ale blíže na reakce které následují, neboť ty jsou v obou typech fotosystémů již odlišné. METABOLICKÉ PROCESY 6 V reakčním centrum fotosystému II je elektron odštěpený z ionizovatelné molekuly chlorofylu P680 zachycen prvním akceptorem, kterým je feofytin (= modifikovaná molekula chlorofylu a bez centrálního atomu hořčíku). Z něho je předáván na další redoxní přenašeče typu chinonů. Dva z nich (označované jako QA a QB),,jsou vázané k proteinům reakčního centra. Navazujícími přenašeči jsou volně pohyblivé plastochinony (PQ), které se nacházejí uvnitř membrány okolo fotosystému. Vraťme se však ještě k molekule chlorofylu P680, která předala svůj elektron. Zpět do původního redukovaného stavu se dostává tím, že přijímá elektron pocházející z rozložené molekuly vody. Oxidační rozklad vody je však velmi obtížný proces, který musí být zprostředkován pomocným aparátem. Rozpadem jedné molekuly vody se uvolňují dva elektrony. Měřením bylo zjištěno, že se dokonce současně oxidují dvě molekuly vody, ze kterých se tedy uvolňují čtyři elektrony. Je zřejmé, že přímá oxidace vody aktivovanou molekulou chlorofylu (schopnou akceptovat jen jeden uvolněný elektron) není možná. Proto je v centru oxidace vody důležitá přítomnost iontů manganu se schopností čtyři elektrony naráz přijmout a pak je postupně předávat na chlorofyl P680 prostřednictvím přenašeče označovaného jako YZ , což je zřejmě radikál tvořený tyrosinovým zbytkem na proteinu D1. Sledujme však nyní opět cestu elektronů po vazbě na plastochinony. Je důležité si uvědomit, že k redukci plastochinonu na plastohydrochinon jsou potřebné nejen dva elektrony, ale také dva vodíkové ionty, které však nepocházejí z fotolýzy vody. Jsou přebírány z vnější strany membrány, ze stromatu, a při dalších redoxních změnách (oxidaci plastohydrochininu) se v membráně uvolňují na její opačné straně, tedy do lumen. Vidíme tedy, že oxidací jedné molekuly vody a následným přenosem elektronů ve fotosystému II se lumen thylakoidu obohatil čtyři vodíkové ionty. To je velmi důležité pro celkový energetický výtěžek, jak bude zřejmé z dalšího výkladu. Přenos elektronů z fotosystému II k cytochromovému komplexu pomocí volně pohyblivých plastohydrochinonů (v chloroplastech jich bývá několik druhů) je nejpomalejší proces v celé transportní cestě. Průměrná doba přenosu je asi 5 ms, ostatní výměny jsou obvykle o několik řádů rychlejší. Obecné schéma redukce plastochinonů. Cytochromový komplex je tvořen čtyřmi proteiny na které jsou navázány čtyři redoxní systémy, u kterých ale výměna elektronů není spojena s vazbou vodíkových iontů. Proto při oxidaci volně pohyblivých plastohydrochinonů na tomto komplexu se odpojené protony mohou transportovat a hromadit ve vnitřní části thylakoidních váčků (lumen) spolu s protony produkovanými rozkladem vody ve fotosystému II. Oxidací jedné molekuly hydrochinonu se uvolní dva elektrony, ovšem každý z nich se může ubírat rozdílnými cestami. Jeden je obvykle zachycen redoxním systémem typu Fe-S (na tzv. Rieskeho proteinu), pak je přenesen na cytochrom typu f, a nakonec na mobilní přenašeč plastocyanin. Druhý z elektronů bývá zachycen hemovou redoxní skupinou cytochromu typu b, a po přestupu na další cytochrom stejného typu (na témže proteinu) je uvolněn k redukci některé z volně pohyblivých molekul plastochinonů, a ta je pak opět oxidována na cytochromovém komplexu. Smyslem tohoto cyklického přenosu elektronu, označovaného jako Q-cyklus (= chinonový cyklus), je přispět k dalšímu přečerpávání vodíkových iontů z vnější, stromatální strany (odkud se odebírají při redukci plastochinonů) do lumen thylakoidu (kam odcházejí při oxidaci plastohydrochinonu). METABOLICKÉ PROCESY 7 Již zmíněný plastocyanin (PC), na který dříve nebo později přecházejí všechny elektrony transportované z fotosystému II přes cytochromový komplex, je malý protein (10,5 kDa) ve vodě dobře rozpustný, s redoxní skupinou obsahující měď. Nachází se na vnitřní straně thylakoidní membrány (směrem k lumen) a přenáší elektrony z cytochomového komplexu do reakčního centra ve fotosystému I. Jakmile je v tomto centru za přispění absorbované radiační energie oxidována centrální molekula chlorofylu a, (označovaná jako P700), chybějící elektron je doplněn právě z plastocyaninu, neboť ve fotosystému I neprobíhá fotolýza vody (jako možný zdroj elektronů). První akceptor elektronu z P700 je opět molekula chlorofylu a (označováná též jako Ao), dalším pak fylochinon (A1), a pak následuje řetěz tří redoxních systémů typu Fe-S (označované jako FX, FA, FB), pevně vázaných na integrálních proteinech reakčního centra. Teprve pak dochází k přenosu elektronu na feredoxin (Fd), který se nachází na stromatální straně thylakoidní membrány. Feredoxin je dobře rozpustný a tudíž pohyblivý protein s obsahem železa. Přenáší elektrony ke konečnému akceptoru v celém řetězci, k NADP+ , který je redukován na NADPH. Reakce je zprostředkována flavoproteinem feredoxin-NADP reduktázou (zkráceně Fp), a spotřebovávají se při ní dva elektrony. METABOLICKÉ PROCESY 8 Celý popsaný přenos elektronů z rozštěpené molekuly vody až na NADP+ nazýváme necyklický (lineární) elektronový transport. Kromě toho ještě může probíhat cyklický elektronový transport. Při něm jsou elektrony uvolněné z P700 přenášeny přes přenašeče fotosystému I a mobilní feredoxin nikoliv k NADP+ , ale jsou použity na redukci mobilních plastochinonů v thylakoidní membráně. Při přijetí dvou elektronů se navážou na jednu molekulu plastochinonu i dva protony pocházející ze stromatu.. Vzniklý plastohydrochinon je oxidován v cytochromovém komplexu, uvolněné elektrony jsou přenášeny přes jeho redoxní systémy a plastocyanin zpět k P700 a tam mohou vstupovat do dalšího cyklu. Dva protony uvolněné při oxidaci plastohydrochinonu na cytochromovém komplexu však zůstávají v lumen. Popsaný cyklický transport elektronů slouží tedy k "pumpování" vodíkových iontů ze stromatu do lumen. Využívá světelnou energií zachycenou jen ve fotosystému I a je tudíž zcela nezávislý na fotosystému II a na fotolýze vody. Nemůže však nikdy nahradit necyklický transport s účastí obou fotosystémů, protože jedině tímto transportem se může vytvářet kromě ATP i nezbytně potřebná, energeticky velmi bohatá redukující sloučenina NADPH. Jak vyplynulo z předcházejícího popisu, fotolýzou vody a navazujícími redoxními výměnami dochází k rychlému hromadění vodíkových iontů v lumen thylakoidu. Jejich zvýšená volná chemická energie díky vytvořenému elektrochemického gradientu je průběžně využívána k tvorbě ATP, a sice při průchodu protonů z lumen do stromatu ATP-syntázou. Tento polypeptidový komplex se vyskytuje v hojném počtu jen na volných (nepřilehlých) částech thylakoidní membrány, vzhledem k potřebě rychlého přísunu ADP a fosfátových iontů ze stromatu a odvodu ATP tamtéž. K tvorbě jedné molekuly ATP z ADP je nutný průchod tří protonů. Tvorbu ATP na úkor chemického potenciálu vodíkových iontů nahromaděných v lumen při necyklickém elektronovém transportu nazýváme necyklickou fosforylací na rozdíl od cyklické fosforylace, která využívá energie vodíkových iontů přenesených do lumen ze stromatu při cyklickém elektronovém transportu. METABOLICKÉ PROCESY 9 Metodické přístupy ke studiu primárních procesů fotosyntézy Studium struktury proteinových komplexů v thylakoidních membránách a funkce jejich jednotlivých součástí je mimořádně obtížné a ještě zdaleka není ukončeno. Potíže vyplývají nejen ze složitosti a funkční propojenosti těchto struktur, ale hlavně z toho, že jsou to struktury, jejichž nenarušená vazba v membránách je podmínkou správné funkce. Běžné biochemické metody jsou proto použitelné jen ve velmi omezené míře. Mnohem větší význam mají moderní biofyzikální metody umožňující provádět analýzy nedestruktivním způsobem na živých, plně funkčních částech rostlin. Detaily „architektury“ fotosystémů, zejména tedy prostorové struktury reakčních center a anténních protein-pigmentových shluků, jsou nejčastěji studovány pomocí rentgenové krystalografie. K výzkumu funkční významnosti jednotlivých proteinů v komplexech také velmi pomáhají vhodné aplikace metod molekulární biologie, např. cílenou tvorbou geneticky modifikovaných rostlin s různě defektní stavbou fotosystémů. METABOLICKÉ PROCESY 10 Ke stanovení celkové funkčnosti fotochemického aparátu rostlin i k analýze dílčích procesů zapojených do konverze energie záření do chemické formy energie jsou v současné době daleko v nejširší míře používány metody založené na detekci a následné analýze signálu indukované fluorescence chlorofylu. Jsou to metody velmi rychlé, aplikovatelné jak na buněčné tak i na orgánové úrovni, a navíc snadno použitelné i v terénních podmínkách. Proto bychom měli znát jejich obecný princip a některé oblasti jejich využití. Jak již bylo v předcházejícím výkladu naznačeno, jeden elektron v molekule chlorofylu po absorpci dávky záření (fotonu) je uveden do energeticky bohatšího stavu, ze kterého se rychle vrací zpět do stavu základního. Přebytek jeho energie při tomto návratu je většinou využit k fotochemickým procesům (transport elektronů z reakčního centra a tvorba NADPH), ale může také posloužit ke vzniku nového záření (= fluorescenční záření, má poněkud větší vlnovou délku než to, které bylo absorbováno). Je ale také možná přeměna excitační energie na tepelnou energii. Tyto tři deexcitační cesty jsou ve vzájemném kompetičním vztahu, tudíž snížení aktivity jedné z nich vede k relativnímu zvýšení úhrnného podílu zbývajících dvou cest. Tedy naměříme-li u studovaného listu snížení fluorescence chlorofylu, lze z toho usuzovat na zvýšenou aktivitu fotochemických procesů, ale také může jít o zvýšení tepelného rozptylu (disipace) excitační energie, která pak již nemůže být využita ve fotochemických procesech fotosyntézy). V odborné fluorometrické terminologii se tyto dva kompetiční procesy ovlivňující fluorescenci označuji jako fotochemické zhášení (angl. quenching) fluorescence, a nefotochemické zhášení fluorescence. K přesnému měření fluorescence existuje dnes celá řada velice citlivých, snadno přenosných přístrojů, které obvykle mají vlastní zdroj záření pro regulovanou indukci (vybuzení) fluorescence. Nejvážnějším problémem při fluorometrických měřeních však není přesné stanovení hustoty toku fluorescenčního záření vyzařovaného z měřeného objektu (ten lze zaznamenávat automaticky i po velmi dlouhý časový interval!), ale analýza získaných dat, neboť z nich je nutno odděleně vypočítat podíl fotochemické a nefotochemické složky na celkovém zhášení fluorescence. Jen pak mohou fluorometrická měření posloužit k hodnocení aktivity primárních (fotochemických) procesů v rostlinách, na kterých nám nejvíc záleží.. Pro oddělené stanovení podílu obou zmíněných složek je nutno zvolit takový měřící postup, při kterém je jedna z nich konstantní, či ještě lépe po jistou dobu zcela potlačena. Podíl fotochemického zhášení fluorescence lze eliminovat zablokováním přenosu elektronů v thylakoidní membráně, což lze provést nejen aplikací chemických inhibitorů redoxních systémů, ale i (což je v praxi nejčastější) krátkým působením záření o vysoké (nadsaturační) rychlosti toku. V tom případě dojde k úplné redukci redoxních přenašečů ve fotosystémech a ty po jistou dobu nejsou schopny přijímat žádné další elektrony. Jeden z nejjednodušších postupů při získávání základních údajů o aktuálním i potenciálním stavu asimilačního aparátu je schematicky znázorněn na obrázku a blíže popsán v dalším textu. METABOLICKÉ PROCESY 11 METABOLICKÉ PROCESY 12 Měření obvykle začínáme se vzorkem (rostlinou, listem či částí listu) který byl po dobu několika desítek minut před měřením zatemněn. Tím je navozen plně oxidovaný stav redoxních systémů v thylakoidních membránách, které jsou tudíž schopné po ozáření vzorku rychle přenášet elektrony z reakčního centra. Pokud záření je jen velmi nízké, je relativní hodnota emitované fluorescence také velmi nízká (označuje se jako Fo , ale také jako bazální či „nulová“ fluorescence). Poté je aplikován krátký puls velmi vysokého záření, při kterém je velkým množstvím uvolněných elektronů v reakčním centru dočasně zablokován jejich transport, neboť není dostatek volných akceptorů (t.j. redoxních přenašečů v oxidovaném stavu, vše je náhle plně redukováno), ale přitom mechanismy nefotochemického zhášení fluorescence (tepelné disipace) nejsou ještě za tak krátkou dobu aktivovány. Část energie, která by se u rostliny s nezablokovanými přenašeči mohla fotochemicky využít, je přeměněna na mimořádně vysokou („maximální“) fluorescenci (Fm). Normalizovaný rozdíl fluorescence od Fo až po Fm je tak mírou maximální (potenciální) rychlosti transportu elektronů ve fotosystémech a za jistých předpokladů může sloužit i k odhadu kvantového výtěžku fotosystému II. Po zjištění uvedených základních parametrů můžeme měřený list vystavit středním hodnotám záření (které jsou běžné v přírodě) a opakovaně aplikovat krátké pulzy velmi vysokého záření ke zjištění parametru F´m , což je hodnota maximální fluorescence při dlouhodobém vystavení listu záření. (na našem obrázku je znázorněn pouze jeden takový puls). V časovém intervalu několika desítek minut se postupně aktivují nefotochemické mechanismy zhášení (způsobující tepelnou disipaci jisté části excitační energie) a rozdíl mezi Fm a F´m lze považovat za míru jejich aktivity. Měření a následná analýza signálu fluorescence chlorofylu může být používána v základním výzkumu fotosyntetických procesů, např. k hlubší analýze rychlosti jednotlivých kroků a k hledání nejvíce limitujících míst v transportním řetězci (zejména pomocí přístrojů umožňujících měřit extrémně rychlé změny v emitovaném fluorescenčním záření). Daleko nejčastěji jsou však měření indukované fluorescence používána v ekologické fyziologii rostlin k velmi rychlé a snadné detekci významnosti vlivu různých stresových faktorů na rostliny. Nemusí to být pouze faktory ovlivňující přímo funkčnost fotosyntetického aparátu (např. nízká či vysoká teplota, nadměrné záření, plynné polutanty). I nepřímé vlivy vedoucí ke zpomalení růstu (např. nedostatek vody či živin vedoucí ke zpomalení růstu) se dříve nebo později projeví v malém „odbytu“ vytvářených asimilátů, a jejich postupné hromadění v chloroplastech vede k inhibici biochemických procesů fixace CO2 V tom případě obvykle nastane i malá „poptávka“ po produktech fotochemických procesů (ATP, NADPH), což vede ke zpomalení těchto procesů, a to je už detekovatelné fluorometricky. Relativní dostupnost kompaktních aparatur pro měření indukované fluorescence chlorofylu in vivo a jejich téměř masové nasazení v různých oblastech základního i aplikovaného fyziologického výzkumu lze jen uvítat, avšak současně svádí k mnoha chybným aplikacím. Především je nutno mít stále na paměti, že se jedná vesměs o relativní měření změn ve funkčnosti primárních procesů v měřeném vzorku, stěží použitelné ke srovnávacím účelům, tedy k nalezení spolehlivých rozdílů mezi různými listy či druhy. Vyvozovat z fluorometrických měření závěry týkající se rychlosti sekundárních fotosyntetických procesů (fixace CO2) je také velmi nespolehlivé – korelace zjištované v laboratorních podmínkách nemusí vůbec platit pro rostliny v přírodě. V tomto směru jsou metody založené na měření výměny plynů (především příjmu a výdeje CO2), stále nenahraditelné. Avšak i při jednoduchých detekcích opakovaně prováděných na těchže listech velmi záleží na správném (předem navrženém a vyzkoušeném) experimentálním postupu, protože špatně naměřená data nelze uspokojivě vyhodnotit a jakékoli snahy o jejich interpretaci jsou velmi zavádějící. Biochemické procesy asimilace oxidu uhličitého, fotorespirace Na popsané primární procesy v thylakoidních membránách navazuje vlastní asimilace CO2 do organických sloučenin. K tomu slouží celý komplex biochemických reakcí probíhající tentokrát ve stromatu chloroplastu. Reakce jsou spojeny do uzavřeného koloběhu, který souhrnně označujeme jako fotosyntetický cyklus redukce uhlíku, nebo též Calvinův cyklus. Nebudeme jej zde podrobně popisovat, neboť to je již problematika čistě biochemická. Zopakujme si tedy jen opravdu to nejdůležitější. Calvinův cyklus lze rozdělit na tři etapy: Karboxylace: CO2 je vázán na pětiuhlíkatý fosforylovaný cukr ribulóza-1,5-bisfosfát pomocí enzymu ribulóza-1,5-bisfosfát karboxyláza/oxygenáza. Prvním stálým produktem této reakce, která probíhá bez dodání energie, jsou dvě molekuly kyseliny 3-fosfoglycerové (3-PGA). Redukce: Nejprve se na 3-PGA napojuje další fosfátová skupina uvolněná hydrolýzou molekuly ATP. Vzniká tak kyselina 1,3-bisfosfoglycerová a pak dochází k vlastní redukci pomocí NADPH za vzniku glyceraldehyd-3-fosfátu. Protože při fixaci jedné molekuly CO2 vznikly dvě molekuly 3-PGA, bude celkový náklad na jejich redukci 2 ATP a 2 NADPH. Regenerace: Nejsložitější fáze celého cyklu ve které reakce fosforylovaných cukrů vedou k syntéze ribulóza-5-fosfátu. Ten je nutno další molekulou ATP (třetí v celkovém součtu) převést na ribulóza-1,5-bisfosfát, který pak slouží jako akceptor pro další molekulu CO2. K čistému zisku jedné tříuhlíkaté molekuly (glyceraldehyd-3-fosfátu) je zapotřebí fixovat tři molekuly CO2 tedy celý cyklus musí proběhnout třikrát dokola. Vytvořený glyceraldehyd- 3-fosfát je jednak zpracováván v dalších syntézách přímo v chloroplastu (např.na škrob), jednak je transportován z chloroplastu do cytosolu. Na transportu se může podílet také blízce příbuzný dihydroxyacetonfosfát, který vzniká snadnou izomerací z glyceraldehyd-3-fosfátu. Calvinův cyklus je evolučně velmi starý proces, společný všem fotosyntetizujícím organismům. Žádný jiný cyklus se srovnatelnou funkcí není znám, avšak je známa celá řada přídavných reakcí, které fungování Calvinova cyklu mohou zefektivnit anebo přizpůsobit zvláštním podmínkám. METABOLICKÉ PROCESY 13 Hlavním enzymem Calvinova cyklu je ribulóza-1,5-bisfosfátkarboxyláza/oxygenáza, běžně označovaná akronymem "Rubisco". Může fungovat, jak už jeho název napovídá, nejen jako karboxyláza, ale i jako oxygenáza, tedy na stejný substrát vnášet jak CO2, tak i O2. V listech rostlin má největší zastoupení ze všech proteinů (30 až 50 %). Katalytické schopnosti Rubisco jsou aktivovány pouze na světle za přítomnosti Mg2+ a CO2, které s ním vytvářejí pevný komplex. Tento proces (karbamylace Rubisco) je stimulován specifickým enzymem Rubisco aktivázou. U některých druhů se vyskytuje ještě další specifická sloučenina, která řídí (tentokrát inhibuje) aktivitu Rubisco: 2-karboxy-D-arabinitol-1-fosfát. Dokonalá regulace aktivity Rubisco a některých dalších enzymů v Calvinově cyklu je zřejmě nutná ke sladění návaznosti reakcí a k omezení oscilací v cyklu na počátku světelné periody. Afinita Rubisco k CO2 je sice podstatně větší než ke kyslíku, jenže v chloroplastech bývá mnohem vyšší koncentrace kyslíku než CO2. Za takových podmínek se oxygenázová aktivita skutečně významným způsobem projeví - spouští celý řetěz reakcí, které souhrnně označujeme jako fotorespirační cyklus oxidace uhlíku, zkráceně fotorespirace. Fotorespirace začíná tedy přenosem kyslíku pomocí Rubisco na stejný substrát, jako při karboxylaci (ribulóza-1,5-bisfosfát). Stálým produktem této reakce je jedna molekula 3PGA a jedna molekula fosfoglykolátu. Z ní se záhy odštěpuje fosfátová skupina a vzniklý glykolát je transportován z chloroplastu do blízkých peroxisomů. Tam je oxidován na glyoxylát a ten dále transaminován na glycin. Na tyto reakce v peroxizómu navazují další, tentokrát v mitochondriích: tvorba jedné molekuly serinu ze dvou molekul glycinu - uvolňuje se při tom po jedné molekule CO2 a NH3. Serin může být jednak využíván v dusíkovém metabolismu buňky (syntéza dalších aminokyselin, bílkovin a jiných složitějších látek), ale může být také transportován zpět do peroxizomů, kde po transaminaci a redukci (za spotřeby jedné molekuly NADH) vzniká glycerát. Ten se v chloroplastech fosforyluje za účasti jedné molekuly ATP na 3-fosfoglycerát, který může být využit k regeneraci původního substrátu, ribulóza-1,5-bisfosfátu. Tím se celý cyklus uzavírá. Je dobré si povšimnout, že z každých dvou dvouuhlíkatých molekul glykolátu (tedy celkem 4 C), které vystupují z chloroplastu do řetězu fotorespiračních reakcí, se vrací zpět jen jedna tříuhlíkatá molekula glycerátu, tedy jen 75% C. Zbylá čtvrtina uhlíku se ztrácí ve formě CO2. Při přepočtu na výchozí substrát (ribulóza-1,5-bisfosfát) činí ztráta uhlíku 10%, ovšem přistupují ztráty energetické (2 ATP a 2,5 NAD(P)H na každou fixovanou molekulu O2). Schopnost enzymu Rubisco přenášet nejen CO2, ale i O2 na tentýž substrát, má obvykle za následek značné snížení účinnosti fotosyntetické fixace CO2. Poměr mezi METABOLICKÉ PROCESY 14 METABOLICKÉ PROCESY 15 karboxylační a oxygenační aktivitou tohoto enzymu závisí především na poměru mezi koncentrací CO2 a kyslíku v chloroplastu. Tento poměr je zase velmi závislý na koncentraci obou plynů v atmosféře. Za normálního složení volné atmosféry (21 objemových % O2 a 0,036 % CO2), a při teplotě listu 25 °C, je poměr mezi rychlostí karboxylace a oxygenace 2 až 3. To znamená, že jedna čtvrtina až jedna třetina primárního substrátu využitelného v Calvinově cyklu podléhá fotorespiračním procesům a tedy i ztrátám (uhlíku, energie), jak již bylo uvedeno. Při zvyšování teploty listu poměr mezi koncentrací CO2 a O2 v chloroplastech klesá, neboť CO2 má za vyšších teplot menší rozpustnost ve vodě než kyslík. Podíl oxygenace, a tudíž i fotorespiračních ztrát, tedy nutně vzrůstá s teplotou. I když negativní vliv fotorespirace na celkovou efektivitu fixace CO2 je nepochybný, pro celkový metabolismus není tak zcela bez užitku. Právě fotorespirační cestou se asi vytváří nejvíce glycinu a serinu. Fotorespirace může být prospěšná i při odvádění přebytků ATP a redukčního potenciálu za silného záření a nedostatku CO2. To jsou ovšem zatím jen hypotézy. Jak uvidíme z dalšího výkladu, řada druhů rostlin docela dobře funguje i s fotorespirací trvale potlačenou. Místo hledání "smyslu" fotorespirace bude asi nutné se smířit s tím, že enzym Rubisco se nám zachoval v téměř nezměněné podobě ještě z doby vzniku prvních autotrofních organismů s Calvinovým cyklem. Tehdy měla zemská atmosféra mnohem více CO2 a mnohem méně kyslíku než v současné době, a tudíž tento enzym fungoval jen jako karboxyláza. Fixační cesta C4 I když v průběhu evoluce rostlin nevznikl kromě Calvinova cyklu žádný jiný fixační cyklus s tak dokonalou obnovou všech reagujících složek a také ani nedošlo k výraznému zlepšení vlastností klíčového enzymu Rubisco, přesto jisté změny v metabolických cestách u řady druhů skutečně nastaly. Bylo již objeveno několik pozoruhodných metabolických adaptací, které v prvé řadě umožňují zvýšit parciální tlak CO2 v místech jeho fixace Calvinovým cyklem a tím potlačit oxygenázovou aktivitu Rubisco. Společným principem těchto adaptací u suchozemských rostlin je opakovaná karboxylace, u vodních (ponořených) rostlin pak ještě navíc aktivní transport iontů HCO3 z vodního prostředí do listů. Nejprve se podívejme jak funguje metabolická adaptace označovaná jako fixační cesta C4. U rostlin s tímto typem metabolismu (zkráceně C4-rostliny) jsou chloroplasty schopné fixace běžným Calvinovým cyklem soustředěny jen do skupin zvláštních buněk, které mají ztlustlé stěny a malé vakuoly. Zato chloroplastů a mitochondrií mají mimořádně velký počet. Tyto zvláštní buňky vytvářejí jednu až dvě koncentrické vrstvy kolem cévních svazků. Jsou velmi nápadné a říká se jim též věnce či pochvy cévních svazků. Ostatní mezofylové buňky mají chloroplasty menší, méně početné, bez škrobových zrn, zato s velkým počtem granálních tylakoidů. Hlavně však mají zcela jinou funkci při sekundárních procesech fotosyntézy. Nejvíce chloroplastů bývá v těch mezofylových buňkách, které leží v těsné blízkosti zvláštních buněk pochev cévních svazků, neboť mezi oběma typy buněk je nutná velmi těsná spolupráce. K prvotní karboxylaci dochází vždy v cytosolu běžných mezofylových buněk. Jsou při ní využívány ionty HCO3 , které se v cytosolu vyskytují hojněji než rozpuštěný CO2. Navazují se na tříuhlíkatý fosfoenolpyruvát za vzniku oxalacetátu (kyseliny oxaloctové). Primární produkt reakce je tedy čtyřuhlíkatá sloučenina - proto označujeme tuto fixační cestu jako C4 (na rozdíl od přímé fixace Calvinovým cyklem, označované jako C3-fixační cesta, neboť prvním stálým produktem je tříuhlíkatá kyselina fosfoglycerová). Enzymem katalyzujícím popsanou reakci je fosfoenolpyruvátkarboxyláza (zkráceně PEP karboxyláza), která má k CO2 větší afinitu než Rubisco. Tím je také možný rychlejší příjem CO2 do listu i při stejné vodivosti difuzních cest. Další reakce, které následují po prvotní karboxylaci, mohou vést několika směry. U jedné skupiny C4-rostlin, ke které patří např. kukuřice, vzniklý oxalacetát vstupuje do chloroplastů mezofylových buněk, kde se velmi rychle přeměňuje na malát. Ten je pak transportován do zvláštních buněk v pochvách cévních svazků, kde dochází k oxidativní dekarboxylaci na pyruvát. Uvolněný CO2 je postupně zpracováván Calvinovým cyklem. Zbylý pyruvát je odváděn zpět do mezofylových buněk k využití v dalším fixačním cyklu. Průřez částí listu rostliny s fixační cestou C4. Buňky pochvy cévních svazků, kde probíhá konečná fixace CO2 do sacharidů, jsou zvýrazněny. Schema dvou variant fixační cesty C4: varianta s transportem malátu (nahoře) a s transportem aspartátu (dolní část obrázku). Existují i další modifikace C4-metabolismu. METABOLICKÉ PROCESY 16 U jiné skupiny C4-rostlin (některé tropické trávy, např. rodu proso, Panicum) je oxalacetát v cytosolu transaminován na aspartát (donorem aminoskupiny je glutamát), který je pak transportován do zvláštních buněk v pochvách cévních svazků. Tam je nejprve opět přeměněn na oxalacetát, který je buď přímo dekarboxylován, nebo je nejprve redukován na malát a pak teprve dekarboxylován. Ve všech případech je uvolněný CO2 ve zvláštních buňkách pochev cévních svazků dále zpracováván Calvinovým cyklem. Zbylé produkty (pyruvát či alanin) jsou transportovány zpět do mezofylových buněk a regenerací primárního akceptoru se cyklus uzavírá. Fixační cesta C4 je z hlediska využití CO2 neobyčejně účinná. Nejen proto, že v mezofylu je CO2 (resp. HCO3) velmi rychle a účinně vázán PEP karboxylázou na fosfoenolpyruvát, ale hlavně proto, že v buňkách pochev cévních svazků vzniká dekarboxylací organických kyselin velmi vysoká koncentrace v (asi 1500 cm3 .m-3 , což je téměř desetkrát více, než bývá v mezofylových buňkách C3-rostlin!) Zvýšenou koncentrací CO2 je téměř úplně potlačena oxygenázová aktivita Rubisco, a tím tedy i fotorespirace. Chloroplasty v buňkách pochev cévních svazků mají velmi málo gran, tudíž i malé zastoupení tylakoidních membrán s fotosystémem II. Proto i produkce kyslíku rozkladem vody je poměrně malá. Na druhé straně však celý mechanismus umožňující zvyšovat koncentraci CO2 v oddělené skupině buněk schopných jeho vazby Calvinovým cyklem vyžaduje jisté provozní náklady. Na každou fixovanou molekulu CO2 je nutno vynaložit energii nejen tří molekul ATP v Calvinově cyklu, ale ještě navíc 1 až 2 ATP na regeneraci fosfoenolpyruvátu. Z toho můžeme usoudit, že rostliny s fixační cestou C4 mohou být zvláště úspěšné za podmínek, kdy příkon zářivé energie není limitující, a kdy omezujícím faktorem je spíše nedostatečný přísun CO2 do listu. Také za vyšší teploty, která zvyšuje u C3- rostlin fotorespirační ztráty, je výhodnější cesta C4 Je proto pochopitelné, že nejvíce druhů rostlin s fixační cestou C4 nacházíme v tropických a subtropických zemích. Celkem se jedná asi o tisíc druhů z 16 čeledí, u kterých byla tento typ metabolismu dosud dokázán. Nejpočetnější skupinu tvoří tropické trávy (včetně hospodářsky významných druhů, jako je proso, cukrová třtina a kukuřice), ale také asi 300 druhů dvojděložných bylin. C4- cesta se nevyskytuje u řas, mechů a nahosemenných, ani u většiny listnatých stromů a keřů. V naší flóře (pokud nepočítáme zmíněnou introdukovanou kukuřici, proso a některé zavlečené plevelné trávy) se vyskytují rostliny C4 jen zcela vyjímečně. Jde především o nepočetnou skupinu druhů teplomilných trav (např. rodů Digitaria, Bothriochloa, Setaria a Cynodon). METABOLICKÉ PROCESY 17 Fixační cesta CAM Ve velmi rozsáhlé a taxonomicky rozmanité skupině sukulentních rostlin nacházíme další zajímavou metabolickou variantu fotosyntetické asimilace CO2, označovanou jako fixační cesta CAM (z angl. Crassulacean Acid Metabolism, neboť byla poprvé zjištěna u rostlin čeledi tlusticovitých, Crassulaceae). Také zde, obdobně jak u rostlin C4, dochází nejprve k vazbě HCO3 na fosfoenolpyruvát a v druhé fázi ke karboxylaci v Calvinově cyklu. Celá řada dalších znaků je však zcela specifická. První zvláštnost spočívá v tom, že oba karboxylační procesy probíhají v téže buňce. Nejsou odděleny prostorově, ale zato časově - neprobíhají současně. Dalším svérázným znakem je prvotní karboxylace v cytosolu zprostředkovaná PEPkarboxylázou. Probíhá totiž pouze v noci. Na rozdíl od C4-rostlin neprobíhá současně dekarboxylace, a tak substrát pro karboxylaci (fosfoenolpyruvát) nemůže být doplňován z uzavřeného cyklu. Musí být tudíž obstaráván glykolýzou a přídavnými reakcemi ze škrobu. Třetím rysem je hromadění kyseliny jablečné (která vzniká z primárního produktu karboxylace, oxalacetátu) v průběhu noci ve velkých vakuolách. Její koncentrace může dosahovat až 0,3 M, a pH vakuolární šťávy klesá až k hodnotě 4. Pro správnou funkci cesty CAM je proto velmi důležitá jednak dostatečná velikost vakuoly, ale i schopnost tonoplastu udržet obrovský koncentrační rozdíl ve vodíkových iontech mezi vakuolou a cytosolem. Konečně čtvrtou specifitou je regulace druhé fixace CO2. Za světla je kyselina jablečná transportována do cytosolu, kde je dekarboxylována. Uvolněný CO2 je v chloroplastech využit Calvinovým cyklem. Nyní se však oprávněně můžeme ptát, proč je CO2 na světle spotřebováván právě Calvinovým cyklem, když je přítomna i účinnější PEP-karboxyláza? Schéma fixační cesty typu CAM. Správná funkce celé fixační cesty a časová posloupnost jednotlivých reakcí je nepochybně podmíněna dokonalou regulací aktivity enzymů. Zdaleka ne všem regulačním mechanismům rozumíme. Víme však, že PEP-karboxyláza se v rostlinách s fixační cestou CAM vyskytuje ve dvou reverzibilních formách. Za tmy je to forma aktivní (dokonale funkční a navíc necitlivá ke koncentraci malátu). Působením záření však přechází do formy inaktivní (s velmi malou afinitou k CO2 a ta je ještě navíc silně inhibována přítomností malátu). Tyto změny jsou provázeny fosforylací (za tmy) a defosforylací (za světla) serinové složky v její molekule. Je pozoruhodné, že aktivita PEP-karboxylázy v rostlinách typu C4 je regulována právě opačně - v aktivní formě se vyskytuje pouze za světla. METABOLICKÉ PROCESY 18 Světlem je ovšem aktivována celá řada jiných enzymů (z toho pět jen v Calvinově cyklu!) a mechanismus aktivace je v současné době intenzivně zkoumán. U některých enzymů jde jen o redukci disulfidických skupin na sulfhydrylové na světle, někdy je to mnohem komplexnější problém, jako např. v případě enzymu Rubisco. U fixační cesty CAM, obdobně jako u C4, se prakticky neuplatňuje fotorespirace. Je to opět dáno tím, že k fixaci CO2 Calvinovým cyklem dochází za podmínek velmi vysoké koncentrace CO2 (po uvolnění z malátu, až 5000 cm3 .m-3 !). Tato koncentrace zcela potlačuje oxygenázovou aktivitu Rubisco. I přesto jsou však energetické náklady na fixaci jedné molekuly vyšší než u cesty C4. Kromě spotřeby 1 až 2 ATP na zpracování malátu (jako u C4-cesty), ještě navíc přistupuje potřeba 1 ATP na aktivní transport jedné molekuly malátu do vakuoly (zpětný transport je pasivní) a 0,5 ATP na jednu molekulu CO2 při syntéze rezervních sacharidů (ty jsou nutné jako zdroj energie při tvorbě PEP v noci). Fixační cesta CAM se vyskytuje přibližně u 15 tisíc druhů z více než 40 čeledí. Některé čeledi mají prakticky všechny druhy typu CAM (např. Crassulaceae, Cactaceae, Mesembryanthemaceae), avšak obvykle je sukulence a výskyt fixační cesty CAM vyhrazen jen některým zástupcům. Vazba sukulence a metabolismu CAM je pochopitelná, neboť velké vakuoly jsou potřebné ke zvýšení úložné kapacity pro malát. Tedy naprostá většina rostlin s fixační cestou CAM je více či méně sukulentní. Obráceně to však neplatí - zdaleka ne všechny sukulenty mají fixační cestu CAM. Tím, že u rostlin s fixační cestou CAM jsou přítomny oba karboxylační enzymy ve stejných buňkách (není zde prostorové oddělení a dvojí druh chloroplastů jako u C4-rostlin), jsou také možné různé odchylky od popsaného typického průběhu opakované karboxylace CO2. U řady druhů není využíván k denní fixaci Calvinovým cyklem pouze CO2 získaný dekarboxylací malátu, ale i přímo přijímaný ze vzduchu (zejména po vyčerpání zásob malátu). Známe však i takové druhy, které mají sice všechny předpoklady pro CAM metabolismus, ale značnou část svého života je vůbec nevyužívají a asimilují k nerozeznání stejně jako běžné C3 rostliny. Možnost přechodu z fixační cesty C3 na CAM jim však umožňuje používat fixační cestu CAM za takových podmínek, kdy je to výhodnější. To tedy znamená, že mají možnost dokonale přizpůsobovat svůj metabolismus velmi široké amplitudě kolísání faktorů vnějšího prostředí. Je poučné sledovat, za jakých podmínek využívají tyto druhy fixační cestu CAM, neboť z toho můžeme dedukovat, jaké vnější tlaky vlastně vedly k jejímu vzniku. METABOLICKÉ PROCESY 19 Přechod na fixační cestu CAM (= indukce CAM u těch rostlin, které jsou toho schopny) probíhá jen tehdy, kdy je nutné či výhodné omezit ztráty vody transpirací: - za nedostatku vody v půdě (nejčastější případ), - za vysoké teploty (např. u rostlin rodů Sedum, Sempervivum). - při zasolení půdy (omezení transpirace vede k menšímu příjmu solí), Je zcela nepochybné, že hlavní výhody fixační cesty CAM se uplatňují za nedostatku vody. Jedinečná schopnost CAM-rostlin přijímat CO2 v noci, kdy relativní vlhkost vzduchu je vysoká a tudíž ztráty vody z listů jsou minimální, umožňuje těmto rostlinám na jednotku vydané vody vytvořit asi desetkrát větší množství biomasy. Druhy s fixační cestou CAM také mohou za krajně nepříznivých podmínek mít průduchy dlouhodobě uzavřeny a provádět vnitřní recyklaci CO2 uvolněného z respiračních procesů. To jiné rostliny nemohou. Hlavní lokality s výskytem rostlin s fixační cestou CAM leží v aridních oblastech tropů a subtropů. Jen málo z nich je mrazuvzdorných - právě pro velký obsah vody ve svých buňkách. Souhrnné zhodnocení účinnosti fixace CO2 na úrovni chloroplastů Celkovou termodynamickou účinnost fotosyntetických procesů určujeme jako poměr mezi množstvím energie vázané v nově vytvořených asimilátech, a energií fotonů, která byla při tvorbě těchto asimilátů spotřebována. Hodnoty účinnosti fotosyntézy jsou nepochybně důležitým měřítkem rozdílů v potenciálních schopnostech rostlin vytvářet novou biomasu, avšak jejich stanovení není vůbec jednoduché. Důvodů je hned několik. Především hodnoty účinnosti jsou silně závislé na rychle proměnlivých faktorech, jako je např. množství záření, koncentrace substrátů či aktivita enzymů, a lze je tudíž určovat jen pro jisté zjednodušené podmínky. Dále je nutné se rozhodnout co vlastně budeme považovat za vstupní energetické hodnoty - zda energii všech fotonů, které dopadají na list a chloroplasty, a nebo pouze energii fotonů absorbovaných asimilačními pigmenty. Při teoretickém hodnocení účinnosti fotosyntetické fixace CO2 je užitečné posuzovat odděleně energetické přeměny v primárních a sekundárních procesech. Kolik je vlastně potřeba chemické energie na fixaci jednoho molu CO2 ? Víme, že k zabudování jedné molekuly CO2 do asimilátů v Calvinově cyklu jsou nutné dvě molekuly NADPH a tři molekuly ATP. Energetický požadavek na tvorbu jednoho molu NADPH je přibližně 220 kJ, a na tvorbu molu ATP nanejvýš 50 kJ (přesné hodnoty jsou závislé na podmínkách, za kterých reakce probíhají). Fixace jednoho molu CO2 je tudíž spojena s náklady asi 590 kJ. METABOLICKÉ PROCESY 20 Na Calvinův cyklus jsou ale obvykle napojeny ještě další reakce, které jsou v podstatě neodělitelně spojeny s fixací CO2 a které celkové náklady na fixaci zvyšují. U C3- rostlin je to fotorespirace, u rostlin s fixační cestou C4 a CAM opakovaná karboxylace. Z údajů uvedených v tabulce je zřejmé, že fotorespirační ztráty u C3- rostlin zvyšují celkové náklady na fixaci CO2 více, než koncentrační mechanismy u rostlin typu C4 a CAM. Uvedená účinnost biochemických procesů fotosyntézy byla vypočítána jako poměr mezi energetickým ziskem (= obsahem volné energie v 1 molu vytvořené fruktózy, měřeno jejím spalným teplem, 2804 kJ mol-1 ) a náklady (= celková spotřeba energie na tvorbu 1 molu fruktózy příslušnou fixační cestou). Srovnání energetických nákladů a účinnosti v sekundárních (biochemických) procesech fotosyntetické asimilace CO2 u tří hlavních typů fixačních cest . Pro výpočet celkové účinnosti fotosyntézy (včetně primárních procesů) nás v prvé řadě zajímá, jaké jsou maximální hodnoty této účinnosti. Obvykle vycházíme z odhadu minimálního počtu fotonů, jejichž energie je nutná pro tvorbu patřičného množství NADPH a ATP pro sekundární procesy. Z dřívějšího výkladu (viz str. 10) již víme, že k redukci jedné molekuly CO2 jsou nutné dvě molekuly NADPH a tři molekuly ATP. K redukci dvou molekul NADP+ na NADPH jsou potřeba čtyři elektrony, které se uvolní ze dvou molekul vody za spotřeby energie z osmi fotonů, neboť dva fotony (v každém fotosystému jeden) jsou nutné na transport jednoho elektronu necyklickou cestou. Tedy osm fotonů je absolutní minimum pro zabezpečení nejen 2 NADPH, ale i 3 ATP potřebných na fixaci jedné molekuly CO2, jak již bylo uvedeno na str. 10. Vzhledem k uvedeným hodnotám účinnosti (tedy i ztrátovosti) biochemických procesů je k zabezpečení asimilace jedné molekuly CO2 zapotřebí obvykle minimálně 12 fotonů, jak bylo dokázáno i experimentálně. Pro tvorbu jednoho molu fruktózy potřebujeme tedy 6 x 12 = 72 molů fotonů. Jeden mol fotonů červeného světla (680 nm) předává při absorbci v asimilačních pigmentech energii 175 kJ, tudíž na zisk jednoho molu fruktózy (2804 kJ) jsou náklady 72 x 175 = 12600 kJ. Maximální účinnost (zisk/náklady) celého procesu fotosyntetické asimilace CO2 je tedy přibližně 2804/12 600 = 0,22 (= 22%). Uvedené výpočty vycházely ze záření absorbovaného v asimilačních pigmentech a plně zužitkovaného pro transport elektronů. Jak uvidíme ještě v další kapitole, využití záření dopadajícího na list je mnohem menší, neboť přibližně 15 % fotosynteticky aktivního záření není listem vůbec absorbováno (část se odrazí, část je propuštěna), a jistý podíl absorbují i jiné součásti listu než asimilační pigmenty. Se vzrůstající hustotou toku fotonů roste také množství záření které sice bylo absorbováno asimilačními pigmenty, ale nemohlo být využito ve fotosyntéze pro omezenou kapacitu přenosu elektronů v primárních procesech fotosyntézy. METABOLICKÉ PROCESY 21 METABOLICKÉ PROCESY 22 Studium fotosyntetické asimilace CO2 u celých listů a rostlin Pro své výjimečné postavení v životě rostliny je fotosyntetická asimilace CO2 intenzivně studována nejen metodami bichemické a biofyzikální analýzy buněčných struktur, ale i na úrovni listů, celých rostlin či dokonce porostů. Hlavní pozornost při tomto studiu není obvykle zaměřena na detailní poznání podstaty asimilačních procesů, ale spíše na hledání vnitřních a vnějších faktorů omezujících rychlost fotosyntézy u asimilujících orgánů intaktních rostlin. Cílem takovéhoto výzkumu fotosyntézy je jednak poznání mechanismu řídícího rychlost fotosyntézy u struktur s vyšší úrovní integrace, ale i konkrétní aplikace získaných poznatků, např. v zemědělské výrobě či při ekologickém studiu přirozené vegetace. V každém případě tento přístup vyžaduje používat vhodné nedestruktivní metody. Daleko nejčastěji je fotosyntéza sledována pomocí měření rychlosti příjmu CO2 do listů, méně často (např. u vodních rostlin) je používáno měření rychlosti výdeje kyslíku. Odhad rychlosti fotosyntézy z měření rychlosti výměny plynů (gazometrické metody) je komplikován respiračními procesy v mitochondriích, které probíhají i na světle a jsou též spojeny s výměnou plynů. Pomocí gazometrie tedy nemůžeme měřit skutečnou rychlost fixace CO2 v chloroplastech (která bývá označována jako hrubá fotosyntéza), ale pouze rychlost čisté fotosyntézy, což je rychlost hrubé fotosyntézy zmenšená o rychlost současně probíhajících respiračních procesů spojených s výdejem CO2, který se po uvolnění z mitochondrií znovu fixuje v chloroplastu. Záření a teplota jako hlavní vnější faktory řídící rychlost fotosyntézy Pokud provádíme v přírodních podmínkách dlouhodobá měření rychlosti fotosyntézy a současně registrujeme i nejrůznější vnější abiotické faktory, můžeme pak stanovit jejich významnost pomocí statistických metod. Nejtěsnější korelace bývá téměř vždy zjišťována mezi fotosyntézou a zářením, na druhém místě je obvykle teplota. Množství záření kolísá v denních i ročních cyklech a navíc v porostech se mění v závislosti na umístění listů v prostoru. Při studiu fotosyntézy nás zajímá pouze ta část spektra, která je absorbována asimilačními pigmenty, tedy přibližně v rozmezí vlnových délek 400 až 700 nm (= fotosynteticky aktivní radiace, FAR). Množství záření dopadající na jednotku listové plochy za jednotku času měříme jako ozářenost v jednotkách toku energie (W.m-2 ), či jako hustotu toku fotosynteticky aktivních fotonů (zkráceně PPF, z angl. Photosynthetic Photon Flux, mol.m-2 s-2 ). Maximální hodnoty za jasného letního dne činí 400 až 500 W.m-2 , či 2000 až 2200 µmol.m-2 s-2 FAR. Rychlost čisté fotosyntézy nejčastěji měříme počtem molů CO2 přijatých jednotkou listové plochy za sekundu. .Vztah mezi rychlostí čisté fotosyntézy a ozářeností listu není lineární, nýbrž má tvar limitní křivky charakteristického tvaru. Tradičně bývá označována jako světelná křivka fotosyntézy. Její počátek na abscise leží u takové hodnoty ozářenosti, při které je rychlost hrubé fotosyntézy (= fixace CO2) právě dostatečná na spotřebu CO2 vydávaného z respiračních procesů (výměna CO2 s okolním vzduchem je v tom případě nulová). Označujeme ji jako kompenzační ozářenost, (dříve též světelný kompenzační bod). Hodnota kompenzační ozářenosti je závislá především na rychlosti respirace (a tudíž i na teplotě), a také na strukturních charakteristikách listů. Obojí však může být opět závislé na druhu rostliny a podmínkách, za kterých roste. Nejčastěji se pohybuje v rozmezí 1 až 5 W m-2 (= přibližně 5 až 20 µmol m-2 s-2 FAR). Rychlost fotosyntézy při vzestupu ozářenosti nad kompenzační úroveň zpočátku stoupá téměř lineárně, později se však zpomaluje a dále již nevzrůstá - bylo dosaženo nasycení fotosyntézy zářením. Hodnotu ozářenosti, při které k nasycení došlo, nazýváme saturační ozářenost. Také v hodnotách saturační ozářenosti jsou obrovské rozdíly dané strukturními vlastnostmi listů (tenké listy ji mají vždy nižší) i kapacitou biochemických procesů. Obecně platí, že listy s nízkou hodnotou saturační ozářenosti mají i nízkou rychlost fotosyntézy při nasycení zářením. Již pouhým pohledem na světelnou křivku zjistíme, že největší přírůstek rychlosti fotosyntézy na jednotku přírůstku záření je na jejím počátku, tedy v oblasti nízkých hodnot ozářenosti. Uvedený poměr se nazývá kvantový výtěžek fixace CO2: počet molů fixovaného CO2 Q = počet molů fotonů pohlcených listem Při přesném výpočtu kvantového výtěžku vycházíme ze záření listem pohlceného - je tedy nutné běžně měřené množství dopadajícího záření korigovat hodnotami odrazivosti a propustnosti příslušného listu. Převrácenou hodnotu kvantového výtěžku označujeme jako kvantový požadavek. Za nízké úrovně záření je rychlost fotosyntézy omezena především dodávkou energie (ve formě ATP a NADPH) z primárních (fotochemických) procesů. Proto hodnoty kvantového výtěžku, zjištěné ze sklonu počátečního, (lineárního) úseku světelných křivek,jsou vždy nejvyšší (většinou v rozmezí 0,5-0,6), se stoupající ozářeností rychle klesají Rychlost fotosyntézy listů za vysokých hodnot ozářenosti (oblast plató světelných křivek, nasycení fotosyntézy zářením) není obvykle určována jediným faktorem - kromě nedostatečné kapacity sekundárních (biochemických) procesů může mít velký vliv i malá difuzní vodivost průduchů a také hromadění produktů fotosyntézy. Způsob, jakým určujeme významnost jednotlivých omezujících činitelů, bude popsán v další kapitole. Teplota je vedle záření druhým nejvýznamnějším vnějším faktorem, který ovlivňuje rychlost fotosyntézy. Teplota kolísá v pravidelných denních i ročních cyklech. Teplotní optimum pro čistou fotosyntézu leží u většiny rostlin s fixační cestopu C3 v rozmezí 15 až 25 °C zatímco u C4-rostlin bývá obvykle vyšší (25 až 35 °C). METABOLICKÉ PROCESY 23 Závislost rychlosti čisté fotosyntézy listů kukuřice (C4-rostlina) a pšenice (C3) na teplotě. Minimální a maximální teploty mohou být značně ovlivněny dobou působení teploty, teplotní optima jsou stálejší. Čím je vlastně určována teplotní závislost fotosyntézy ? Primární (fotochemické) procesy se v běžném rozsahu teplot mění jen velmi málo. Citlivěji reagují sekundární ( biochemické) procesy fotosyntézy. Jejich rychlost se s teplotou zvyšuje až po hodnotu zhruba 40°C, kdy začíná denaturace enzymů. Křivka teplotní závislosti čisté fotosyntézy, měřené z výměny plynů, nemá ovšem tvar čisté teplotní závislosti enzymatické aktivity, neboť nutně dochází k interferenci s kladnou teplotní závislostí mitochondriální respirace. U C3- rostlin navíc s teplotou vzrůstá oxygenázová aktivita Rubisco a tudíž i fotorespirace. Minimální teploty při kterých je ještě měřitelná čistá fotosyntéza jsou u většiny druhů rostlin mírného pásma v rozmezí 0 až -3 °C, zatímco růst těchto druhů se zastavuje již při teplotách blízkých +5 °C. Fotosyntéza za nízkých teplot (blízkých nule) vede tedy k hromadění nevyužitých asimilátů. U mrazuvzdorných druhů (např. naše jehličnaté stromy, řada druhů trav včetně ozimých odrůd obilí) bývá čistá fotosyntéza měřitelná ještě při nižších teplotách (-5 až -7 °C). Také teplotní optimum fotosyntézy bývá u těchto druhů v zimních měsících posunuto směrem k nižším teplotám. Stanovení významnosti faktorů omezujících rychlost fotosyntézy Rychlost fotosyntézy listu či celé rostliny se mění ve velmi širokém rozmezí jak v průběhu dne, tak i během vegetačního období. Není to však pouze v důsledku kolísání faktorů vnějšího prostředí, ale i v důsledku vnitřního stavu asimilačního aparátu, zejména funkčních předpokladů dílčích biochemických reakcí. Na změnách rychlosti fotosyntézy studované na orgánové úrovni se podílejí i morfologické a anatomické charakteristiky. Ty určují např. maximální vodivost difuzních drah pro CO2 v listech, či počet a uspořádání chloroplastů v mezofylových buňkách. Proto při podrobnějším zkoumání příčin rozdílů v rychlosti fotosyntézy nevystačíme pouze se systematickým měřením této rychlosti u rostlin v přírodních podmínkách a s následným statistickým vyhodnocením. Je zapotřebí provádět i pokusy v řízeném prostředí s promyšleně navozovanými změnami jednotlivých zkoumaných faktorů. Neméně důležitá je i schopnost správně interpretovat zjištěné reakce, posoudit jejich postavení v dlouhém a složitém řetězci příčin a následků. Při kauzální analýze rozdílů v rychlosti fotosyntézy je velmi užitečné rozdělit si možné řídící proměnné do jisté hierarchické posloupnosti. Vyjděme z ústředního postavení Calvinova cyklu u běžných rostlin s C3-fixační cestou. Omezení rychlosti fixace může bezprostředně (primárně) způsobovat: 1) Karboxylační aktivita enzymu Rubisco (která závisí hlavně na jeho množství) a dále na koncentraci CO2 a O2 v chloroplastu. Za normálních okolností je koncentrace O2 vcelku stálá a omezující vliv má pouze koncentrace CO2. Její hodnoty (i při stálém složení vnějšího METABOLICKÉ PROCESY 24 vzduchu) jsou závislé na vodivosti difuzních cest v listu, především na vodivosti průduchů. 2) Rychlost primárních (fotochemických) procesů, která je závislá na množství záření, asimilačních pigmentů, přenašečů elektronů, atd. 3) Hromadění produktů fixace CO2. Malá rychlost přeměny fosforylovaných intermediátů na konečné produkty (škrob, sacharóza) vede k blokování fosfátových iontů v cytosolu a k jejich nedostatku v chloroplastech. Pomocí gazometrických metod můžeme i u celých nepoškozených rostlin určit, který z uvedených tří procesů má v daném okamžiku největší omezující vliv. Základní postup takovéto analýzy spočívá ve stanovení závislosti rychlosti čisté fotosyntézy na záření ("světelných křivek") a na koncentraci CO2 (CO2 - křivek). Interpretace světelných křivek je poměrně jednoduchá: počáteční, přibližně lineární část křivky, vymezuje interval hodnot ozářenosti, ve kterém asimilaci CO2 omezuje nedostatečná rychlost primárních procesů. Za saturační ozářenosti může být rychlost fotosyntézy určována jak nedostatečnou karboxylační aktivitou, tak i hromaděním produktů fixace. Rozlišení těchto dvou omezujících vlivů je možné po náhlém zvýšení koncentrace CO2 (či snížení O2) ve vzduchu - pokud se rychlost fotosyntézy nezmění, pak se jedná o limitaci asimiláty. Poněkud náročnější je celková analýza závislosti čisté fotosyntézy na koncentraci CO2. Je známo, že tato závislost je u většiny rostlin (zejména s fixační cestou C3) téměř lineární až do hodnot, které jsou v čistém vzduchu běžné (okolo 350 cm3 .m-3 ). Kompenzační koncentrace CO2 (= průsečík CO2-křivky s abscisou) je u C4 rostlin obvykle nulová či velice blízká nule. U všech C3 rostlin je vyšší než nula, nejčastěji v rozmezí 35 až 50 cm3 .m-3 . Hlavní příčinou těchto rozdílů je fotorespirační výdej CO2 u C3 rostlin. Potlačíme-li fotorespiraci (snížením koncentrace kyslíku ve vzduchu na 2%), pak rozdíly mezi oběma skupinami rostlin zmizí. Za dostatku záření je normální koncentrace CO2 ve vzduchu nedostatečná pro zajištění takové rychlosti jeho toku do chloroplastů, která by odpovídala kapacitě fotochemických a biochemických procesů u C3-rostlin. Zvýšení koncentrace CO2 ve vzduchu až do hodnot asi 1000 cm3 .m-3 obvykle zvyšuje rychlost čisté fotosyntézy. Limitujícím faktorem fotosyntézy není pouze vnější koncentrace CO2 ale i vodivost difuzních cest pro CO2. Uvnitř listu (v intercelulárách a v chloroplastech) bývá při aktivní fotosyntéze koncentrace CO2 snížena přibližně o 20 až 50% ve srovnání s okolním vzduchem, což je právě dáno omezenou difuzní vodivostí listu. Navíc je tato vnitřní koncentrace silně závislá na změnách v otevřenosti průduchů, které lze často obtížně předvídat. METABOLICKÉ PROCESY 25 Přesné stanovení závislosti rychlosti fotosyntézy na CO2 musí proto vycházet nikoli z jeho koncentrace ve vzduchu v okolí listu, ale v intercelulárách (Ci). Neumíme ji sice přímo měřit, ale můžeme ji vypočítat z rychlosti toku CO2 do listu (= z gazometricky naměřené rychlosti čisté fotosyntézy, A), z vodivosti listu pro CO2 (gCO) a z koncentrace CO2 ve vnějším vzduchu (Ca): Ci = Ca - A/gCO Počáteční lineární úsek závislosti A na Ci (měříme ji vždy za saturační ozářenosti!) vymezuje oblast, kdy je fotosyntéza limitována pouze aktivitou Rubisco. Z jeho sklonu lze vypočítat účinnost karboxylace. Energetické zabezpečení fotosyntézy z primárních procesů je dostatečné a také její limitace hromaděním asimilátů nepřichází v úvahu. Tyto dva procesy naopak rozhodují o maximální rychlosti fotosyntézy při saturačních hodnotách Ci (= plató CO2-křivky). Za normální koncentrace CO2 ve vzduchu (350 cm3 .m-3 ) a saturační ozářenosti se hodnoty Cp pohybují nejčastěji mezi 200 až 250 cm3 .m-3 , což bývá právě v oblasti největšího ohybu A/Ci-křivek. Rychlost fotosyntézy je v tom případě omezována jak karboxylační kapacitou (aktivitou Rubisco), tak rychlostí fotochemických procesů, případně i hromaděním asimilátů. Je proto vhodné dále určovat i relativní podíl těchto faktorů na omezení rychlosti fotosyntézy, např. z reakce na snížení koncentrace O2 (zvýší se karboxylační aktivita o definovaný stupeň), nebo z reakce na náhlou a krátkodobou změnu v ozářenosti. Pokud dojde po této změně k oscilacím v rychlosti fotosyntézy, svědčí to o limitaci hromaděním asimilátů. Z křivek závislosti A na Ci můžeme také určovat relativní podíl nedostatečné vodivosti listu pro CO2 (je dána především vodivostí průduchů) na omezení rychlosti fotosyntézy. Tento podíl zjistíme ze srovnání hodnoty A při skutečné Ci s teoretickou hodnotou A při Ci = Ca (tedy pro případ, kdy difusní tok CO2 do listu by nebyl ničím omezován). Závislost světelně nasycené rychlosti čisté fotosyntézy na koncentraci CO2 v intercelulárách (A/Ci-křivka) a její využití při analýze limitujících faktorů fotosyntézy. Z rozdílu A1-A2 lze určit omezení rychlosti fotosyntézy nedostatečnou vodivostí difuzních cest pro CO2. Bližší vysvětlení je v textu. Dosavadní studium limitujících faktorů rychlosti fotosyntézy u rostlin v přirozených podmínkách ukazuje, že jen zřídka lze označit pouze jeden faktor (či řídící komplex) za limitující. Na řízení rychlosti fotosyntézy se obvykle podílí více mechanismů. současně a střídá se pouze jejich relativní významnost. Regulační mechanismy směřují k optimálnímu využití všech součástí asimilačního aparátu . Směřují tedy k takovému takovému stavu, kdy v daném prostředí není žádná z těchto součástí ve výrazném přebytku či nedostatku. METABOLICKÉ PROCESY 26 METABOLICKÉ PROCESY 27 Zvláště názorně můžeme tuto optimalizaci struktur a funkcí pozorovat u rostlin rostoucích za dlouhodobě nepříznivých podmínek. Při trvalém nedostatku záření (v zastínění) je v listech velmi malý obsah Rubisco i jiných enzymů, zato je udržováno velké množství asimilačních pigmentů ve světlosběrných komplexech. Počáteční sklon CO2-křivek a plató světelných křivek má proto jen nízké hodnoty, ovšem to jsou oblasti, ve kterých tyto listy běžně neoperují. Obdobný charakter fotosyntetických závislostí mají i rostliny rostoucí za nedostatku dusíku. Ve všech těchto případech přesto zjišťujeme hodnoty Ci lokalizované do oblasti ohybu CO2-křivek, což tedy znamená limitaci rychlosti fotosyntézy více dílčími procesy současně. Při studiu fotosyntézy na úrovni celých rostlin je v současné době věnována velká pozornost dvěma problémům, které spolu částečně souvisejí. Je to jednak vliv trvale zvýšené koncentrace CO2 ve vzduchu na rychlost čisté fotosyntézy, a dále ovlivňování fotosyntézy rychlostí odběru asimilátů z listů. Koncentrace CO2 ve vzduchu je sice z krátkodobého hlediska poměrně stálá (denní a roční výkyvy jsou zřídka větší než ±10%), ovšem z každoročního přírůstku průměrné koncentrace lze usoudit, že ke zvýšení na dvojnásobek současného stavu by mohlo dojít už během tohoto století. Při této změně (z 360 na 720 cm3 .m-3 ) se rychlost fotosyntézy většiny běžných druhů C3-rostlin zvyšuje přibližně o 40 až 50%, což se může projevit i v podstatném zrychlení růstu. Zvýšená koncentrace CO2 stimuluje rychlost čisté fotosyntézy nejen proto, že Rubisco má k CO2 poměrně malou afinitu a při normální koncentraci CO2 zdaleka nemůže být v nasyceném stavu, ale i díky potlačené fotorespiraci.(u C3-rostlin). Pokusy s dlouhodobou expozicí rostlin v uměle vytvořené atmosféřese zvýšenou koncentrací CO2 (700 cm3 .m-3 po několik měsíců až roků) ukazují, že za jistou dobu může dojít k postupnému poklesu rychlosti fotosyntézy ve srovnání s hodnotami na počátku expozice. Tento pokles souvisí se snížením aktivity enzymů (především Rubisco) a s hromaděním asimilátů v listech. Ovšem zdaleka ne všechny dosud testované druhy takto reagovaly. Snížení rychlosti fotosyntézy v důsledku hromadění asimilátů (způsobené jejich nedostatečným využíváním) není pouze problémem u rostlin pěstovaných za zvýšené koncentrace CO2, které mají velmi zrychlenou fotosyntézu. Je velmi závažný i za normální koncentrace CO2 ve vzduchu, a sice za takových podmínek, kdy rostliny mají malou kapacitu pro ukládání asimilátů ve formě zásobních látek a současně je nemohou ani využívat ke zrychlení růstu, ať už z důvodů morfogenetických, či v důsledku inhibice růstu vnějšími faktory (vodní stres, nízká teplota, atd.). Současný výzkum vztahů mezi využíváním asimilátů a fotosyntézou se zaměřuje na řešení několika otázek současně. Především jde o vysvětlení mechanismu inhibice fotosyntézy, což předpokládá porozumět biochemické regulaci složitého metabolismu cukrů v buňkách (mimo chloroplasty). Najít tedy příčiny, které vedou ke zpomalení tvorby sacharózy (jako hlavního cukru transportovatelného do jiných orgánů), k hromadění fosforylovaných cukrů a tím i k nedostatku fosfátových iontů v chloroplastech. U řady druhů však nelze negativní vztah mezi rychlostí fotosyntézy a koncentrací jakékoliv cukerné sloučeniny vůbec dokázat, i když při zvýšeném odběru asimilátů jinými orgány dochází i u těchto rostlin k výraznému zrychlení fotosyntézy. Velké úsilí je též v současné době soustředěno na poznání mechanismu, který řídí zvětšování úložné kapacity pro asimiláty (růst zásobních orgánů, semen, nových odnoží, atd.) v závislosti na zrychlení fotosyntézy. To jsou však již problémy, které mohou být řešeny pouze ve spolupráci jak s biochemií, tak i s růstovou fyziologií (fytohormonální regulace) a s molekulární biologií rostlin. Respirační procesy Téměř polovina všech sacharidů vytvořených fotosyntetickou asimilací oxidu uhličitého je v průběhu dne opět rozložena v souběžně probíhajících biochemických reakcích, které se souhrnně označují jako respirace. Tento rozklad bývá spojen s příjmem kyslíku a jeho konečným produktem je oxid uhličitý a voda. Zdaleka ne všechny molekuly rozkládaného substrátu jsou však oxidovány až na CO2. Smyslem respirace není totiž pouze přeměna energie a její zpřístupnění pro jiné procesy, ale i tvorba jednodušších organických molekul, které jsou využity jako základní stavební moduly v navazujících syntetických procesech. Obdobně jako u fotosyntézy, celý komplex respiračních procesů můžeme rozdělit do několika na sebe navazujících skupin: • rozklad primárního substrátu na jednodušší části (glykolýzou a oxidačním pentózovým cyklem, převážně v cytosolu), • citrátový cyklus v matrix mitochondrií, • elektronový transport a oxidační fosforylace na membránách mitochondrií. Rozklad primárního substrátu v cytosolu V každé rostlinné buňce je pohotovostní zásoba rychle využitelného substrátu, tvořeného především sacharózou a fosforylovanými hexózami (glukóza-1-fosfát, glukóza-6-fosfát, fruktóza-6-fosfát). Tato zásoba se neustále doplňuje, a to jednak z nových fotosyntátů (transportem triózafosfátů, především glyceraldehyd-3-fosfátu z chloroplastů), jednak rozkladem složitějších sacharidů, zejména sacharózy, škrobu a fruktosanů, ale v jistých případech i lipidů a proteinů. METABOLICKÉ PROCESY 28 Klasické schema glykolýzy začíná od molekuly hexózy, ze které po devíti krocích a za účasti deseti různých enzymů vznikají dvě molekuly pyruvátu. Molekula hexózy se nejprve dvakrát fosforyluje a pak rozpadá na dvě fosforylované triózy. Klíčové postavení pro další reakce má glyceraldehyd-3-fosfát, který slouží jako donor vodíku pro redukci pyridinového METABOLICKÉ PROCESY 29 nukleotidu (NAD+ na NADH). Při dalších přeměnách se tvoří pyruvát jako konečný produkt glykolýzy, a uvolněná fosfátová skupina přechází na ADP za vzniku ATP. U rostlin, na rozdíl od živočišných buněk, může být produktem glykolýzy kromě pyruvátu i malát. Ten vzniká také z fosfoenolpyruvátu podobně jako pyruvát, ovšem vedlejší metabolickou cestou přes oxalacetát. Tvorbu oxalacetátu katalyzuje PEP-karboxyláza. Energetický zisk glykolýzy je velmi malý - z jedné molekuly hexózy lze získat nanejvýš 2 ATP a 2 NADH, což představuje jen zlomek z celkové využitelné energie vstupního substrátu. Hlavní funkcí glykolýzy je tedy příprava jednodušších sloučenin (především pyruvátu a malátu, ale i jiných meziproduktů) pro další rozkladné i syntetické procesy. Pokud mají buňky dostatek kyslíku, většina produktů glykolýzy je dále oxidována v mitochondriích. Za nedostatku kyslíku glykolýza sice probíhá, avšak hromadící se produkty musí být zpracovány jinými cestami, souhrnně označovanými jako fermentace (kvašení). Akceptorem elektronů jsou v tom případě různé organické látky a konečným produktem nejčastěji kyselina mléčná nebo etanol. Při těchto reakcích dochází současně k regeneraci NAD+ , takže je zajištěn nerušený průběh glykolýzy. Při náhlém nedostatku kyslíku dochází obvykle nejprve ke tvorbě laktátu, ale později převažuje tvorba etanolu, který je relativně méně toxický (nepůsobí silné okyselení cytosolu). Reakce probíhající při glykolýze jsou reverzibilní a skutečně také můžeme někdy v rostlinách pozorovat syntézu sacharidů z pyruvátu, malátu či z jiných jednoduchých organických sloučenin vzniklých rozpadem větších necukerných molekul. Tento proces označovaný jako glukoneogeneze je hojně využíván při mobilizaci rezerv uložených ve formě tuků (např. při klíčení olejnatých semen). Paralelně s glykolýzou obvykle probíhá ještě jedna varianta rozkladu primárního substrátu označovaná jako oxidační pentózový cyklus. Na rozdíl od glykolýzy umožňuje úplnou oxidaci hexóz až na CO2, aniž by musely být využívány mitochondriální procesy. V první fázi tohoto cyklu dochází k oxidaci jednoho uhlíku v hexóze až na CO2 za vzniku pentózy a dvou NADPH. Postupně se hromadící pentózové molekuly mohou být využity k tvorbě hexóz (regenerační fáze cyklu), a nebo též pro jiné syntézy. Pentózový cyklus je hlavním zdrojem NADPH v cytosolu. Velký význam mají i některé meziprodukty, např. ribóza-5-fosfát jako prekurzor pro tvorbu nukleotidů, erythróza-4-fosfát pro tvorbu fenolických sloučenin včetně ligninu. Asi 20 až 30 % sacharidů se rozkládá právě tímto cyklem. Je tedy pro rostliny nepostradatelný a jeho aktivita se snižuje pouze za anaerobních podmínek. Pentózový cyklus ovšem nemůže být nikdy hlavní respirační cestou, protože se v něm nevytváří ATP, který je pro většinu buněčných procesů nejpohotovějším a nenahraditelným zdrojem energie Pentózový cyklus probíhá nejen v cytosolu, ale i v chloroplastech, ovšem tam pouze za tmy. Inhibice světlem je nutná, aby se vyloučil jeho nepříznivý vliv na průběh Calvinova cyklu. Oxidační procesy v mitochondriích Oxidace pyruvátu, malátu a NADH, vytvořených v glykolýze, probíhá v mitochondriích. Tam je teprve dosaženo největšího energetického výtěžku. Mitochondrie jsou obdobně jako chloroplasty semiautonomní organely s dvojitou membránou, s vlastními ribozómy, DNA a RNA. Vnější membrána je poměrně dobře propustná i pro velké molekuly (přibližně do 10 kDa, tedy pro většinu buněčných metabolitů a iontů). Vnitřní membrána vytváří výrazné záhyby, označované jako kristy. V této membráně jsou hojné jednak transportní bílkoviny, (zvláště pak přenašeče: pro pyruvát, malát, HPO4 2, ATP a ADP), ale i proteinové komplexy na kterých probíhá oxidace NADH, transport uvolněných elektronů až na kyslík a tvorba ATP. Střední uzavřený prostor vyplňuje základní hmota (matrix) mitochondrie, ve které probíhá velké množství biochemických reakcí. Proto je mimořádně bohatá na enzymy a zpracovávané metabolity. Obvyklá stavba rostlinné mitochondrie Do rostlinné mitochondrie může vstupovat (přes specifické přenašeče) nejen pyruvát, ale i malát. Obrázek zachycuje obě tyto možnosti, které však nemusejí být využívány současně či stejně často. Pyruvát transportovaný z cytosolu je v matrix mitochondrie nejprve dekarboxylován uvolňuje se jedna molekula CO2 a acetátový zbytek je vnášen pomocí koenzymu A do vlastního citrátového cyklu (někdy bývá též nazýván jako cyklus trikarboxylových kyselin či Krebsův cyklus podle svého objevitele H.A.Krebse). V něm se navazuje na oxalacetát za vzniku šestiuhlíkaté kyseliny citronové, která v dalších sedmi krocích postupně ztrácí dva uhlíky (ve formě dvou molekul CO2). Malát je buď přímo včleněn do do citrátového cyklu, nebo je nejprve přeměněn na pyruvát. Postupnou oxidací jedné molekuly pyruvátu v citrátovém cyklu vznikne kromě 3 molekul CO2 i jedna molekula ATP, ale hlavně 3 NADH a 1 FADH2, ve kterých je uchováno ještě velké množství volné chemické energie. Ta se využívá na tvorbu ATP v navazujících membránových procesech. Ne vždy ovšem musí být veškerý malát nebo pyruvát oxidován v METABOLICKÉ PROCESY 30 celé soustavě reakcí. Citrátový cyklus je pro buňku významným centrem jak katabolických, tak i anabolických reakcí, zdrojem řady meziproduktů pro nejrůznější syntézy, zejména aminokyselin. Citrátový cyklus v rostlinných mitochondriích má některé zvláštnosti, které nenalézáme u živočišných. Je to např. přítomost jablečného enzymu, který umožňuje rozklad malátu na pyruvát, a tak zachovat funkčnost cyklu i při velkém odběru 2-oxoglutarátu na asimilaci amonných iontů. A je to také tvorba ATP místo u živočichů obvyklého GTP. Zjednodušené schéma citrátového cyklu (nejsou uvedeny enzymy nutné pro naznačené reakce). Konečný přenos elektronů z redukovaných sloučenin, vzniklých v citrátovém cyklu a při glykolýze, probíhá pomocí složité soustavy oxidoreduktáz, označované jako respirační řetězec. Redoxní systémy, které tvoří tento řetězec, jsou umístěny na několika funkčně propojených multiproteinových komplexech ve vnitřní membráně mitochondrie. Komplex I (NADH dehydrogenáza) slouží k redukci NADH (produkovaných citrátovým cyklem) a přenos uvolněných elektronů pomocí několika pevně vázaných redoxních systémů (flavinmononukleotid - FMN, a další tři až čtyři Fe-S redoxní centra). Elektrony jsou pak přenášeny na ubichinon, který je chemicky i funkčně podobný plastochinonům v chloroplastech. Molekuly ubichinonu (a jeho redukované formy ubichinolu či hydrochinonu) jsou volně pohyblivé v mitochondriální membráně a proto jsou důležitým prostředníkem pro několik navazujících reakcí. METABOLICKÉ PROCESY 31 Komplex II (sukcinátdehydrogenáza) zajišťuje přenos elektronů ze sukcinátu (ten je součástí citrátového cyklu!) na ubichinon pomocí redoxního systému FAD - FADH2 (flavinadenindinukleotid). Součástí komplexu II jsou též asi tři FeS-proteiny, fungující jako přenosové mezičlánky. V tomto komplexu nedochází k transmembránovému přenosu protonů. Komplex III (cytochrom BC1 komplex), obsahuje dva cytochromy b, cytochrom c1 a FeSproteiny. Tyto redoxní systémy zprostředkovávají přenos elektronů z ubichinolu na další mobilní přenašeč, cytochrom c. Komplex IV (cytochromoxidáza), obsahuje dva cytochromy typu a, které jsou schopny, díky specificky vázaným iontům mědi (kromě železa v hemové skupině), přenosu elektronů na konečný akceptor - kyslík. Kromě uvedených základních komplexů byly zjištěny v rostlinných mitochondriích ještě některé další pomocné systémy, umožňující v jistých úsecích hlavního řetězce souběžný transport elektronů. Především jde o dva komplexy dehydrogenáz, které mají obdobnou funkci jako komplex I. Jeden z nich je umístěn na vnější straně membrány, kde usnadňuje oxidaci NADPH (a také NADH) přicházejících z cytosolu. Další komplex NADHdehydrogenázy je připojen k vnitřní straně membrány a funguje zcela obdobně jako komplex I (liší se však citlivostí k některým inhibitorům). Hlavní proteinové komplexy ve vnitřní membráně mitochondrie a jejich součinnost při přenosu elektronů Redoxní výměny při oxidaci NADH na komplexu I a přenos elektronů nejběžnější cestou (přes ubichinony, a komplexy III a IV až na kyslík) jsou spojeny s přenosem vodíkových iontů z matrix do mezimembránového prostoru, jak je znázorněno na obrázku. Při jejich transportu zpět, hnaném vytvořeným elektrochemickým gradientem přes hojné ATP-syntázy (stejného typu a stejně účinné jako v chloroplastech) dochází k tvorbě ATP (= oxidační fosforylace) Molekuly ATP, které se hromadí v matrix, je nutno neustále transportovat o cytosolu, a naopak do mitochondrií přivádět ADP a fosfátové ionty. Pro tento transport slouží hojné antiportové přenašeče ve vnitřní membráně. Pozoruhodnou zvláštností dýchacího řetězce rostlinných mitochondrií je existence alternativní cesty, která umožňuje přenos elektronů z ubichinolu na kyslík i bez účasti cytochromových komplexů. Funguje tedy i po jejich zablokování kyanidem - proto bývá též označována jako kyanid-rezistentní cesta. Transport elektronů z ubichinolu na kyslík přes komplex "alternativní oxidázy" na vnitřní straně mitochondriální membrány není spojen s přenosem vodíkových iontů a proto ani potenciální energetický rozdíl přenosu nelze využít pro tvorbu ATP (dochází pouze k tvorbě tepla). Význam alternativní cesty pro rostliny je stále ještě předmětem výzkumu. Byla dokázána u všech dosud zkoumaných druhů a víme, že obvykle probíhá souběžně s cytochromovou METABOLICKÉ PROCESY 32 METABOLICKÉ PROCESY 33 cestou, i když méně intenzivně. Její podíl na celkovém toku elektronů však nápadně stoupá při velkém nadbytku respiračního substrátu (např. za vysoké rychlosti fotosyntézy v listech). Je proto možné, že jde o způsob jak zajistit rychlý rozklad substrátu (rychlejším odvodem elektronů) a přitom si zachovat pod kontrolou optimální množství vytvářeného ATP. Větší význam však alternativní cesta asi má jako regulační mechanismus pro udržování optimálního poměru mezi množstvím ATP, NADH a některými intermediátními produkty citrátového cyklu (např. 2-oxoglutarátu, spotřebovávaného při asimilaci amonných iontů). Vnitřní a vnější faktory řídící rychlost respirace Regulace rychlosti respiračních procesů je neobyčejně složitý problém. Je to dáno především tím, že jde o komplex velmi různorodých biochemických reakcí, které mohou být nezávisle na sobě stimulovány či inhibovány specifickými metabolity. Ne vždy musí regulace směřovat k zajištění maximálně efektivních energetických přeměn. Přesto již známe některé mechanismy a uzlové body v celém komplexu reakcí, kterými rostlina může zvláště účinně řídit rychlost respirace. Nepochybně nejdůležitější vnitřní regulace směřují k přizpůsobení rychlosti respirace energetickým potřebám rostliny. Nejjednodušší a vcelku samovolně působící regulační mechanismus je ovládán koncentrací adenylátů, především množstvím volného ADP, které pochopitelně vzrůstá při větší spotřebě energie (rychlejším štěpením ATP). Koncentrací adenylátů je jednak řízena rychlost glykolýzy (změnou aktivity enzymů fosfofruktokinázy a pyruvátkinázy), a také rychlost oxidační fosforylace v mitochondriích. Rychlost respirace je dále závislá na množství primárního substrátu v buňkách. Zvýšené množství hexos (a také fosfátových iontů) v cytosolu zrychluje glykolýzu i ostatní respirační procesy. Rychlost hydrolýzy zásobních sacharidů je zcela nezávislá na aktivitě respiračních enzymů - je řízena samostatně, stejně tak jako rychlost transportu nově vytvářených asimilátů. Také oxidační pentózová cesta není zřejmě řízena "poptávkou" po energii, neboť její hlavní význam je spíše ve tvorbě intermediátů. V mitochondriálním úseku respiračních procesů může rostlina řídit jejich rychlost pomocí signálů do transportních proteinů ve vnitřní membráně. Tím ovlivní například rychlost výměny ATP a ADP, která má pro průběh respirace zásadní význam. Kromě vnitřních regulací, které mohou měnit rychlost respirace rostliny i ve zcela neměnném vnějším prostředí, působení vnějších abiotických činitelů má často nadřazenou regulační úlohu. Teplota má zvláště výrazný vliv, neboť na ní závisí rychlost všech enzymatických reakcí. Při zvýšení teploty o 10°C se rychlost respirace obvykle zdojnásobí (faktor Q10 = 2). To platí v teplotním rozmezí přibližně od 0°C do 30°C, pak se již rychlost respirace zpomaluje. Při teplotách okolo 40°C začne velmi rychle klesat. Zpomalení při vyšší teplotě může souviset s nedostatečně rychlou difuzí kyslíku (difuze se také zrychluje s teplotou, ale mnohem méně, Q10 = 1,1). Hlavní příčinou zpomalení a posléze poklesu respirace je však obvykle denaturace některých enzymů. Nepříznivý vliv vyšší teploty se zejména projevuje při jejím delším působení. Charakter teplotní závislosti respirace může být značně odlišný u různých druhů rostliny a bývá ovlivněn i podmínkami, ve kterých rostou. Rozdíly jsou zejména v hodnotách minimální teploty, kdy je vůbec respirace ještě měřitelná (u některých arktických druhů i při -20 °C !), a v hodnotách maxima, ale také rychlost vzestupu respirace za běžných teplot nemusí být zcela stejná. Rozdíly v Q10 mohou být v rozmezí od 1,8 do 2,4. Záření nemá na rychlost respirace přímý vliv, ale ovlivňuje ji nepřímo přes fotosyntézu. V cytosolu fotosyntézy schopných buněk osvětlených listů se fotofosforylací zvyšuje koncentrace ATP a současně se snižuje množství ADP, což může mít inhibiční vliv na rychlost respirace. Současně se však zvyšuje množství volných cukrů, a tak na začátku temné periody je rychlost respirace zvýšena. METABOLICKÉ PROCESY 34 Koncentrace kyslíku je obvykle v mitochondriích dostatečná, neboť jeho transport do buněk je velmi rychlý. V případě nedostatečného zásobení kyslíkem (hypoxie, například u kořenů rostoucích v zaplavených či v udusaných půdách) dochází v buňkách k celé řadě metabolických změn. Především je velmi omezena tvorba ATP v mitochondriích, neboť je zpomalen transport elektronů (pro nedostatek jejich konečného akceptoru). Dále je v cytosolu stimulována fermentace a její produkty (především kyselina mléčná a etanol) jsou ve větší koncentraci toxické. Velmi často bývá za nedostatku kyslíku pozorováno zvýšení rychlosti glykolýzy, které ovšem vede k neefektivnímu vyčerpání zásobních látek. Význam respirace pro další fyziologické procesy v rostlinách Respirační procesy se sice tradičně v učebnicích fyziologie rostlin probírají jako součást uhlíkového metabolismu, ovšem je nutné si stále uvědomovat jejich podvojný charakter slouží jak k transformaci uhlíkatých sloučenin, tak i k přenosu obrovského množství chemicky vázané energie. Respirace probíhá, na rozdíl od fotosyntézy, ve všech živých buňkách rostliny a je proto spojena téměř se všemi ostatními fyziologickými procesy. I přes tuto složitost lze rozdělit návaznosti respirace na jiné procesy do tří hlavních skupin: • podpora růstových procesů (energie a materiál pro tvorby nových struktur), • podpora procesů údržby již vytvořených struktur, zejména obměna proteinů, udržování potenciálového gradientu na membránách, • energetická podpora procesů spojených s příjmem živin a s transportem látek v rostlině. Zabezpečení růstu (růst je zde míněn jako syntéza a hromadění nové biomasy), a to energií i jednoduchými organickými sloučeninami, je prvořadou úlohou respirace v rostlinách. Je proto pochopitelné, že existuje přímá závislost mezi rychlostí růstu a rychlostí respirace. Vyšší rostliny však nerostou rovnoměrně ve všech svých částech a vztah mezi rychlostí růstu a respirace je vázán vždy jen na příslušnou část rostliny. Biochemické procesy spojené s tvorbou stavebních složek nově vytvářené biomasy jsou vcelku dobře známé. Pokud stanovíme chemické složení této nové biomasy, můžeme vypočítat materiálové a energetické náklady na její tvorbu. Velmi užitečný je též koeficient energetické účinnosti syntetických procesů (Y): energie v nově vytvořené sloučenině Y = energie ve spotřebovaných substrátech Množství jednotlivých složek biomasy rostlin, které se vytvoří heterotrofními procesy z jednoho gramu glukózy, a koeficient účinnosti jejich syntézy (Y). Složka Vytvořené množství (g) Y oligo + polysacharidy 0,85 0,93 proteiny 0,67 0,78 lipidy 0,36 0,88 lignin 0,48 0,80 Jestliže známe chemické složení nově vznikající biomasy, můžeme z uvedených dílčích nákladů a účinnosti vypočítat celkovou účinnost. Například v sušině nových listů bývá průměrně 70% sacharidů, 15% proteinů, 5% lipidů, 5% ligninu. Celková účinnost syntetických procesů by pak měla být asi 0,85. To je ovšem hodnota teoretického maxima účinnosti, které prakticky nelze dosáhnout. Biochemické syntézy z řady důvodů neprobíhají jen po energeticky nejvýhodnějších cestách a kromě toho vyžadují některé další nepřímé náklady (např. na transport výchozích substrátů a konečných produktů). Skutečná účinnost se proto pohybuje nejčastěji v rozmezí od 0,50 do 0,75. V každé buňce, a to i u nerostoucích orgánů, probíhají energeticky náročné udržovací procesy, jejichž rychlost musíme vzít také v úvahu. Respirace spojená s údržbou buněčných struktur a funkcí bývá někdy vyčleňována do zvláštní kategorie ("udržovací respirace"). Nejde samozřejmě o jiný typ biochemických procesů, ale pouze o jistou část z celkové respirační aktivity, která souvisí s údržbou. Stanovit velikost této složky respirace je metodicky velmi obtížné, přesto se však intenzívně hledají vhodné postupy (například stanovením respirace u nerostoucích orgánů či měřením respirace těchže rostlin za různé rychlosti růstu s následnou extrapolací zjištěné závislosti pro nulovou rychlost růstu). Zdá se totiž, že právě ve velikosti udržovací složky respirace mohou být značné rozdíly mezi druhy a odrůdami, což může významně určovat jejich potenciální produkční schopnosti. Možnost využít rozdílů v "udržovací respiraci" jako kritéria při šlechtění se proto jeví jako velmi perspektivní. Průměrné denní ztráty biomasy způsobené udržovací složkou respirace bývají nejčastěji okolo dvou procent z celkové hmotnosti rostliny. Ještě obtížnější než stanovení velikosti celkové udržovací respirace je odhad nákladů na údržbu jednotlivých struktur a funkcí v rostlině. K nejvíce energeticky náročným procesům patří obměna proteinů. Průměrná životnost molekul proteinů zapojených do metabolických procesů se odhaduje přibližně na 10 dní. Náklady na jejich obměnu se odhadují zhruba na 10 mg glukózy na gram suché hmotnosti rostliny za den. Obdobné množství substrátu se zřejmě spotřebuje při udržování potenciálových gradientů na membránách (aktivním transportem iontů) a při transportu v lýku. Je pochopitelné, že náklady na obměnu proteinů v jednotce biomasy rostliny jsou tím vyšší, čím větší je jejich obsah a čím kratší je jejich životnost. Velmi obtížně se také stanovuje množství respirací uvolněné energie nutné na příjem nezbytných iontů solí (minerálních živin) kořeny. Tyto potíže vyplývají z rozmanitosti mechanismů příjmu solí - vždyť i tentýž iont může být někdy přijímán pasivně a jindy aktivně. Hojně přijímaný nitrátový iont může být někdy téměř současně s příjmem v kořenech redukován (energeticky velmi náročně !), jindy probíhá redukce až v listech, kde může být využita energie z primárních procesů fotosyntézy. Nejnovější výsledky ukazují, že náklady na příjem a prvotní asimilaci minerálních živin budou vyšší, než se dosud odhadovalo. U rychle rostoucích druhů mohou vyžadovat asi 10 % veškeré energie uvolněné respiračními procesy v celé rostlině, u pomalu rostoucích druhů (zvláště pak za nedostatku živin v půdě) to může být i více než 20 %. Účinnost a metody měření respiračních procesů K rozkladným respiračním procesům mohou být využívány různé druhy substrátů a také ne vždy je rozklad úplný, tedy až na CO2 a H2O. Přesto je však užitečné vědět, jaké maximální množství energie se může při respiraci uvolnit. Při úplné oxidaci jedné molekuly glukózy může vzniknout celkem až 32 molekul ATP (2 v glykolýze a zbývajících 30 pak z mitochondriálních procesů): Maximální účinnost (efektivitu) respirace zjistíme z podílu mezi získanou energií (standardní volná energie 32 molekul ATP je přibližně 1,6 MJ) a volnou energií rozkládaného METABOLICKÉ PROCESY 35 METABOLICKÉ PROCESY 36 substrátu (jedné molekuly glukózy, asi 2,8 MJ), což je tedy zhruba 0,57. Zbývajících 43% chemické energie obsažené v glukóze se z rostliny ztrácí přeměnou na teplo. V reálných podmínkách však tak vysoké účinnosti energetické přeměny glukózy sotva můžeme dosáhnout. Zejména proto, že v rostlinné buňce probíhají obvykle současně i méně energeticky účinné respirační cesty, které výslednou účinnost nutně snižují. Jednak je to malátová varianta glykolýzy, u rostlin mnohem častější než pyruvátová. Dále přistupuje velmi málo účinná alternativní cesta přenosu elektronů v mitochondriích. V cytosolu mohou ještě navíc probíhat v jisté míře další oxidační procesy, o jejichž existenci se můžeme poměrně snadno přesvědčit. Po zablokování cytochromové cesty (kyanidem) i alternativní cesty (kyselinou salicylhydroxamovou, SHAM) je stále ještě jistá respirační aktivita měřitelná. Původně byla souhrnně označována jako reziduální respirace, o jejíž biochemické podstatě a lokalizaci se dosud mnoho nevědělo. Bylo však známo, že probíhá pouze mimo mitochondrie a není spojena s tvorbou ATP. Nyní již víme, že se jedná převážně o takzvané peroxidázové dýchání. Nejde však o nějakou samostatnou respirační cestu, ale pouze o oxidaci NADH (1 O2 / 2 NADH) katalyzovanou peroxidázami. Může mít však značný podíl (až 20 %) na celkových oxidačních procesech v buňkách. Energetickou účinnost respiračních procesů v živé rostlině můžeme v současné době studovat pomocí moderních fyzikálních metod. Převratnou událostí bylo zejména zavedení spektroskopie nukleární magnetické rezonance (NMR), která ve spojení s aplikací značeného fosforu (31 P) umožňuje měřit rychlost tvorby či rozkladu ATP in vivo. Pokud současně měříme spotřebu kyslíku, můžeme vypočítat, kolik molekul ATP vzniklo na jednu přijatou molekulu kyslíku. Při nejefektivnější cytochromové cestě ve spojení s glykolýzou je tento poměr 6 ATP/ O2 (častěji se vyjadřuje jako ATP/O = 3). U alternativní cesty je ATP/O = 1, a u peroxidázového dýchání ATP/O = 0. Rychlost respirace však měříme daleko nejčastěji klasickými metodami, a sice buď stanovením spotřeby kyslíku, nebo výdeje CO2. Již vzácněji se používá měření výdeje tepla pomocí speciálních kalorimetrů. Výdej CO2 stanovujeme gazometrickými metodami, a to buď průtokovými (ze změny koncentrace CO2 ve vzduchu po průchodu okolo uzavřené rostliny či orgánu - tedy stejně jako při měření fotosyntézy), nebo metodami neprůtokovými. Při nich vyloučený CO2 jímáme do vhodného roztoku hydroxidu a poté jej kvantitativně stanovíme titračně. Existuje ovšem řada dokonalejších metod, při kterých měříme změnu objemu či tlaku vzduchu způsobenou respiračním příjmem O2 a absorbcí vyloučeného CO2 v uzavřeném systému (volumetrické a manometrické metody, např. klasický Warburgův přístroj). Velmi rozšířené je stanovení rychlosti respirace ze spotřeby kyslíku polarografickou metodou (Clarkovo čidlo), a to obvykle při ponoření měřeného orgánu do vhodného roztoku. Práce v roztocích umožňuje snadnou aplikaci specifických inhibitorů jednotlivých respiračních cest, stanovení podílu těchto cest na celkové rychlosti respirace, a tedy i odhad celkové energetické účinnosti oxidačních procesů. Uvedené metody můžeme s výhodou kombinovat. Zejména je užitečné měřit současně výdej CO2 a spotřebu kyslíku a z toho pak vypočítat respirační kvocient (RQ): vyloučený CO2 (mol kg-1 ) RQ = přijatý O2 (mol kg-1 ) Pokud prodýchávaný substrát pochází ze sacharidů (což je nejčastější případ), pak RQ = 1. Při oxidaci vysoce redukovaných sloučenin je hodnota RQ nižší (pro většinu lipidů je RQ přibližně 0,7, u proteinů 0,8). Naopak, pro více oxidované sloučeniny může být i vyšší než jedna (např. pro kyselinu citronovou jako substrát je RQ = 1,33). METABOLICKÉ PROCESY 37 Asimilace dusíku Dusík je vůbec nejhojnější minerální živinou, kterou rostlina přijímá a svým obsahem v rostlinné biomase je na čtvrtém místě - hned za uhlíkem, kyslíkem a vodíkem. Síra je zastoupena sice méně (asi jeden gram v kilogramu sušiny), ale stejně jako dusík je nepostradatelnou součástí bílkovin a řady dalších stavebních součástí rostlin. Oba prvky jsou přijímány z půdního roztoku nejčastěji ve značně oxidované formě (NO3 a SO4 2) a před inkorporací do organických molekul spotřebuje rostlina hodně energie na jejich redukci. Člověk ani ostatní živočichové nejsou schopni redukce nitrátů a síranů a proto jsou zcela odkázáni i z tohoto hlediska na činnost rostlin. Fixace molekulového (plynného) dusíku Ačkoliv vzduch v atmosféře je tvořen převážně dusíkem a plynný dusík je ve vysoké koncentraci přítomen i uvnitř rostlin, přesto je to prvek, jehož nedostatek nejčastěji limituje rychlost metabolických procesů. Molekulový dusík totiž vyšší rostliny nedovedou přímo využívat k asimilaci (fixaci) do organických sloučenin. Tuto schopnost však mají některé prokaryotní organismy a především jejich činnosti vděčíme za zásoby využitelných dusíkatých sloučenin, které se vyskytují v ekosféře. Fixaci dusíku mohou provádět jednak některé mikroorganismy žijící volně v půdě (např. rodu Azotobacter a Clostridium), nebo v rhizosféře některých trav (zvláště bakterie rodu Azospirillum a Azotobacter). Nejvýznamnější jsou však bakterie, které fixují dusík při pevném symbiotickém spojení s kořeny některých druhů vyšších rostlin. Jde především o bakterie dříve zahrnované do rodu Rhizobium (je nyní rozčleněn do řady samostatných rodů). Symbiotické fixace dusíku jsou schopny i některé aktinomycety (Frankia spp.) a sinice (Anabaena, Nostoc). K hostitelským rostlinám patří většina druhů čeledi Fabaceae, dále pak některé stromy a keře z celkem asi 23 rodů (např. Alnus, Myrica a Hippophae). Podívejme se trochu blíže na průběh nejčastější a také nejdůležitější symbiotické fixace dusíku bakteriemi z okruhu bývalého rodu Rhizobium. Těchto bakterií známe celou řadu druhů a často se vyznačují specifickou afinitou jen k určitým druhům hostitelských rostlin. Vyskytují se běžně v půdě jako saprofytní organismy bez fixační aktivity. Při kontaktu s kořenem vhodné hostitelské rostliny pronikají po enzymatickém narušení buněčné stěny do buněk epidermis (obvykle do kořenového vlásku), a pak dále až do vnitřních vrstev kůry. Tam stimulují expresi řady specifických genů v buňkách korového parenchymu kořene (viz rámeček na následující straně), což vede k množení buněk infikované části kořene. Výsledkem obnovené dělivé aktivity je vznik kořenových hlízek o velikosti asi 2 až 4 mm. Bakterie se usazují v cytoplazmě vnitřních (obvykle tetraploidních) buněk hlízek. Usazené (nedělivé) a poněkud zvětšené bakterie nazýváme bakteroidy. Jednotlivé bakteroidy, někdy ale i skupiny několika bakteroidů jsou obaleny peribakteroidní membránou, která vzniká invaginací plazmatické membrány hostitelské buňky a vytváří útvar označovaný jako symbiosom. V cytosolu buněk s bakteroidy se vytváří zvláštní protein (leghemoglobin) červené barvy, který reguluje hospodaření s kyslíkem. Ten je sice potřeba dodávat ve velkém množství k respiračním centrům v obvodové membráně fixujících bakteroidů, ovšem velmi selektivně, neboť ve vnitřním prostoru, kde probíhá vlastní fixace dusíku, musí být udržována koncentrace kyslíku na velmi nízké úrovni. Klíčový enzym fixace, nitrogenáza, je totiž vyšší koncentrací kyslíku nevratně ničen. Na druhé straně terminální oxidáza v bakteriálním dýchacím řetězci má ke kyslíku mimořádně vysokou afinitu. Je nutné zdůraznit, že celý proces vzniku symbiotického vztahu (migrace bakterií v půdě ke vhodným kořenům, tvorba hlízek a usazení bakterií v buňkách), probíhá za složité interakce hostitelské rostliny s bakteriemi, podložené specifickými komplexy desítek genů u obou partnerských organismů. Pronikání bakterií rodu Rhizobium do kořenů hostitelské rostliny, struktura jedné ze sloučenin vylučovaných z kořenů vojtěšky (vábících baktérie), a schéma vlastní redukce dusíku. METABOLICKÉ PROCESY 38 METABOLICKÉ PROCESY 39 Redukce molekulového dusíku probíhá v bakteroidech, které jsou hostitelskou rostlinou zásobovány sacharidy. Redukce dusíku na amoniak je energeticky mnohem náročnější než např. redukce CO2 Na každou molekulu N2 je zapotřebí dodat minimálně 8 elektronů (z toho 6 na tvorbu NH3 a 2 na současně probíhající tvorbu H2), a dále energii z 16 molekul ATP. Souhrnně lze celou reakci vyjádřit: N2 + 8 e+ 8 H+ + 16 ATP → 2 NH3+ H2 + 16 ADP + 16 Pi Celý proces je katalyzován nitrogenázou, což je enzymový komplex složený ze dvou částí označovaných jako Fe-protein a Mo-Fe-protein. Ty se ještě dělí na několik podjednotek s redoxními skupinami typu Fe-S. Nitrogenáza je přiváděna do aktivního, redukovaného stavu pomocí elektronů přenášených k ní z jiných metabolických procesů. Posledním donorem elektronů bývá obvykle feredoxin nebo flavodoxin. Při přenosu elektronů v nitrogenáze je nutný i hořčík navázaný na ATP. Amonné ionty transportované z bakteroidů jsou přímo v cytoplasmě hostitelských buněk zabudovány do organických sloučenin (nejčastěji glutamin, glutamát a asparagin) a ty jsou pak vedeny xylémem do nadzemních částí rostliny. V listech jsou převážně použity k syntéze dalších aminokyselin. Část z těchto produktů je transportována zpět do kořenů. Mezi fixační aktivitou jednotlivých druhů a kmenů symbiotických bakterií mohou být značné rozdíly. Proto se věnuje v současné době mimořádně velká pozornost nalezení těch nejefektivnějších mikroorganismů (selekcí, genovými manipulacemi). Nemenší úsilí se také věnuje nalezení nejvhodnějších hostitelských rostlin. Existují totiž velké genotypové rozdíly v počtu vytvářených hlízek na jednotku kořenů a rostlina také do značné míry může řídit rychlost fixace N2 v hlízkách. Tato rychlost se podstatně mění v průběhu ontogeneze nejvyšší je vždy v období tvorby semen. Množství symbioticky fixovaného dusíku se snižuje při vyšším obsahu anorganických forem dusíku v půdě. Je to vcelku pochopitelné, neboť příjem nitrátových či amonných iontů z půdy je pro rostliny méně energeticky náročný, než fixace N2. Naopak, zvýšený obsah fosforu v půdě působí na rozvoj symbiotické fixace stimulačně. Roční úhrnné množství fixovaného dusíku za optimálních podmínek může dosahovat až 400 kg čistého N na hektar, což se zcela vyrovná dávkám dusíku dodávaných do půdy formou umělých hnojiv při intenzivní agrotechnice těch plodin, které symbioticku fixaci nemají. Jinými slovy, symbiotická fixace je schopna plně saturovat dusíkem hostitelské rostliny, což je v přírodních ekosystémech výhodné při kolonizaci území s extrémně malým obsahem dusíku v půdě. Měření rychlosti fixace dusíku se obvykle provádí ze stanovení aktivity nitrogenázy, kdy využíváme její schopnosti redukovat i jiné sloučeniny, než je dusík (stanovení malých změn koncentrace dusíku ve vzduchu je totiž velmi obtížné). Nejčastěji používáme acetylen, přidávaný ke vzorkům kořenů či půdy v uzavřené nádobce. Vznikající etylen lze vysoce citlivě měřit pomocí plynové chromatografie. Asimilace nitrátů a amonných iontů Schopnost symbiotické fixace dusíku je vyhrazena poměrně malé skupině rostlin všechny ostatní jsou odkázány na příjem dusíkatých sloučenin z půdy. Nejčastěji se jedná o nitráty, nitrity a amonné ionty, které v půdě vznikají z půdní organické hmoty činností mikroorganismů (= mineralizace dusíku). Při rozkladu organických látek vznikají nejprve amonné ionty (amonifikace). Ty se dále mohou oxidovat na nitrity (bakteriemi rodu Nitrosomonas) a dále na nitráty (Nitrobacter) v procesech souhrnně označovaných jako nitrifikace. Při nedostatku kyslíku v půdě může docházet k mikrobiálnímu rozkladu dusičnanů na molekulový dusík či na plynné oxidy dusíku (denitrifikace) a tím i ke ztrátám dusíku z půdy. Je to tedy především dynamika půdní mikroflory, která rozhoduje o množství a typu sloučenin dusíku v půdě. Činnost mikrobů je ovšem řízena podmínkami prostředí. Tak například za nízké teploty a nízkého pH půdy je značně zpomalena nitrifikace (tvorba nitrátů) a hromadí se pouze amonné ionty, neboť amonifikační mikroflora je mnohem odolnější k nepříznivým vlivům. Většinou však mají rostliny k dispozici současně různé přijatelné formy anorganických sloučenin dusíku. Nitrátové ionty přijaté z půdy nemůže rostlina zabudovat do organických látek svého těla přímo, ale až po redukci na ionty amonné. K této redukci může docházet u některých druhů přímo v kořenech, u jiných až v listech. Místo redukce lze zjistit jednak analýzou xylemové šťávy, jednak stanovením aktivity enzymu nitrátreduktázy v příslušných orgánech. Avšak také u druhů, které obvykle redukují veškeré nitráty v kořenech, může někdy docházet k jejich transportu do listů, a to v těch případech, kdy aktivita nitrátreduktázy v kořenech je buď snížena (např. nízkou teplotou), nebo je nedostatečná vzhledem ke zvýšenému příjmu nitrátů. Redukci nitrátů lze popsat souhrnnou rovnicí: NO3 + 8 e+ 10 H+ → NH4 + + 3 H2O Již z prvního pohledu na tuto rovnici je zřejmé, že jde o velmi náročnou redukci (oxidační číslo dusíku se mění z +5 na -3 !). Také je užitečné si všimnout, že se spotřebovává více vodíkových iontů než elektronů. Úbytek vodíkových iontů v cytosolu vede k jeho alkalizaci. Pro zachování optimálního pH v buňkách jsou tedy nezbytné jisté kompenzační mechanismy. U kořenů obvykle dochází ke sníženému výdeji H+ do půdního roztoku a naopak ke zvýšenému vylučování OHa aniontů organických kyselin (pH půdy v okolí kořenů se tedy zvyšuje!). Redukce nitrátů v listech je provázena také zvýšenou tvorbou organických kyselin (zvláště kyseliny jablečné ze sacharidů přes fosfoenolpyruvát a kyselinu oxaloctovou). K těmto reakcím dochází vcelku samovolně, neboť aktivitu PEP-karboxylázy je stimuluje zvýšené pH. Celý reakční systém bývá označován jako biochemický pH-stat. Při bližším pohledu na redukci nitrátů v rostlinách zjistíme, že jde vlastně o dvě navazující reakce. Tou první je redukce nitrátu na nitrit: NO3 + NADH + H+ → NO2 + NAD+ + H2O Tato reakce probíhá za účasti enzymu nitrátreduktázy v cytosolu buněk (ne v organelách). Nitrátreduktáza je klíčovým enzymem při asimilaci nitrátů v rostlinách, neboť nejvíce rozhoduje o její celkové rychlosti. V každé buňce se vyskytuje v několika formách (s odlišně kódovanými proteiny), ovšem s velmi podobnou základní strukturou i funkcí. Jedná se o komplex složený ze dvou totožných podjednotek (homodimer). Každá z nich obsahuje tři prostetické skupiny: FAD, hem a molybdenový komplex. Množství nitrátreduktázy v rostlinách silně kolísá v závislosti na genotypu i na celé řadě faktorů prostředí. Především existují velké rozdíly v potenciálních (maximálně METABOLICKÉ PROCESY 40 METABOLICKÉ PROCESY 41 dosažitelných) hodnotách aktivity nitrátreduktázy. Některé ruderální druhy (např. kopřiva, Urtica dioica) mohou dosahovat hodnot až stonásobně vyšších než některé vřesovišní rostliny (např. borůvka, Vaccinium myrtillus), které jsou adaptovány k růstu na substrátech velmi chudých na nitrátovou formu minerálního dusíku. Tyto druhy pak nejsou schopny výrazněji zrychlit a využívat nitráty ani při jejich dodání do substrátu ve větším množství. Ale i u téže rostliny či listu se aktuální hodnoty aktivity nitrátreduktázy mohou rychle měnit i v průběhu dne. Vzhledem k velmi krátké životnosti tohoto enzymu (poločas rozpadu je jen několik hodin), v buňkách současně probíhá jak syntéza, tak i rozklad (proteolytickými enzymy). Rychlost syntézy a tudíž i dosažitelná aktivita nitrátreduktázy je v přímé závislosti na množství nitrátů v buňce. Jedná se tedy o typický případ indukce enzymatické aktivity substrátem, která je jinak u vyšších rostlin velmi vzácná (na rozdíl od bakterií, kde je běžná). Aktivita tohoto enzymu je také stimulována světlem - jednak díky vyšší produkci reduktantů (může být využíván jak NADH, tak i NADPH, v závislosti na dané formě enzymu)), ale pravděpodobně i jinými, na světle závislými mechanismy (na základě informacích zprostředkovaných fytochromovým systémem, jak bude blíže vysvětleno ve třetí části učebních textů). Stimulace světlem je ale podmíněna přítomností nitrátů v buňce - pouze tedy umocňuje účinek substrátové indukce. Nicméně v nočních hodinách je asimilace nitrátů v nadzemních částech rostlin vždy velmi zpomalena a tudíž tam dochází k jejich hromadění. Navazující redukce nitritu na amonný ion probíhá u listů v chloroplastech, u jiných orgánů pak v proplastidech. Nejlépe je průběh tohoto procesu prozkoumán v plastidech listů. Zde se totiž využívá primárních reakcí fotosyntézy a všech šest potřebných elektronů je přenášeno z feredoxinu pomocí enzymu nitritreduktázy: NO2 + 6 e+ 8 H+ → NH4 + + 2 H2O Při redukci nitritů v kořenech a v jiných nezelených orgánech je donorem elektronů NADH či NADPH, produkované respiračními procesy. Některé nové práce naznačují, že i v tomto případě se podílí na přenosu elektronů na nitritreduktázu protein velmi podobný feredoxinu. Amonné ionty, ať už vytvořené popsanou redukcí nitrátů či přímo přijaté kořeny z půdy, působí nepříznivě na buněčný metabolismus (zejména inhibují membránové procesy včetně tvorby ATP) a proto jejich rychlá vazba do dalších sloučenin (u příjmu z půdy přímo v kořenech) je životně důležitá. V buňkách listů se navíc uvolňuje velké množství amonných iontů v průběhu glykolátového (fotorespiračního) cyklu, které je také nutno opět vázat do organických dusíkatých látek. První reakcí asimilace amonných iontů je obvykle tvorba glutaminu (amidovou vazbou na glutamát) za účasti enzymu glutaminsyntetázy (označované zkratkou GS). Tato reakce probíhá v cytosolu za spotřeby jedné molekuly ATP. Za dostatku amonných iontů v buňkách glutamin reaguje s 2-oxoglutarátem (který je produkován v mitochondriálním citrátovém cyklu) za vzniku glutamátu (viz schéma v rámečku). Tato reakce katalyzovaná glutamátsyntázou (GOGAT) probíhá v plastidech a vyžaduje dodání redukčního činidla, kterým v chloroplastech listových buněk bývá redukovaný feredoxin (produkovaný v primárních procesech fotosyntézy), v buňkách kořenů pak NADH. Část takto produkovaného glutamátu je využita opět jako akceptor amonných iontů pro další cyklus jejich asimilace. Další část je ovšem využívána pro tvorbu jiných dusíkatých látek, v prvé řadě různých aminokyselin (aminoskupina glutamátu může být snadno přenášena transaminací na různé organické kyseliny) a z nich pak se syntetizují hlavně bílkoviny. Bohaté na dusík jsou nukleové kyseliny i mnoha sekundárních metabolitů a zásobních látek. Velmi významnou dusíkatou látkou je také glutathion, jehož stálá zásoba v chloroplastech slouží jednak jako antioxidant, ale i jako substrát pro syntézu řady jiných dusíkatých sloučenin. Cesty syntéz těchto dusíkatých sloučenin v rostlinách jsou již problematikou čistě biochemickou. Velmi zjednodušené schéma tří různých cest asimilace amonných iontů v rostlinných buňkách. Z fyziologického hlediska je velmi zajímavé sledovat změny v obsahu dusíkatých látek v různých orgánech během růstu. Mladé klíčící rostliny získávají veškerý dusík ze zásobních bílkovin uložených v semeni (proteinová tělíska). Velmi rychle po začátku klíčení jsou zásobní proteiny hydrolyzovány na aminokyseliny a amidy, ze kterých jsou opět syntetizovány nové druhy proteinů a dalších látek. Celý další růst a vývoj rostliny je provázen maximální úsporností v hospodaření s organicky vázaným dusíkem. Zvláště dramatické změny nastávají při stárnutí orgánů a při tvorbě semen či plodů. Funkce rostliny za těchto situací směřují k translokaci dusíku do místa největší potřeby z ostatních svých částí. Protože nejvíce dusíku je vázáno v bílkovinách, dochází v prvé řadě k jejich rozkladu. Ze stárnoucího listu, dříve než uschne, může být translokováno do mladých či zásobních orgánů až 85 % veškerého dusíku. Při tvorbě semen a plodů u rostlin nedostatečně zásobených dusíkem je měřitelný pokles fotosyntézy listů. Tento na první pohled paradoxní jev se dá vysvětlit právě přednostním zásobením reprodukčních orgánů dusíkatými látkami odebranými z listů (tedy i z části karboxylačních enzymů po jejich rozkladu), a to i za cenu snížené tvorby sacharidů. Asimilace síranů a fosforečnanů Síra je nejčastěji přijímána z půdy v podobě síranů a jejich asimilace v rostlině má některé podobnosti s asimilací nitrátů. Je to také energeticky velmi náročný proces, který souhrnně můžeme vyjádřit takto: SO4 2+ ATP + 8 e+ 8 H+ → S2+ 4H2O + AMP + Pi K redukci síranů obvykle dochází v chloroplastech listů, v omezené míře může probíhat i v kořenech (v proplastidech). Síranový iont se nejprve váže na ATP za vzniku adenosin-5fosfosulfátu (APS) a jedné molekuly pyrofosfátu. Ta se však záhy rozpadá na dva fosfátové ionty. Teprve pak dochází k vlastní redukci přenosem elektronů - u listů je donorem feredoxin. Je zapotřebí celkem osmi elektronů, neboť oxidační číslo síry se mění z +6 na -2. Produktem redukce je sirníkový iont, který je ale hned vestavěn do aminokyseliny cysteinu. Rostliny jsou schopny využívat i anorganické zdroje síry ve formě plynných sloučenin (především oxidu siřičitého, pokud nedosahuje toxicky zvýšené koncentrace). Molekuly SO2 po vstupu průduchy do listu reagují s vodou za vzniku siřičitanových iontů, které jsou v chloroplastech redukovány obdobným způsobem, jak bylo uvedeno u síranů. METABOLICKÉ PROCESY 42 Naprostá většina asimilované síry je použita ke tvorbě aminokyselin cysteinu a methioninu, které jsou pravidelnou součástí bílkovin i některých oligopeptidů. Síra je součástí řady redoxních sloučenin i mnoha sekundárních metabolitů, zejména silic. METABOLICKÉ PROCESY 43 Asimilace fosforu rostlinami je poměrně jednoduchá, protože fosfor - na rozdíl od dusíku a síry - zůstává téměř stále v plně oxidovaném stavu. Z půdy je přijímán jako dihydrogenfosfátový iont (H2PO4 ), pouze ve výjimečných případech (za vysokého pH) jako HPO4 2. Koncentrace těchto iontů v půdním roztoku jsou vždy extrémně nízké (0,5 až 2 µM) a proto příjem obvykle vyžaduje metabolickou energii. Po vstupu do cytoplasmy kořenových buněk jsou fosfátové ionty rychle esterifikovány do ATP. Část z nich je pak ještě v kořenech využita na syntézu fosfolipidů, DNA a RNA, část se ukládá jako zásoba do vakuol. V cytosolu se stabilně udržuje jen velmi nízká koncentrace. Z kořenů může být fosfor transportován do nadzemních orgánů jak ve formě volných fosfátových iontů, tak i vázaný v ATP. U většiny rostlin jsou však na delší vzdálenosti transportovány přednostně anorganické formy fosforu, zatímco uvnitř buněk (např. mezi organelami) převládá výměna ATP a ADP. Při stárnutí listů je asi 60 % z jejich celkového obsahu fosforu translokováno lýkem do jiných orgánů. Vzhledem k nízké koncentraci fosforu v cytoplasmě je doba jeho obratu v metabolických procesech velmi krátká (jen asi 5 minut). Daleko nejvíce fosfátových iontů cykluje při fotosyntéze a při všech dalších syntézách složitějších sacharidů, zbytek pak při syntéze a obměnách fosfolipidů, RNA a DNA. METABOLICKÉ PROCESY 44 Kontrolní otázky ke 2. části učebního textu Fyziologie rostlin 1. Jaké jsou hlavní typy proteinových komplexů v thylakoidních membránách chloroplastů a které z nich se nacházejí jen v jejich části volně komunikující se stromatem? 2. Z jakých hlavních částí je složen fotosystém II v thylakoidech? 3. Jaké jsou hlavní funkční rozdíly mezi chlorofyly a karotenoidy? 4. Jakým mechanismem je zajištěna jednosměrnost přenosu excitační energie z antén do reakčního centra fotosystémů? 5. Jaké dílčí fotochemické reakce vedou k hromadění vodíkových iontů v lumen thylakoidu? 6. Jakým způsobem může cytochromový komplex přispívat k vyšší energetické účinnosti primárních (fotochemických) procesů fotosyntézy? 7. Jaké odlišné typy redukčních procesů mohou probíhat v chloroplastech s využitím redukované formy feredoxinu? 8. Popiš průběh cyklického transportu elektronů v thylakoidních membránách. K tvorbě jakých primárních metabolitů vede? 9. Co rozumíme pod pojmem "nefotochemické zhášení fluorescence chlorofylu" a čím je způsobeno? 10. Jaké jsou tři hlavní fáze fotosyntetického cyklu redukce uhlíku (Calvinův cyklus)? 12. Jaké faktory podmiňují aktivaci katalytické funkce enzymu Rubisco? 13. Popiš návaznost reakcí v glykolátovém cyklu (fotorespiraci). 14. Popiš návaznost reakcí ve fixační cestě C4. Jaké výhody tato cesta rostlinám přináší? 15. Popiš návaznost reakcí ve fixační cestě CAM. 16. Jaké biochemické zvláštnosti rostlin s fixační cestou CAM podmiňují jejich schopnost otvírat průduchy v nočních hodinách? 18. V jakých jednotkách nejčastěji vyjadřujeme množství fotosynteticky aktivního záření dopadajícího na rostliny? 19. Která část "světelné křivky" rychlosti fixace CO2 je nejvíce ovlivněna účinností fotochemických procesů? 20. Jaké energeticky bohaté substráty jsou transportovány do mitochondrií rostlinných buněk a v nich pak využívány pro tvorbu ATP? 21. Jaké hlavní multiproteinové komplexy se nacházejí ve vnitřní membráně mitochondrií rostlinných buněk a jakou mají funkci? 22. Jaký význam může mít transport elektronů v mitochondriích alternativní (kyanidresistentní) cestou pro rostlinné buňky? 23. Jaké maximální množství molekul ATP může vzniknout (fosforylací z ADP) v rostlinné buňce při úplném rozkladu jedné molekuly glukózy na CO2 a vodu? 24. K jakým hlavním skupinám fyziologických procesů v rostlinách jsou využívány energeticky bohaté sloučeniny (hlavně ATP) produkované v mitochondriích? 25. Jaké hlavní vnitřní a vnější faktory mohou zvyšovat celkovou rychlost respiračních procesů? METABOLICKÉ PROCESY 45 26. Jaké typy chemických sloučenin se uplatňují při navazování symbiotických vztahů mezi hostitelskou rostlinou a vhodným typem hlízkových baktérií fixujících plynný dusík? 26. Jaké specifické proteiny jsou nutné pro zabezpečení redukce N2 v bakteroidech uvnitř hlízek? 27. Jaké pedochemické faktory (zejména koncentrace některých minerálních živin) mohou snižovat či zvyšovat symbiotickou fixaci dusíku? 28. Jaké hlavní skupiny půdních mikrobiálních procesů ovlivňují přeměny dusíkatých látek v půdě? 29. Ve kterých částech buňky (ne celé rostliny!) dochází k redukci nitrátů na amonné ionty? 30. Jaké faktory přispívají k aktivaci enzymu nitrátreduktázy? 31. Na jakou chemickou látku se nejčastěji navazují amonné ionty při svém prvotním vstupu do organických vazeb? 32. Ve kterých částech buňky dochází k redukci síranů a k zabudování síry do organických vazeb a jaký je první stálý produkt toho procesu? Učební text k přednášce Bi4060 na přírodovědecké fakultě MU v Brně. Určeno pouze ke studijním účelům. Autor textu Jan Gloser. 3. ČÁST - RŮST A VÝVOJ Obecné problémy růstu a vývoje I velmi dokonalé znalosti fyzikálních a biochemických principů fyziologických procesů (transportních procesů, metabolismu) nejsou ještě dostatečné k tomu, abychom vysvětlili vznik dospělé rostliny z oplozeného vajíčka. Je sice pravda, že tvorba nových buněk je závislá na dostatku stavebního materiálu z biochemických procesů, ale pro život rostliny zdaleka nepostačuje jen hromadění nových buněk - je nutná i jejich tvarová a funkční specializace, a kromě výměn hmoty a energie i výměna informací. Jen tak mohou vznikat odlišná pletiva i celé orgány, které rostlina potřebuje ke svému životu. Ty základní informace jak budovat tělo rostliny jsou zapsány v genomu každé buňky, ovšem jejich realizace může být velmi modifikovaná celou řadou vnitřních i vnějších faktorů.. Růst rostlin je velmi široce používaný termín, obvykle označující postupné zvětšování hmotnosti, délky, objemu či počtu buněk, orgánů i celých rostlin. Kvalitativní změny, které provázejí růst zejména při specializaci buněk a pletiv na rozdílné funkce, nazýváme diferenciace. Společným působením obou těchto procesů dochází k postupným tvarovým změnám (morfogenezi), které provázejí rostlinu po celý její život, tedy v průběhu jejího ontogenetického vývoje. Zastřešujícím termínem vývoj pak označujeme celou posloupnost převážně kvalitativních změn, které ovšem jsou těsně spojeny se změnami kvantitativními. Průběh růstových procesů u většiny rostlin není pevně určen, jak tomu bývá u živočichů. Přesto lze pozorovat jisté obecné znaky růstu rostlin. K nim patří např. zřetelná orientace nově tvořených struktur podle jisté osy (axiální charakter růstu) a opakování některých strukturních jednotek (modulární charakter růstu). Zvláště významnou úlohu hraje u rostlin polarita buněk i celých orgánů, projevující se nestejnými vlastnostmi protilehlých, zdánlivě stejných struktur Na buněčné úrovni se jedná zejména o rozdílné funkční vlastnosti protilehlých částí plasmatické membrány, a cytoskeletu. Růstové procesy můžeme studovat na různé úrovni- od buněčné až po úroveň populační. V následujících kapitolkách této části učebního textu se zaměříme hlavně na procesy spojené s regulací růstu a vývoje rostlin v průběhu ontogeneze, počínaje oplozením a tvorbou embrya, přes vegetativní fázi až k přechodu do fertilního stádia a stárnutí. Seznámíme se s mechanismem působení hlavních vnitřních (hormonálních) regulátorů růstu a vývoje, i s modifikujícím vlivem faktorů vnějšího prostředí. Růstové procesy na buněčné úrovni Růst závisí v prvé řadě na zmnožení počtu buněk a na zvětšení jejich rozměrů do konečného stavu. Na rozdíl od živočichů probíhají tyto procesy jen v úzce vymezených zónách zvaných meristémy. Již v embryonálním stavu se vyčleňují dva typy primárních meristémů, jeden pro růst kořenů a druhý pro růst nadzemních částí (výhonku, prýtu). Tyto meristémy se udržují aktivní v apikálních částech kořene a výhonku prakticky po celý život rostliny. Kromě toho se u většiny rostlin dodatečně zakládají sekundární meristémy mimo apikální zóny (interkalárně, např. kambium). Meristematické buňky jsou poměrně malé, s velkým jádrem, s tenkou buněčnou stěnou a bez velké centrální vakuoly. RŮST A VÝVOJ 1 RŮST A VÝVOJ 2 Dělení buněk (cytokineze) je prvním růstovým projevem. V dělících se buňkách dochází k několika nápadným a pravidelně se opakujícím změnám, které označujeme jako fáze buněčného cyklu: a) interfáze, u které lze rozlišit tři časové etapy G1 - presyntetická (narůstá jádro i cytoplazma), S - syntetická (dochází k replikaci DNA), G2 - postsyntetická (příprava na mitózu). b) mitóza, která se tradičně člení se na čtyři úseky: profáze, metafáze, anafáze, telofáze. Na rozdělení jádra rychle navazuje tvorba střední lamely, a k ní přiléhající buněčné stěny. Materiál pro stavbu těchto součástí je transportován především ve váčcích z Golgiho komplexu. Orientace střední lamely určuje, zda k rozdělení buněk dojde ve směru kolmém k povrchu orgánu (antiklinálně) či ve směru rovnoběžném s nejbližším vnějším povrchem (periklinálně), což má pro výsledný tvar rostoucího orgánu zásadní význam. Neméně významné je i řízení růstu primární stěny (směr ukládání mikrofibril celulózy). Na něm závisí větší či menší roztažitelnost jednotlivých úseků buněčné stěny, a tedy i směr, ve kterém se buňka nejvíc prodlužuje. V obou případech jsou hlavními řídícími prvky uvedených syntéz mikrotubuly. Jakým systémem přenosu informací jsou však řízeny vlastní mikrotubuly, není dosud uspokojivě vysvětleno. Po ukončeném dělení jedna ze dvou dceřinných buněk vstupuje do dalšího cyklu (celý cyklus trvá obvykle 8 - 24 hodin), zatímco druhá obvykle přechází do prodlužovací fáze a více už se nedělí. Někdy však dochází i u těchto buněk k další syntéze a k replikaci DNA, která však není provázena dělením. Tak vznikne místo běžné diploidní buňky buňka tetraploidní. Obvykle mívá i větší rozměry. Prodlužovací fáze buněčného růstu následuje hned po dělení v blízkosti meristému. U nově vytvořených buněk dochází nejen k podstatnému zvětšení jejich objemu, ale také ke změnám vnitřní stavby (zmnožení organel, vznik centrální vakuoly). Zvětšování objemu buňky je složitý biofyzikální proces, který je v poslední době intenzívně zkoumán. Ukazuje se totiž, že právě tato růstová fáze je mimořádně citlivá na různé vnější i vnitřní regulace. Dřívější teorie prodlužovacího růstu buněk vycházely z primární úlohy tvorby a včleňování nového stavebního materiálu do buněčné stěny. Příjem vody byl chápán jen jako průvodní jev - zaplňování nových prostor. Podle našich současných znalostí právě příjem vody a vzniklý turgorový tlak má naprosto nezastupitelnou aktivní úlohu při růstu buněk - bez násilného rozpínání buněčné stěny není její zvětšování možné. Fyzikální mechanismy prodlužovacího růstu buněk mají dva řídící komplexy: ● řízení velikosti turgorového tlaku, ● řízení roztažnosti buněčné stěny. Velikost turgorového tlaku závisí v prvé řadě na osmotickém tlaku buňky, a tudíž i na funkci transportních proteinů v plazmatické membráně, které řídí vstup osmoticky aktivních látek do buňky. Je dobré si uvědomit, že při poklesu turgorového tlaku (v důsledku růstu buněčné stěny) dojde i k poklesu vodního potenciálu v buňce. To má za následek zrychlený příjem vody do buňky, spojený se zvýšením turgoru. K udržování turgoru na původní výši je však nutné udržovat i původní hodnotu osmotického tlaku dalším příjmem osmoticky aktivních látek (hlavně iontů solí). Experimentálně bylo dokázáno, že k dlouživému růstu buňky dochází až po dosažení jisté prahové hodnoty turgorového tlaku (po). Při dalším zvyšování turgoru (p) se úměrně zvyšuje i rychlost růstu (r): r = x (p –po) kde koeficient x vyjadřuje roztažnost (extenzibilitu) buněčné stěny. Relativní rychlost růstu (r) je zde chápána jako rychlost zvětšování objemu buňky. Roztažnost buněčné stěny závisí nejen na orientaci a zřasení mikrofibril celulózy a na četnosti vodíkových můstků mezi nimi, ale i na zastoupení dalších výplňových složek (pektiny, xyloglukany, extensin atd.). Je také známo, že hodnotu roztažitelnosti může rostlina v jistých mezích rychle měnit účinkem specifických látek - fytohormonů (především působením auxinů a giberelinů, jak bude blíže uvedeno v dalších kapitolách. Dosud nejsou známy všechny mechanismy řídící dlouživý růst buněk. Ovšem již z toho co víme, lze odvodit, že tento růst se nutně musí zpomalit až zastavit: ● při poklesu turgoru pod prahovou úroveň, což může být způsobeno jak nedostatečným zásobením rostliny vodou (špatnou dostupností vody v půdě či velkým výparem), tak i malým obsahem osmoticky aktivních látek v buňkách (neboť ty vznik turgorového tlaku osmotickým příjmem vody podmiňují). ● při snížené roztažnosti buněčné stěny, např. vratným působením zpevňujících bílkovin typu extensinů, či kondenzací fenolických látek typu ligninu (což už je proces nevratný). Je velmi pravděpodobné, že rostliny mohou také regulovat hodnotu prahové úrovně turgoru (nejspíš pomocí látek hormonálního charakteru), což může ve svých důsledcích vést k rozdílům v citlivosti k nedostatku vody (tedy při jak velké ztrátě vody a tudíž i snížení turgorového tlaku se již zastaví růst). Grafické znázornění závislosti rychlosti prodlužovacího růstu buňky na hodnotě turgorového tlaku a na roztažnosti buněčné stěny. Růst a diferenciace embrya Vznik nového jedince pohlavní cestou u rostlin, stejně jako u živočichů, začíná splynutím haploidních jader samičí (vaječné) a samčí (spermatické) pohlavní buňky, ale jisté specifické odlišnosti přece jen existují. Vaječná buňka je uložena u krytosemenných rostlin ve zvláštní struktuře označované jako zárodečný vak, ve které jsou uzavřeny ještě dvě další haploidní jádra. Oplození se účastní současně dvě samčí buňky. Splynutí jádra jedné z nich s jádrem vaječné buňky dává vznik diploidní zygotě a z ní pak následně embryu. Splynutím jádra druhé samčí buňky se dvěma jádry zárodečného vaku vede k tvorbě triploidního zásobního pletiva – endospermu. Endosperm sice roste v další fázi mnohem rychleji než embryo, ovšem růst embrya je nejen podstatně důležitější, ale i složitější. Strukturní (anatomické) změny při růstu embrya, znázorněné na následujícím obrázku, jsou již známy dosti dlouho. První příčné dělení protáhlé zygoty je asymetrické, přičemž menší dceřiná buňka (označovaná jako apikální) vzniká z metabolicky aktivnější části zygoty vyplněné hustou cytoplazmou, zatím co větší (bazální) dceřinná buňka vzniká z protilehlé části, ve které se nalézá velká vakuola. Apikální buňka z prvního dělení zygoty během asi 30 hodin po oplodnění dává vznik kulovitému útvaru složenému z osmi buněk (oktant). Ten je však už zřetelně rozlišen na dvě RŮST A VÝVOJ 3 vrstvy po čtyřech buňkách, jejichž osudy jsou v dalším vývoji zcela odlišné. Z horní vrstvy buněk se postupně diferencuje apikální meristém a základy děložních lístků, zatímco ze spodní vrstvy hypokotyl a větší část primárního kořene včetně meristému nad klidovým centrem. Z příčného dělení bazální buňky se vytváří sloupeček suspenzoru, napojující embryo k zárodečnému vaku, ovšem nejvrchnější buňka této struktury (hypofýza) se vyvíjí zcela odlišně a v plně diferencovaném embryu jsou z ní vytvořeny základy meristému kořenové čepičky a přiléhajícího klidového centra. Ve finální fázi vývoje embrya dochází k dalšímu prodloužení základu děložních lístků (stádium označované jako torpédo), následuje řízená ztráta vnitrobuněčné vody a společně s dehydratovaným endospermem vstup do dormantního stavu ve zralém semenu. Vývojová stádia při růstu embrya modelové rostliny Arabidopsis thaliana. Barevně je odlišena lokalizace skupin buněk shodného původu při postupné diferenciaci embrya a mladé rostliny. Růst a diferenciace embrya je i v současné době předmětem intenzivního výzkumu, ovšem již nikoli observačně anatomického. Hlavní pozornost je nyní orientovaná k poznání regulačních mechanismů, které řídí diferenciaci jednotlivých skupin buněk v rostoucím embryu. Intenzivní výzkum se provádí na modelových rostlinách (hlavně Arabidopsis thalliana) pomocí nejmodernějších molekulárních metod, neboť detailní znalost mechanismů řídících růst a vývoj embrya může mít klíčový význam pro pochopení regulačních procesů, které se obdobným způsobem mohou odehrávat v průběhu dalších, postembryonálních vývojových stádií rostliny v orgánech s růstovou aktivitou. Není nutno zdůrazňovat, že poznatky v tomto směru by mohly mít značné praktické využití při záměrném řízení růstu užitkových rostlin. Dosud získané výsledky nejsou ještě zdaleka uspokojivé, ale přesto již mohou sloužit jako názorný příklad dokumentující složitost celé problematiky. Z obecných znaků (předpokladů), které se uplatňují při regulaci růstu a diferenciaci nově vznikajících buněčných populací, můžeme uvést alespoň ty hlavní: ● polarita buněk, která je vytvořena již u zygoty před začátkem prvního dělení. I pouhým pozorováním lze zjistit, že protilehlé části zygoty mají odlišnou strukturu buněčného obsahu (hustota cytoplazmy, rozmístění organel), ale rozdíly jsou nepochybně i funkční. Polarita je přenášena při dalších děleních i do všech nových buněk. ● poloha buněk v prostorových souřadnicích. Buňky mají schopnost vnímat informace o RŮST A VÝVOJ 4 svém prostorovém umístění v rámci vznikajícího mnohobuněčného útvaru a na základě této informace upravovat svoje další chování. Celý mechanismus podmiňující tento typ reakcí je ale dosud znám velmi nedostatečně. ● účast fytohormonů, zejména typu auxinů a cytokininů. Ty jsou složitě řízeným způsobem transportovány rostoucím konglomerátem buněk a podílí se na mezibuněčné koordinaci časově a prostorově oddělené aktivace genů. ● zpětnovazební mechanismy jsou neobyčejně časté a silné. Je již známo velké množství genů, které se střídavě aktivují či inhibují v závislosti na osudech svých vlastních „produktů“, často přes kaskádu složitých interakcí. Zvláště komplikované vazby bývají mezi skupinami transkripčních faktorů, kdy aktivace jedné z nich může vyvolat represi jiné. Schéma jednoho z autoregulačních mechanismů při růstu embrya, který v tomto případě slouží k udržování optimálního počtu kmenových buněk v apikálním meristému prýtu. Uvedenými zkratkami bývají pro zjednodušení označovány geny i proteiny které jsou jimi kódovány. Klíčový význam pro správný vývoj embrya a následný růst mladé rostliny má formování dvou meristematických center, což je proces řízený početnou skupinou genů aktivovaných v jisté časové posloupnosti, která koreluje se změnami koncentrace fytohormonu auxinu. Nově vznikající buňky, odvozené od centrální skupinky buněk kmenových, se velmi brzo oddělují do funkčně rozdílných zón, které jsou pak základem pro tvorbu odlišných pletiv. Zvláště nápadné jsou rozdíly mezi periferní zónou převážně antiklinálně se množících buněk (protoderm), jakožto základu pro tvorbu epidermis, a střední zónou, ze které se později diferencuje bazální meristém produkující buňky pro stavbu kůry a cévních svazků vnitřní části stonku či kořene. Mezi jednotlivými zónami, i přes jejich rozdílnost (strukturní, funkční i co do předurčenosti další diferenciace) existují velmi těsné regulační vazby zajišťující optimální proporcionalitu jejich dalšího rozvoje. Diferenciace a růst jednotlivých orgánů mladé rostliny RŮST A VÝVOJ 5 Embryo uzavřené v zaschlém stavu v semeni může obnovit svůj další růstu až po ovlhčení a dostatečné rehydrataci buněk. Avšak ani pak ještě nemusí dojít ke klíčení, pokud zůstal zachován velký obsah inhibičních látek, zajišťujících vstup embrya do dormance (zejména kyselina abscisová). U některých druhů je navíc klíčení podmíněno přítomností látek stimulující povahy typu fytohormonů a fytochromů, (budou probírány v dalších kapitolách). Při klíčení semen jsou jako jedny z prvních obnoveny respirační procesy a funkčnost proteosyntetického aparátu, následuje spuštění tvorby hydrolytických enzymů pro rozklad rezervních látek v endospermu, a plně se aktivuje činnost obou apikálních meristémů (pro primární kořen a stonek). Navazující diferenciační procesy vedou k rychlé tvorbě všech pletiv a orgánů juvenilní rostliny. Kořeny jsou orgánem s poměrně jednoduchou a jednotnou stavbou. Obvykle při jejich růstu rozlišujeme čtyři strukturně i funkčně rozdílné zóny, jejichž hranice však nemusejí být zcela ostré: ● Kořenová čepička chrání apikální meristém před poškozením, usnadňuje průnik kořene půdou vylučováním slizovitých látek (mukopolysacharidů), a podílí se i na řízení růstových procesů v jiných částech kořene (např. gravitropické reakce). Buňky kořenové čepičky se tvoří z vlastního meristému, postupně se dostávají až na okraj, kde se odlupují. ● Meristematická zóna je uložena nad kořenovou čepičkou. Produkuje řetězce buněk z nichž se v další fázi vytváří pouze válcový primární kořen, bez jakýchkoli postranních struktur. Na rozhraní mezi touto meristematickou zónou a meristémem kořenové čepičky bývá skupinka několika kmenových buněk s velmi malou dělivou aktivitou (klidové centrum). ● Prodlužovací zóna má již velmi omezenou dělivou aktivitu, zato v ní dochází k velmi podstatnému zvětšení objemu všech buněk produkovaných meristémem. Dochází zde již také k částečné diferenciaci pletiv, především vodivých elementů. ● Zóna dokončování diferenciace, ve které dostávají jednotlivá pletiva svoji konečnou podobu. Velmi dramatická je zejména diferenciace plně funkčních vodivých pletiv, která je spojena s částečnou degradací vnitřního obsahu buněk předurčených k přeměně na vodivé elementy lýka (články sítkovic), či dokunce k jejich úplnému odumřením („programovanou smrtí“, tedy sebezničením) v případě elementů xylému (cév a cévic). Vytváří se také vrstva buněk endodermis, která je pro správnou funkci kořene nepostradatelná. Základy bočních kořenů se vytvářejí až ve zcela diferencovaných částech kořene a nejsou tudíž nijak závislé na činnosti apikálního meristému. Jejich tvorba začíná obnovením dělivé aktivity skupinky buněk v pericyklu, iniciované stimulačním působením lokálně zvýšené koncentrace fytohormonů (především auxinů a cytokininů). Spouštěcí signály vedoucí k tvorbě bočních kořenů nemusejí vycházet jen z vnitřního programu či „potřeb“ rostliny, ale mohou vznikat pod vlivem faktorů vnějšího prostředí, např. za jisté koncentrace živin v okolí kořene. Růst bočního kořene je provázen velmi rychlým vznikem apikálního meristému a kořenové čepičky, jejichž funkce jsou zcela stejné jak u kořene primárního. Jediným rozdílem bývá obvykle menší gravitropická reakce či její úplná ztráta. Tloustnutí kořenů je zajištěno u nahosemenných a u většiny dvouděložných činností sekundárního meristému (kambia), který se zakládá mezi lýkem a dřevem. U jednoděložných se obvykle kambiální kruh nezakládá a k tloustnutí dochází pouze zvětšováním buněk a tvorbou nových cévních svazků. Počáteční fáze zakládání bočního kořene v pericyklu Prýt (= souhrnné označení pro všechny mimokořenové, tedy obvykle nadzemní části rostliny, odpovídá anglickému termínu shoot) má také své základy již vytvořené v embryu, ve formě jednoduchého apikálního meristému, ovšem velmi brzy se musí u mladého semenáčku vytvářet útvar podstatně složitější. Apikální meristém totiž musí být schopen zajišťovat nejen růst a větvení stonku, ale i zakládání dalších meristémů pro růst listů a květů. RŮST A VÝVOJ 6 Uspořádání vrstev dělivých buněk v apikální části prýtu je nejen značně odlišné od kořenové špičky, ale také specifické pro různé druhy či celé vyšší taxonomické okruhy rostlin. V typickém případě lze rozlišit na apikálním meristému vnější jedno- až třířadou vrstvu buněk, dělících se antiklinálně (buňky pláště čili tuniky), a vnitřní buňky (korpus) dělící se periklinálně až neuspořádaně. Dělivé buňky lze nalézt mnohem dále od špičky vzrostného vrcholu, než jak tomu bývá u kořenů. K tvorbě základů listů (listových primordií) však přesto dochází v těsné blízkosti vegetačního vrcholu. Jedná se proces mimořádně složitý z hlediska řízení, a současně mimořádně důležitý z hlediska budoucí stavby celé nadzemní části rostliny. Již v této velmi ranné fázi se často rozhoduje nejen o celkovém počtu listů, ale i o časových intervalech mezi jejich tvorbou, o typu fylotaxe a také ovšem o způsobu a frekvenci větvení stonku. Listy se rozvíjejí z listových základů (primordií) pomocí několika dalších specifických meristémů. V prvních fázích růstu má největší dělivou aktivitu vrstva buněk na vnějším konci primordia, později i na okrajích (marginální meristém zajišťující růst do šířky), a někdy i v bazální části (interkalární meristém, zvláště aktivní u listů trav). Složité tvary listových čepelí u některých druhů rostlin jsou vytvářeny nestejnou aktivitou jednotlivých úseků marginálního meristému. Složitost tvorby listů ale vyplývá také z toho, že je nutno regulovat průběh růstových procesů ve třech na sebe kolmých osách, určujících délku, šířku a tloušťku listu. Zakládání a růst listových primordií s vyznačenými toky fytohormonu auxinu Meristémy listů jsou udržovány v aktivním stavu někdy velmi dlouho (např. u trav je schopen i zcela dospělý list obnovit růst za jistých podmínek). U listů většiny dvouděložných rostlin však dělivý růst trvá poměrně krátce a nelze jej znovu aktivovat. U těchto listů je dělení buněk ukončeno již při dosažení jedné pětiny až poloviny konečné plochy listu - pak již dochází jen ke zvětšování objemu buněk. V této dlouživé fázi růstu jsou však jisté rozdíly buňky mezofylu zastavují růst dříve než epidermální, a proto při dalším zvětšování plochy (již jen růstem epidermis) dochází ke vzniku rozsáhlých intercelulár v mezofylu. Vytrvalé rostliny se sezónní periodicitou růstu (např. naše stromy) zakládají listová primordia pro jarní období růstu již při tvorbě pupenů v předcházejícím roce. Také v semenech některých druhů rostlin lze nalézt ještě před vyklíčením na embryu kromě základů listů děložních i primordia několika dalších (pravých) listů. RŮST A VÝVOJ 7 RŮST A VÝVOJ 8 Vnitřní chemické regulátory růstu Základní informace pro řízení růstu, diferenciace a hrubý „stavební plán“ morfogeneze jsou sice kódovány v DNA každé rostlinné buňky, ovšem tyto informace samy o sobě nestačí pro zajištění optimálního průběhu uvedených procesů. Buňky musí neustále monitorovat stav vnějšího prostředí a také komunikovat navzájem. Podněty z těchto zdrojů významným způsobem ovlivňují expresi genetické informace. Koordinace růstových procesů v rostlinách není také možná jen na úrovni jednoho orgánu - je nutná souhra činnosti souborů buněk (pletiv) i velmi vzdálených, tedy i například mezi kořeny a nadzemními částmi. Přenos morfogenetických signálů se děje převážně pomocí chemických sloučenin transportovaných lýkem i xylémem, na kratší vzdálenosti pak různými mezibuněčnými cestami (plasmodesmaty, nebo buněčnou stěnou a membránovými transportními proteiny). Jedná se většinou o sloučeniny poměrně jednoduché chemické struktury, ovšem jejich konečný dopad na morfogenezi rostlinného organismu je zcela srovnatelný s působením hormonů u živočichů. Proto se také označují jako rostlinné hormony (fytohormony). Fytohormon je definován jako organická sloučenina, která po syntéze v jedné části rostliny je transportována do jiné její části, kde ve velmi malé koncentraci způsobuje fyziologickou reakci. K fytohormonům tedy nepočítáme anorganické ionty přijímané z vnějšího prostředí, ani organické metabolity produkované rostlinou ve velkých kvantech (sacharidy, aminokyseliny), i když mohou významně růst ovlivňovat. Nezahrnujeme k nim ani uměle vyrobené sloučeniny s regulační účinkem na růst. V současné době máme nejvíce poznatků o fytohormonech označovaných jako auxiny, gibereliny a cytokininy a brassinosteroidy, která vytvářejí často velmi početné skupiny sloučenin s podobnou chemickou strukturou i s podobnou funkcí v rostlinách. K velmi významným a rozšířeným fytohormonům patří i samostatně stojící sloučeniny: etylén, kyselina abscisová a kyselina jasmonová, z nichž každá má odlišné, zcela specifické působení. Uvedené základní fytohormony hrají nezastupitelnou regulační úlohu u naprosté většiny rostlin. Kromě nich je známa ještě řada dalších sloučenin, které vyhovují definici fytohormonu (např. polyaminy a celá řada fenolických látek). O jejich funkci máme dosud méně poznatků, avšak přesto jejich významnost je zcela nepochybná. Výskyt těchto látek bývá však někdy omezen jen na některé taxonomické skupiny rostlin. Na rozdíl od živočišných hormonů neprobíhá tvorba fytohormonů u rostlin v úzce vymezených částech jejich těla, které by plnily podobnou funkci jako žlázy s vnitřní sekrecí u živočichů. Potenciální schopnost tvořit fytohormony má velmi často většina buněk celé rostliny, i když v nestejné míře, a ne vždy musí být tato schopnost aktivována. Také účinky (oblasti působení) fytohormonů jsou mnohem méně specifické ve srovnání s živočišnými hormony. Každý fytohormon může působit na buňky v různých orgánech a výsledek tohoto působení vůbec nemusí být podobný. Je totiž často závislý na vývojovém stavu příslušného orgánu i na interakcích jak s dalšími fytohormony, tak i s mnoha dalšími vnitřními i vnějšími faktory, zejména se světelným a teplotním režimem. Velmi různorodý je i mechanismus působení. I pro tentýž typ fytohormonu může existovat více typů specifických receptorů (membránových i volně pohyblivých v cytosolu), více možných cest přenosu signálu od receptorů, a konečně i více regulovaných vnitrobuněčných struktur. Mohou jimi být metabolicky významné či transportní proteiny, ale nejčastěji se jedná o ovlivňování exprese genů v jádře, jak bude v dalším textu pro každou skupinu fytohormonů blíže popsáno. Zejména jde o působení na úrovni přepisu (transkripce) a úpravy (processing) mRNA. Tyto články aktivace genetické informace jsou totiž ovlivňovány převážně proteiny (transkripčními faktory, enzymy), a není proto obtížné si představit možné působení fytohormonu na příslušný regulační protein. Auxiny Ze všech rostlinných hormonů byly jako první objeveny auxiny. Po dlouhá léta byla známa jen jedna látka tohoto typu, a sice kyselina indolyl-3-octová (angl. Indole-3-Acetic Acid, zkráceně IAA). Dnes víme, že se v rostlinách vyskytují ještě nejméně tři další organické kyseliny s podobným účinkem: - kyselina 4-chlor-indolyl-3-octová, - kyselina -indolyl-3-máselná, - kyselina fenyloctová. Kromě toho můžeme v rostlinách najít další tři velmi podobné sloučeniny, které však považujeme pouze za prekurzory auxinů (indolylacetaldehyd, indolylacetonitril a indolyletanol). Velmi snadno se oxidují na IAA. Známe však i několik uměle připravených látek s účinkem charakteristickým pro auxiny - jde o aromatické sloučeniny s karboxylovou skupinou, což jsou zřejmě dva nezbytné předpoklady pro ovlivnění příslušných receptorů v rostlině (např. kyselina α-naftyloctová, NAA). Ze všech jmenovaných auxinů a jejich prekurzorů máme daleko nejvíc poznatků o tvorbě, transportu a degradaci kyseliny indolyl-3octové (IAA). Její obsah a tím i význam v rostlinách zcela převažuje nad ostatními látkami typu auxinů. Proto také když hovoříme o auxinu (v jednotném čísle), máme na mysli IAA. Syntéza IAA je možná několika cestami, většina z nich však vychází z aminokyseliny tryptofanu. Enzymy, které se na této syntéze podílejí, jsou nejvíce aktivní v mladých rostoucích částech rostlin. Apikální meristémy v nadzemních částech a mladé listy jsou tedy hlavními místy syntézy IAA. Odbourávání (degradace) IAA začíná obvykle ztrátou karboxylové skupiny. Kromě řízení rychlosti syntézy a degradace IAA může rostlina kontrolovat její koncentraci pomocí dočasné inaktivace kovalentní vazbou na některé organické látky, zejména na cukry a aminokyseliny. Z těchto konjugátů se pak IAA snadno uvolňuje pomocí hydrolytických enzymů. Vázaná IAA má velký význam jako zásobní forma- může být ukládána i v semenech a rychle aktivována při klíčení. Transport IAA v rostlině má několik zvláštností. Na rozdíl od většiny ostatních metabolitů, jen zřídka bývá nalézána v lýku či v xylému. Nejčastěji je vedena parenchymatickými buňkami v blízkosti cévních svazků. Tento transport je poměrně pomalý (jen asi 10 mm za hodinu) a vyžaduje metabolickou energii. Plazmatické membrány překonává pomocí selektivních transportních proteinů několika typů. Pro vstup do buňky (influx), slouží hlavně symport (+2H+ ) selektivními přenašeči označovanými zkratkou AUX1. Za nízké hodnoty pH v buněčné stěně (pod 5,5) je možný i pasivní transport nedisociovaných (a tudíž elektricky neutrálních) molekul IAA z apoplastu do cytosolu. Za vyššího pH , které pravidelně bývá uvnitř buněk (v cytosolu, zhruba 7 až 7,5) jsou molekuly IAA disociované a jejich zpětný transport (výstup, efflux) už bývá pravidelně pasivní- celou rodinou aniontových RŮST A VÝVOJ 9 RŮST A VÝVOJ 10 přenašečů typu PIN, protože pro pasivní transport anionů ven z buňky je obvykle příznivý spád elektrochemického potenciálu. Avšak i efflux může být v případě potřeby paralelně prováděn pomocí primárně aktivních (ATP-využívajících) přenašečů typu PGP. Další zvláštností je výrazně polární charakter transportu IAA - v nadzemních částech se pohybuje vždy od růstového vrcholu a od mladých listů směrem dolů, ke kořenům (bazipetálně), ale není přitom závislý na působení gravitace (probíhá stejným způsobem i u stonku umístěného do vodorovné polohy). Bazipetální směr transportu je totiž určován nestejným umístěním (lokalizací) zmíněných transportních proteinů v plazmatické membráně Přenašeče pro vstup (AUX) nacházíme jen v „horní“ části buňky (tedy směrem k vegetačnímu vrcholu), zatímco v její „spodní“ části jsou přenašeče pro výstup (PIN). Rychlost transportu auxinů může být významně ovlivňována působením některých specifických metabolitů, zejména ze skupiny flavonoidů. Působení auxinů na procesy v rostlinách je mnohostranné. Na některé z účinků auxinu jsme již narazili v předcházející kapitole věnované embryogenezi a regulaci procesů v meristémech (včetně zakládání primordií listů, postranních pupenů, atd.). Lze jen dodat, že i diferenciace vodivých pletiv (cévních svazků) probíhá správným způsobem jen za působení jisté koncentrace auxinů. Nejznámější oblastí působení auxinů je ovšem je stimulace dlouživého růstu buněk, částečně i rychlosti dělení, a to často již v koncentraci 10-8 M. Stejně tak dobře prozkoumaný je kladný vliv zvýšené koncentrace auxinů na růst kořenů, zvláště na četnost větvení a na tvorbu adventivních kořenů. Tato vlastnost má široké praktické využití při zakořeňování řízků rostlin (nejúčinnější bývá kyselina indolyl-3-máselná). Vliv auxinů na buněčné aktivity se v přírodních podmínkách uplatňuje i při poranění, kdy stimulují tvorbu ochranné vrstvy zkorkovatělých buněk zacelujících ránu, a v případě potřeby i obnovu poškozeného xylému. Účinek auxinů na obnovení dělivé aktivity se ale projevuje pouze za přítomnosti dalších fytohormonů ze skupiny cytokininů. Auxiny mohou také ovlivňovat tvorbu některých dalších fytohormonů, např. tvorbu etylénu, který má převážně inhibiční účinky, ale naopak i tvorbu giberelinů, které mají stimulační účinky na růst. Působení auxinů může tak být někdy nepřímé, zprostředkované jinými fytohormony, s nimiž jsou v interakci. Auxiny jsou nezbytné pro řízení pochodů, kterými rostlina reaguje na jednostranné působení prostředí (gravitropismus, fototropismus). Ty budou podrobněji probrány v dalších kapitolách. Auxiny mají také významný podíl na řízení apikální dominance růstu (= inhibiční vliv vegetačního vrcholu na níže položené pupeny), která je u rostlin běžným jevem. Podle původní představy byla "nadvláda" vrcholového meristému vysvětlována vysokou koncentrací auxinů transportovaných z vegetačního vrcholu. Jak je známo, příliš vysoká koncentrace auxinů (zhruba nad 10-4 M) může mít již výrazně inhibiční účinky na růst, a tudíž by teoreticky mohla brzdit rozvoj níže položených pupenů. Přesná měření auxinových gradientů však tento jednoduchý regulační mechanismus nepotvrdila, neboť mezi stupněm inhibice pupenů a rychlostí přítoku nativních auxinů nebyla zjištěna kladná závislost. Na druhé straně však víme, že jistý vliv auxinů na apikální dominanci je zcela nepochybný (při zastavení jejich přísunu je zrušena i dominance!). Současné výzkumy dokazují významnou úlohu terpenoidních látek vznikajících štěpením karotenoidů při inhibici níže položených pupenů, ovšem současně bylo zjištěno, že jejich účinnost je vázána na interakci s auxiny. Studium mechanismu působení auxinů v buňkách se zpočátku zaměřovalo hlavně na vysvětlení stimulace dlouživého růstu.Vzhledem k tomu, že jde o reakci velmi rychlou (již za 15 minut dochází k měřitelným růstovým změnám!), nelze ji vysvětlit vstupem auxinů do jádra a ovlivňováním genové aktivity, ale spíše přenosem signálu z vhodného receptoru v plazmatické membráně k mimojaderným efektorům. Skutečně se podařilo objevit selektivní membránový receptor (označovaný jako auxin binding protein, ABP1), který po aktivaci molekulou auxinu (a za asistence druhotných vnitrobuněčných mediátorů) je schopen stimulovat činnost protonových pump v plazmalemě. Následné snížení pH v buněčné stěně vede k zvýšení její roztažnosti (extenzibility), což, jak již víme (viz str. 3), vede ke zrychlení dlouživého růstu. Klasická představa možných mechanismů působení auxinů na růst buněk receptorovou cestou. Novější výzkumy ale současně ukázaly, že naprostá většina ostatních vnitrobuněčných procesů řízených auxiny probíhá nezávisle na membránových receptorech (i po jejich vyřazení z funkce), a je spojena s ovlivňováním aktivity velkého počtu genů až po vstupu auxinů do buňky. Velmi zjednodušeně ho lze popsat následujícím způsobem: Gibereliny Objev této skupiny fytohormonů je přibližně stejně starý jako v případě auxinů (pozorování účinků látek vylučovaných patogenní houbou Gibberella fujikuroi na zrychlení růstu stébel rýže ve dvacátých letech a izolace účinných látek ve třicátých letech minulého století). Byl učiněn v Japonsku a na dlouhou dobu zapomenut - teprve od padesátých let se začaly gibereliny skutečně intenzivně zkoumat. Všechny gibereliny patří mezi terpeny s 19 až 20 uhlíky ve čtyřech kruhových systémech a nejméně s jednou karboxylovou skupinou. Jsou proto kyselé povahy. Označují se zkratkou GA (Gibberellic Acid) s číselným indexem vyjadřujícím pořadové číslo od jejich objevu. V současné době známe asi 136 různých přirozeně se vyskytujících giberelinů, ovšem jejich významnost je velmi rozdílná. Byly nalezeny u všech dosud zkoumaných druhů cévnatých rostlin i u značného počtu druhů rostlin nižších, ovšem u každého druhu je přítomno jen několik typů giberelinů. Některé jsou společné řadě druhů (např. GA1 a GA3), jiné lze najít RŮST A VÝVOJ 11 mnohem vzácněji, či jejich funkce mohou být více specializované. Chemické struktury jednotlivých sloučenin z celé skupiny giberelinů (a řadu dalších informací o fytohormonech) lze najít na webové stránce www.plant-hormones.info/gibberellin_nomenclature.htm . Syntéza giberelinů in vivo vychází z acetátových skupin, ze kterých se tvoří kyselina mevalonová a isopentenylpyrofosfát, jako základní stavební prvek všech terpenů. Degradace giberelinů v rostlinách je velmi pomalá, ale často dochází k inaktivaci vazbou s jinými sloučeninami. Konjugáty s glukózou (glukosidy) jsou nejčastější a velmi důležitou zásobní formou giberelinů. Pravděpodobně každá rostlinná buňka má schopnost tvořit gibereliny, ovšem v některých orgánech je tato tvorba zvláště intenzivní. K nim patří především mladé listy, které svou produkcí giberelinů mohou působit na velké zrychlení růstu stonku. Neobyčejně vysoká koncentrace giberelinů bývá pravidelně zjišťována v mladých, vyvíjejících se semenech, kde se ukládají ve formě konjugátů. Transport giberelinů, na rozdíl od auxinů, není jen bazipetální, ale může probíhat všemi směry, snadno jsou transportovány i lýkem nebo xylémem. Syntéza giberelinů probíhá nejen v nadzemních částech, ale i v kořenech, ovšem vlastní růst kořenů je jimi jen velmi málo ovlivňován. Spíše bývá zjišťováno, že většina produkce giberelinů je transportována xylémem z kořenů do nadzemních částí. Giberelin GA3 patří k nejběžnějším giberelinům v rostlinách. Z fyziologických účinků giberelinů je nutno na prvním místě jmenovat celkové zrychlení růstu zejména pak stimulaci dlouživého růstu stonku. Geneticky pozměněné rostliny s poruchou syntézy giberelinu mají zakrslý vzrůst a jejich reakce na uměle dodaný giberelin je překvapivě velká. Ale i normální (geneticky nepozměněné) rostliny mohou výrazně zrychlit růst stonku po aplikaci giberelinu, což je zvláště nápadné u trav, nebo také u některých rostlin z čeledi brukvovitých, které ve vegetativní fázi tvoří přízemní růžice se silně zkráceným stonkem. Gibereliny mají významnou funkci při klíčení semen. Na počátku klíčení se uvolňují hydrolýzou z konjugovaných zásobních forem, později jsou produkovány embryem. Kromě stimulace růstových procesů v prorůstajícím embryu (spolu s auxiny) stimulují také tvorbu a vylučování hydrolytických enzymů, které jsou nutné pro rozklad zásobních polysacharidů v semeni na jednoduché cukry využitelné k růstu klíční rostlinky. Na stanovení rychlosti tvorby α-amylázy v aleuronové vrstvě obilek je založen jeden z biotestů používaných na stanovení koncentrace a účinnosti giberelinů v extraktech. Z dalších účinků giberelinů lze uvést jejich stimulační účinky na tvorbu pylu a na nasazování plodů u některých ovocných stromů i v těch případech, kdy nedošlo k opylení (parthenokarpie, bezsemenné plody). Je také dokázán jejich vliv na urychlení přechodu z juvenilní fáze do dospělosti, spojené např. se schopností tvorby šišek u jehličnatých stromů. Gibereliny se mohou také podílet na indukci tvorby květů u fotoperiodicky závislých druhů rostlin, jak ještě bude blíže popsáno v kapitole věnované fotoperiodicitě. Experimentálně bylo zjištěno, že aplikací giberelinů lze někdy přerušit dormanci semen i pupenů a nahradit tak vlastně působení nízkých teplot, dlouhé fotoperiody či červeného světla, které jsou jinak na odstranění dormance nutné. RŮST A VÝVOJ 12 Mechanismus působení giberelinů je v současné době velmi intenzivně studován. Vzhledem k rozmanitým oblastem jejich účinků nelze očekávat nějaký obecně platný mechanismus. Je však jisté, že obdobně jako u auxinů je část regulačních aktivit spojena se zachycením molekuly giberelinu v selektivním receptoru v plazmatické membráně a s přenosem signálu řetězcem druhotných přenašečů do jádra či na jiná místa v buňce, ovšem současně je možný i vstup giberelinů do buňky a jejich interakce s proteiny regulujícími expresi genů v jádře, obvykle na úrovni transkripce. Dobře prozkoumaným je mechanismus stimulace tvorby hydroláz v klíčících obilkách (viz obrázek níže). Tvorba transkripčního faktoru genu pro tvorbu α-amylázu v buňkách aleuronové vrstvy je bez přítomnosti giberelinu blokována represorem aktivátoru transkripce K jeho odstranění (degradací po navázání ubiquitinu za asistence ubiquitin ligázy) může dojít na základě signálu přenášeného z giberelinového receptoru v plazmatické membráně (přes Gprotein a aktivovaný F-box protein). Je ale možná i alternativní cesta vedoucí k odstranění represoru transkripce, a sice přes navázání molekuly giberelinu na specifický volně pohyblivý receptorový protein až přímo v jádře. Bylo ale zjištěno, že při tomto druhém způsobu aktivace transkripce sice dochází k tvorbě α-amylázy, ale ta se hromadí v buňce. Její transport ven z buňky je spouštěn jen po přenosu signálu z giberelinového receptoru zakotveného v plazmatické membráně. Funkce giberelinů při tvorbě hydrolytických enzymů v klíčící obilce: hlavní směry výměn metabolitů. Detaily mechanismu aktivace genu pro α-amylázu v jádře aleuronové buňky RŮST A VÝVOJ 13 RŮST A VÝVOJ 14 Mechanismus působení giberelinů na růstové procesy je značně složitější a jeho výzkum stále pokračuje. Je však známo, že stimuluje jednak dělení buněk (zkrácením G1 a S-fáze), hlavně však jejich dlouživý růst v subapikálních růstových zónách. Ke zrychlení dlouživého růstu buněk dochází především zvýšením roztažnosti buněčné stěny, nejspíše ovlivňováním inkorporace proteinů ze skupiny extensinů. Na rozdíl od působení auxinů není změna roztažnosti buněčné stěny spojena se změnou její acidity. Na rychlost růstu působí příznivě i velké množství hexos, uvolňovaných při stimulované hydrolýze polysacharidů, neboť ty jsou zdrojem energie a stavebního materiálu pro rostoucí buňky. Navíc přispívají ke zvýšení osmotického tlaku, a tedy i k následnému zvýšení turgoru. Ten, jak již víme, je nutným předpokladem růstu. Praktické využití giberelinů je dosti omezené. Gibereliny nelze vyrábět ve větším měřítku synteticky a také jejich biotechnologická produkce kulturami hub je drahá. Přesto se občas používají, a to zejména na zvětšení rozměrů rostlin či jejich orgánů (např. postřikem některých odrůd révy vinné lze vypěstovat značně větší hrozny). Zvětšení rozměrů po ošetření gibereliny však nemusí být vždy spojeno se vzrůstem hmotnosti sušiny. Více než vlastní gibereliny došly praktického využití sloučeniny, které jejich syntézu v rostlinách blokují a způsobují tudíž zpomalení růstu (růstové retardanty). K takovým látkám patří např. chlorcholinchlorid, známý pod zkratkou CCC ("Retacel"), ale i jiné sloučeniny známé pod obchodními názvy Phosphon a Paclo-butrazol. Často se těmito přípravky ošetřovaly obiloviny, neboť kratší stébla jsou méně náchylná k polehání. Jejich používání však už v současné době není dovoleno, neboť zdravotně nebezpečné metabolity těchto látek se dostávaly do potravního řetězce. Cytokininy Na počátku padesátých let minulého století byly na několika výzkumných pracovištích usilovně hledány a testovány látky, které by mohly regulovat rychlost buněčného dělení (cytokineze). Toto úsilí bylo motivováno nejen možnými aplikačními aspekty, ale vycházelo i z potřeby lépe vysvětlit růstově-regulační procesy. Rozkladem DNA byla získána sloučenina nazvaná kinetin, která byla sice velmi účinná, ale - jak se později zjistilo - v rostlinách se volně nikdy nevyskytuje. Teprve v šedesátých letech se skutečně podařilo z rostlin extrahovat přirozeně se vyskytující (nativní) látky s velmi podobnou strukturou a účinky jako měl kinetin. První izolace se podařila z endospermu nedozrálých obilek kukuřice (Zea mays) proto dostala nově objevená sloučenina název zeatin. Je asi vůbec nejhojnější ze všech cytokininů, kterých dnes již známe několik desítek. Část z nich nacházíme v rostlinách ve volné formě, část jich bývá vázána na některé jiné sloučeniny (např. jako atypické báze v tRNA, nikoli však v DNA!). Spolu se synteticky připravenými analogy představuje celá skupina cytokininů více než 200 sloučenin. Z chemického hlediska jsou si všechny cytokininy dosti podobné, ovšem tvorba různých derivátů je zde častější než u jiných fytohormonů. Základní kostru tvoří adenin, na který je připojen boční řetězec (např. isopentenyl u jednoho z velmi běžných cytokininů, isopentenyladeninu). Kromě toho se na každý z cytokininů může napojovat ribóza za vzniku nukleosidu (ribosidu) a po připojení fosfátové skupiny vznikají nukleotidy. Ty jsou obvykle nejčastější transportní formou cytokininů. Největší regulační účinky však mívají jen základní formy, označované též jako volné báze. Syntéza cytokininů v rostlinách se odvozuje od adenosinmonofosfátu (AMP), ze kterého se pak odštěpuje fosfátová skupina a ribóza. Obdobně jako u auxinů a giberelinů je i zde možná tvorba konjugátů (zejména glykosidů), které mohou být využity k ukládání do rezervních orgánů či pro transport. Také u cytokininů máme potíže s přesným určením místa jejich syntézy, neboť toto nemusí být totožné s místem jejich nejvyšší koncentrace. Existují ale dostatečné důkazy o zvláště intenzivní syntéze cytokininů v apikálním meristému kořenů, odkud jsou rozváděny xylémem do ostatních orgánů. Kořeny však nejsou jediným místem syntézy - k tvorbě cytokininů může docházet i v různých pletivech nadzemních částech, ale obvykle jen v omezeném množství a v určité vývojové fázi. Mladé listy a jiné nadzemní orgány s meristémy, v nichž pravidelně zjišťujeme vysokou koncentraci cytokininů, jsou jimi v převážné míře zásobovány z kořenů. Chemická struktura některých běžných cytokininů. Fyziologické účinky cytokininů jsou značně různorodé. Jejich prvořadou funkcí je nepochybně schopnost regulace dělení buněk v meristémech, která je ale vázána jen na jejich optimální koncentraci – nedostatek i nadbytek cytokininů rychlost dělení buněk snižuje. Pod vlivem cytokininů může být obnovena dělivá aktivita i v diferencovaných pletivech, např. při tvorbě závalu (kalusu) na poraněných místech. Obvykle je ale nutná i zvýšená koncentrace auxinů. Cytokininy podporují tvorbu bočních pupenů u dvouděložných rostlin a ruší jejich dormanci (způsobenou např. apikální dominancí), ovšem další růst iniciovaných pupenů je možný pouze za spoluúčasti auxinů a giberelinů. Velmí zajímavou a dosud málo probádanou oblastí působení cytokininů je jejich interakce s minerálními výživou rostlin. Hladina cytokininů se v rostlinách zvyšuje úměrně se stoupajícím množstvím dostupných živin v půdě, což má nezanedbatelný dopad i na jejich efektivnějším využívání (např. zrychlení a účelné směrování jejich transportu, zabudovávání v rostoucích a zásobních orgánech) Významný je také účinek cytokininů na zpomalení stárnutí některých orgánů rostlin. Mnoho pokusů bylo prováděno zejména s listy, které si podstatně déle zachovávají funkční chloroplasty a vysoký obsah chlorofylu jestliže je v nich obsah cytokininů zvýšen (umělou aplikací či přirozenou cestou po zakořenění řapíku). Ukazuje se, že cytokininy především chrání membrány před degradací (antioxidační ochrana nenasycených mastných kyselin). Neméně významný je i poznatek, že orgány se zvýšeným obsahem cytokininů jsou přednostně zásobovány metabolity rozváděnými v lýku, což má význam nejen pro zpomalení stárnutí některých orgánů, ale zejména pro preferenční zásobení těch nejrychleji rostoucích částí rostliny. Také rychlost toku asimilátů do zásobních orgánů může být řízena cytokininy. RŮST A VÝVOJ 15 Z dalších zjištěných účinků cytokininů můžeme ještě jmenovat stimulační vliv na klíčení semen. V odstranění jejich dormance do jisté míry nahrazují vliv nízkých teplot. Významný stimulační vliv byl pozorován při tvorbě funkčních chloroplastů z proplastidů (včetně zvýšení rychlosti tvorby gran a chlorofylu), což lze vysvětlit zrychlenou tvorbou specifických proteinů. Obtížněji vysvětlitelná je však celá řada dalších účinků, např. na tvorbu plodů, rychlost dozrávání, atd. Mechanismus působení cytokininů je znám jen pro některé jejich hlavní účinky. Především se zkoumala cesta přenosu signálu při iniciaci exprese velkého množství genů řízených cytokininy. Tato cesta začíná od nově objevených receptorů cytokininů v plazmatické membráně, které jsou blízce příbuzné dvoukomponentní sensorové histidinové kináze, jejíž funkce byla již dříve popsána u bakterií. Po aktivaci receptoru molekulou cytokininu dojde u tohoto receptoru k autofosforylaci a v dalším kroku k přenosu fosfátové skupiny na mobilní přenašeč signálu, kterým je protein označovaný zkratkou AHP . Ten pak vstupuje do jádra a po opakovaném přenosu fosfátové skupiny až na aktivační elementy (je jich celá řada typů) dojde k indukci transkripce. Cytokininový receptor v plazmatické membráně a přenos signálu do jádra Hlavní účinek cytokininů na iniciaci a zrychlení celého cyklu při dělení buněk je pravděpodobně dosahován různými cestami. Jednou z nich je zvýšení aktivity některých proteinkináz, zapojených do řízení chodu buněčného cyklu. Významný je také vliv cytokininů na urychlení přepisu DNA a tím i na zkrácení syntetické fáze cyklu. Účinek cytokininů na dělení buněk je podmíněn přítomností auxinů, které ovlivňují především iniciaci replikace DNA. Kromě detailní analýzy jednotlivých složek celého mechanismu působení cytokininů máme mnoho údajů o růstových a vývojových změnách celých orgánů či rostlin po experimentálním navození určité hladiny cytokininů. Velká část jich byla získána při kultivacích meristémů či transgenních rostlin in vitro. Z nich je zcela zřejmá koordinace působení cytokininů s auxiny nejen při již zmíněném dělení buněk, ale především při jejich diferenciaci a tvorbě základů orgánů. Jen za určitého poměru koncentrací těchto dvou fytohormonů regenerují z kalusové kultury dokonale vyvinuté rostliny. Při převaze auxinů je preferována tvorba kořenů, nadbytek cytokininů vede pouze k tvorbě stonků a listů. RŮST A VÝVOJ 16 Kyselina abscisová I když k objevu tohoto fytohormonu došlo mnohem později než u všech dosud probíraných skupin (až v roce 1963), vůbec to neznamená, že by snad byl méně významný. Stále zřetelněji se ukazuje, že kyselina abscisová (angl. Abscisic Acid, zkráceně ABA) je nejen velmi mocným regulátorem růstových procesů u všech vyšších rostlin, ale plní i další funkce související se zvýšením odolnosti vůči nepříznivým vnějším vlivům. Po chemické stránce se jedná o relativně jednoduchou sloučeninu - seskviterpenoid s 15 uhlíky v molekule. Tvorba ABA v rostlině může probíhat jednak přímo z kyseliny mevalonové a farnesylpyrofosfátu, a nebo (častěji) nepřímo štěpením některých karotenoidů, především xanthoxinu U listů k tomu dochází v chloroplastech, u nezelených orgánů pak v jiných typech plastidů). Xanthoxin je pak postupně oxidován na ABA-aldehyd a vlastní ABA. Tyto procesy už nejsou vázány na plastidy, ovšem přesto u listů nacházíme největší množství ABA uloženo právě v chloroplastech. Je nutno poznamenat, že i xanthoxin má fyziologické účinky zcela podobné ABA, ovšem je velmi málo pohyblivý. Možné cesty syntézy kyseliny abscisové v rostlinách. Z fyziologických účinků ABA je potřeba na prvním místě uvést zpomalení růstových procesů. V těch částech rostliny, které vstupují do dormance (zejména pupeny na konci léta, ale i semena)), pravidelně nacházíme velmi zvýšený obsah ABA, který se udržuje po dlouhou dobu. Ukončení dormance ale nemusí vždy korelovat s poklesem obsahu ABA, protože velmi záleží i na přítomnosti protichůdně působících stimulačních látek (zejména giberelinů) jejichž obsah se může v průběhu dormance zvyšovat a utlumit působení ABA. RŮST A VÝVOJ 17 Při dozrávání semen však ABA hraje prakticky vždy mimořádně významnou úlohu. V závěrečné fázi růstu embrya se obsah ABA ve všech strukturách semene výrazně zvyšuje a její účinky jsou jak inhibiční, tak i stimulační. Stimuluje ukládání rezervních látek v endospermu a také tvorbu početné rodiny proteinů, které jsou označovány jako LEA proteiny (Late Embryogenesis Abundant proteins). Ty jsou nutné pro uchování RŮST A VÝVOJ 18 životaschopnosti embrya a buněk endospermu při jejich silné dehydrataci (vyschnutí) ve finální fázi tvorby semene. Inhibiční účinky ABA se projevují hlavně v utlumení růstu embrya při dosažení jeho optimálních rozměrů – další pokračování v růstu by znemožnilo správné uložení v semeni. Působením ABA je také inhibovaná tvorba giberelinů, které by narušovaly vstup do dormance. Dříve uváděná úloha ABA při tvorbě odlučovací vrstvičky způsobující opad listů, květů a plodů není v současné době již považována za obecně významnou – uplatňuje se totiž je u malého počtu druhů. Podstatně větší vliv na tento proces má tvorba etylénu. Nicméně podíl ABA na zrychleném stárnutí rostlinných orgánů (zejména listů) je zcela nepochybný, i když často se spoluúčastí etylénu. Stárnutí je provázeno postupným rozpadem proteinů, chlorofylu, nukleových kyselin a dalších snadno rozložitelných buněčných součástí provázené zvýšenou aktivitou hydrolytických enzymů. Kromě regulace růstu má ABA mimořádně významnou úlohu v řízení mnoha dalších fyziologických procesů při působení stresových faktorů na rostlinu. Při nedostatku vody v listech (indikované mírným poklesem turgoru a vodního potenciálu buněk) koncentrace ABA velmi rychle vzrůstá (až 50x). Toto zvýšení vede k zavírání průduchů, a to často mnohem dříve, než by k němu došlo jiným způsobem. Zavírací reakce průduchů bývá dokonce pozorována již při počátku vysychání horních vrstev půdy, ačkoliv vodní potenciál listů je ještě dostatečně vysoký, neboť rostlina je schopna čerpat vodu z hlubších vrstev. Přenos informace z té části kořenové soustavy, která je vystavena začínajícímu suchu, do listů se děje nejčastěji xylémovým transportem ABA, a přispívá k němu i změna pH xylémové tekutiny. Ke zvýšení koncentrace ABA dochází také pod vlivem nízkých teplot a zasolení půdy. ABA je tedy významným článkem obecné stresové reakce, která vede (mimo jiné) i k tvorbě „antistresových“ proteinů zvyšujících celkovou odolnost. Tvorba ABA za zmíněných stresových situací bývá nejčastěji iniciována poklesem turgoru buněk. Mechanismus působení ABA je značně různorodý, neboť je využívána k řízení procesů jak velmi rychlých (např. zavírání průduchů), tak i procesů relativně dlouhodobých (dokončování vývoje semen). Zvláště podrobně byl studován mechanismus působení ABA na pohyby průduchů, o kterém se původně předpokládalo, že patří k těm relativně jednodušším. Tyto předpoklady se však nesplnily protože se ukázalo, že i při tomto regulačním působení může být v téže svěrací buňce využíváno více cest příjmu a přenosu signálu. Ty začínají u membránových receptorů (několika typů), od kterých je po zachycení molekuly ABA signál přenášen přes G-protein na fosfolipázy C či D. Jako navazující přenašeči signálu mohou působit (paralelně v různých cestách!) např. štěpný produkt membránových lipidů (IP3), oxid dusnatý, či některé reaktivní formy kyslíku (H2O2), a ty pak iniciují otevření vápníkových kanálů. Vtok regulační dávky Ca2+ do cytosolu, pak vede k inhibici protonové pumpy, depolarizaci plazmalemy, a k výtoku značné části osmotik a vody ze svěrací buňky. Už tak dost složitou situaci dále komplikuje existence přenosové cesty z membránového receptoru bez aktivační účasti vápníkových iontů (fosforylačním mechanismem), a také existence mobilních vnitrobuněčných receptorů ABA. Ke spuštění exprese genů (zejména pro „antistresové“ proteiny) pod vlivem ABA dochází nejčastěji cestou aktivace transkripčních faktorů (za účasti aktivovaných kináz a mikroRNA), přičemž prvotní signál může být přenášen jak od membránových, tak i vnitrobuněčných receptorů ABA. Může ovšem docházet i k inhibici aktivity některých genů (např. pro tvorbu hydroláz), taktéž na úrovni transkripce. Praktické využití ABA není příliš časté. Někdy bývá používána formou postřiku či máčení k prodloužení dormantního stavu (bez prorůstání) konzumních bramborových hlíz při jejich uskladnění. Postřikem rostlin (polních plodin) lze také zvyšovat jejich odolnost ke stresům, tedy např. před očekávaným nástupem delších období sucha či nízkých teplot. Etylén Zařazení tohoto nejjednoduššího uhlovodíku s dvojnou vazbou - a navíc plynu - mezi fytohormony je poněkud překvapující, ale etylén svými fyziologickými účinky mezi ně rozhodně patří. Působení etylénu na růst rostlin bylo pozorováno již na začátku minulého století. Teprve zavedení plynové chromatografie v šedesátých letech však umožnilo provádět exaktní experimentální výzkum jeho působení. Etylén produkují vyšší rostliny ve všech svých částech, dále řada hub (včetně hub žijících v půdě), a některé mikroorganismy. Zvláště velký výdej etylénu bývá zjišťován u dozrávajících plodů, u velmi mladých i u stárnoucích listů, a při působení různých stresových faktorů. Také poraněné rostlinné orgány zvyšují mnohonásobně produkci etylénu již v průběhu několika desítek minut. Syntéza etylénu v rostlinách se odvozuje z cyklických přeměn aminokyseliny methioninu až na zvláštní kyselinu 1-amino-cyklopropan-1-karboxylovou (ACC) za spotřeby energie jedné molekuly ATP. Ke konečné tvorbě etylénu z ACC je nutný i kyslík. Transport etylénu v rostlině probíhá nejčastěji prostou difuzí v intercelulárách. Cévními svazky po celé rostlině je rozváděna pouze ACC, která se také může hromadit ve vakuolách. Rychlost tvorby ACC (katalyzovaná enzymem ACC-syntázou) je hlavní reakcí, na které závisí konečné množství uvolňovaného etylénu. Velmi často bývá pozorován autokatalytický efekt - vyšší koncentrace etylénu dále zvyšuje rychlost jeho tvorby. Schéma syntézy etylénu (5-metylthioadenosin je regenerován zpět na metionin). Jak již bylo uvedeno, k syntéze etylénu je nutný kyslík, a proto u orgánů v hypoxických podmínkách (např. u kořenů v zaplavených či udusaných půdách) se nutně musí její rychlost snižovat. Přesto právě za těchto podmínek ale může dojít paradoxně k nahromadění etylenu v intercelulárách, neboť je velmi omezena možnost jeho difuze do vnějšího prostředí. V listech je syntéza etylénu inhibována světlem. Fyziologické účinky etylénu jsou velmi rozmanité a někdy i poněkud protichůdné. Nejčastěji bývá pod jeho vlivem pozorováno zpomalení dlouživého růstu stonků i kořenů a současně jejich tloustnutí. Průvodním znakem těchto změn je jiná orientace mikrofibril celulózy v buněčných stěnách. Reakce buněk v některých orgánech však může být nestejná to pak vede k obloukovitému zakřivení rostoucího orgánu (např. řapíku listů - epinastie). Někdy také dochází působením etylénu ke ztrátě gravitropismu. Známé jsou však i některé RŮST A VÝVOJ 19 kladné účinky etylénu na růstové procesy - zrychluje dlouživý růst některých vodních rostlin, vyvolává tvorbu adventivních kořenů a kořenových vlásků, tvorbu odlučovací vrstvičky buněk v řapících listů, a také může stimulovat klíčení semen. Četné jsou i účinky etylénu na jiné procesy, než je pouze růst a morfogeneze. K nejvýznamnějším patří stimulace procesů souvisejících se zrychlením zráním plodů. Nejčastěji k tomu dochází díky významnému zvýšení aktivity enzymů hydrolyzujících polysacharidy (celuláza, pektinázy). Často velmi zrychlená tvorba těchto enzymů pod vlivem etylénu bývá pozorována nejen v plodech, ale i v jiných orgánech, a vede k velmi závažným následkům (např. lýtické zvětšování intercelulár v kořenech, opad listů, plodů a květů, atd.). Podobně jako kyselina abscisová zrychluje stárnutí všech orgánů, což vede např. k rychlejšímu vadnutí květů a k rozkladu chlorofylu a rozpustných proteinů v listech. Na druhé straně může ale spouštět některé obranné reakce při působení stresových faktorů, a to včetně tvorby specifických lýtických enzymů k zabránění průniku hyf patogenních hub. Etylén může působit již ve velmi nepatrné koncentraci (asi l cm3 .m-3 ) a jeho tvorba může být někdy až překvapivě velká (např. ve zralém jablku dosahuje koncentrace etylénu často více než 2000 cm3 .m-3 !). Bezkontaktní vzájemné ovlivňování rostlin pomocí etylénu je tedy docela dobře možné. Zvláště výrazné může být toto působení v prostředí s omezenou výměnou vzduchu, např. v půdě. Zde může docházet nejen k vzájemnému ovlivňování kořenů sousedních rostlin, ale také etylén produkovaný půdními mikroorganismy a houbami může ovlivňovat (převážně inhibovat) růst kořenů. Mechanismus působení etylénu je dnes již znám poměrně dobře. Buněčným receptorem etylénu je obdobně jako u recepce cytokininů transmembránový protein typu dvousložkové histidinové kinázy, ovšem s několika zvláštními znaky. Jednak bývá umístěn v membráně endoplazmického retikula, ale hlavně se jedná o dimer s centrálně navázaným kofaktorem obsahujícím měď. Další přenos signálu pokračuje přes několik postupně fosforylovaných proteinů až k aktivací celé řady transkripčních faktorů v jádře a k jimi modulované genové expresi. Byl také dokázán přímý vliv etylénu na funkci membrán, zejména na zvýšení jejich propustnosti pro ionty solí. Schéma možného působení etylénu na rozpad buněčné stěny při dozrávání plodů. Receptor etylénu bývá obvykle umístěn v membráně endoplazmického retikula. RŮST A VÝVOJ 20 Receptor etylénu v membráně endoplazmického retikula a začátek přenosu signálu. Praktické využití etylénu pro ovlivňování procesů v rostlinách souvisí v prvé řadě s regulací rychlosti dozrávání plodů. Pro urychlení zrání ovoce koncentraci etylénu ve skladových komorách zvyšujeme (zejména bývá využíváno u banánů, které se musejí sklízet a transportovat ve zcela nezralém stavu). Naopak, máme-li zájem na zpomalení zrání (při skladování jablek), pak etylén vytvářený ovocem musíme ze vzduchu odstraňovat (např. větráním či pohlcováním v roztoku manganistanu draselného). Tvorbu etylénu lze také zastavit v bezkyslíkatém prostředí (uložení ovoce v dusíkové atmosféře). Je nutno ale poznamenat, že dozrávání plodů některých rostlin (např. ze skupiny citrusů) není provázeno zvýšenou tvorbou etylénu, a tudíž se ani nedá uměle (uvedenými postupy) průběh jejich dozrávání ovlivnit. Některé účinky etylénu nedovedeme zatím vysvětlit, i když jsou prakticky využívány. Jedná se zejména o indukci kvetení u broméliovitých (ačkoli u jiných rostlin etylén obvykle kvetení inhibuje!), a o výrazné zvyšování podílu samičích květů u tykvovitých (ve společném působení s IAA). Brassinosteroidy Existence steroidních hormonů u rostlin byla dlouho zpochybňována a jejich přesná identifikace a zařazení do „elitní skupiny“ základních fytohormonů byla provedena teprve nedávno. Látky se steroidní strukturou se sice vyskytují v rostlinách zcela běžně (např. jako součást membrán), ovšem dokázat jejich významné a mnohostranné zapojení do přirozené (nikoli tedy uměle navozené) regulace růstových procesů nebylo vůbec snadné. První sloučenina tohoto typu, extrahovaná z pylu řepky (Brassica napus) v dostatečném množství pro stanovení chemické struktury, byla nazvána brassinolid (podle zdroje použitého pylu). O pylových extraktech bylo totiž již dříve známo, že stimulují růstové procesy. Další steroidní fytohormon (castasteron) byl izolován z hmyzích hálek na kaštanovníku (Castanea crenata), u kterých také byla hledána neznámá látka podporující jejich rychlý růst. Dnes již je známo více než 60 steroidních fytohormonů (souborně nazývaných jako brassinosteroidy). Byl dokázán jejich výskyt v různých orgánech všech druhů rostlin z více než 30 čeledí které byly dosud analyzovány, a to včetně evolučně starých skupin nahosemenných rostlin a kapraďorostů. Relativně největší koncentrace bývají nalézány v mladých orgánech, v pylu a v semenech, ovšem i tam se jedná o koncentrace extrémně nízké (řádově 10-12 až 10-9 M). RŮST A VÝVOJ 21 Syntéza brassinosteroidů je možná celou řadou biosyntetických drah, ovšem nejčastěji vychází z campesterolu či sitosterolu, což jsou nejhojnější steroly v membránách rostlinných buněk. Vždy se jedná o celý řetěz reakcí (redukce, hydroxylace, epimerace, oxidace) za účasti mnoha enzymů. Struktura nejúčinnější brassinosteroidní sloučeniny brassinolidu a jejího prekursoru campesterolu Fyziologické účinky brassinosteroidů jsou neobyčejně mnohostranné. Především se jedná o regulaci růstových procesů, obvykle v těsné synergické interakci s auxiny. Mají silný stimulační vliv na rychlost dělení i prodlužovacího růstu buněk, přičemž toto působení je spojeno jak s aktivací genové aktivity, tak i s přímou stimulací činnosti protonových pump, vedoucím ke zvýšení acidifikace (a tedy i roztažnosti) buněčné stěny. Obdobně jako auxiny jsou schopny působit na růst kořenů: v malé koncentraci stimulačně, ve větší inhibičně. Brassinosteroidy jsou zcela nezbytné pro růst pylových láček. Významná je i jejich úloha při diferenciaci vodivých pletiv, zejména stimulují tvorbu xylému (při nedostatku brassinosteroidů se více zmenšuje zastoupení xylému než floému). Další oblasti působení se týkají často pozorované stimulace klíčení semen a zvýšení odolnosti vůči stresům (mráz, nedostatek vody, zasolení, infekce) ovšem metodicky a interpretačně přesných prací v tomto směru je dosud velmi malý počet. Mechanismus působení brassinosteroidů (BR) je v současné době intenzivně zkoumán. Víme již, že k příjmu signálu dochází zachycením molekuly příslušného BR specifickým receptorem umístěným v plazmatické membráně. Jedná se o homodimer zvláštního typu serin/threoninové kinázy (BRI1)s velmi dlouhým extracelulárním řetězcem aminokyselin, na kterém jsou vazebná místa pro BR. Po navázání molekuly BR dojde na vnitrobuněčných úsecích téže kinázy k několikanásobné fosforylaci a následně pak ke komplikovanému přenosu signálu do jádra, tam pak k aktivaci transkripčních faktorů a tím i genové exprese. Brassinosteroidy jsou schopny aktivovat stovky genů v rostlinné buňce, z nichž část může být aktivována i auxiny, ovšem jejich koncentrace musí být podstatně vyšší (až 1000x). Schéma funkce brassinosteroidového receptoru v plazmatické membráně. Po zachycení dvou molekul brassinolidu (BL) dojde k fosforylaci na několika místech vnitrobuněčného úseku receptoru a následně k aktivaci dalších článků přenosového řetězce. RŮST A VÝVOJ 22 Schéma jednoho z možných mechanismů spolupůsobení brassinosteroidů a auxinů (v tomto případě zesilování účinku auxinů indukovanou tvorbou brassinosteroidů). Praktické využití brassinosteroidů (vyráběných synteticky) není zatím příliš rozšířené, ale v dosud provedených polních pokusech bylo dosaženo značně nadějných výsledků. Po postřiku porostů některých polních plodin vhodnou koncentrací BR došlo ke zvýšení jak celkové tvorby biomasy, tak i některých kvalitativních ukazatelů. Zvláště významné bylo zvýšení odolnosti ošetřených rostlin k nepříznivým vnějším podmínkám (mráz, sucho) a k napadení patogenními organismy. Metodické přístupy ke studiu fytohormonů Pokrok ve výzkumu fytohormonů je velmi těsně závislý jak na vhodně voleném koncepčním přístupu, tak i na aplikaci vhodných metod, a to převážně metod biofyzikálních, biochemických a molekulárně biologických. Tradiční, převážně observační přístup se dnes již používá velmi omezeně. Spočívá ve stanovení vztahu mezi reakcí rostliny a obsahem fytohormonů v příslušných orgánech, či reakce rostliny po umělé aplikaci fytohormonu na její jistou část. Naprostá většina výzkumných prací prováděných v současné době využívá rostliny geneticky pozměněné (mutanti, transgenní rostliny) se zvýšenou či sníženou tvorbou určitého fytohormonu, a nebo se zvýšenou tvorbou enzymů fytohormon rozkládajících. V naprosté většině pokusů vycházíme z předpokladu, že limitující je jen koncentrace fytohormonu, nikoli kapacita receptorového systému. Tento předpoklad ale nemusí být vždy správný. Další nepříjemnou komplikací pokusů bývá vzájemné ovlivňování několika současně přítomných fytohormonů, které lze stěží vyloučit. Některé fytohormony též mohou velmi rychle a vratně přecházet do méně aktivních či zcela inaktivních konjugovaných forem. Aktivní koncentrace fytohormonů v rostlinách bývají velmi nízké (nejčastěji v rozmezí od 10-12 až po10-6 M), a proto metody pro jejich stanovení musí být velmi citlivé a navíc dostatečně selektivní. Vlastní stanovení obvykle začíná extrakcí z čerstvého vzorku a převedením do bezvodých organických rozpouštědel. Pak následuje pracná separace a čištění (především chromatograficky). Ke konečné kvantitativní detekci vyčištěných vzorků se nabízí celá řada metod s velmi rozdílnou přesností. Fyzikálně-chemické metody zcela převládají - zejména vysokotlaká kapalinová chromatografie (HPLC) s různými typy detektorů, dále plynová chromatografie (GC), a to často ve spojení s hmotovou spektrometrií (GS-MS). Imunologické metody mají extrémní citlivost, nedostižnou jinými postupy. Jejich širšímu využití však brání obtížná příprava a tím i vysoká cena specifických protilátek (imunoglobuliny, které jsou produkované pouze živočišnými buňkami). Také nároky na čistotu extraktů jsou vysoké. Existuje řada modifikací imunologických metod s využitím radioizotopů či enzymů. Biotesty jsou z hlediska selektivity a kvantitativního stanovení fytohormonů naopak nejméně přesné, ale přesto se i dnes občas používají, a to zejména pro posouzení jejich RŮST A VÝVOJ 23 RŮST A VÝVOJ 24 relativní biologické účinnosti. Zejména se jedná o fytohormony vytvářející početné skupiny chemicky příbuzných sloučenin (např. gibereliny či cytokininy), které se mohou velmi podstatně lišit i za stejné koncentrace v mohutnosti svých účinků. Pro každou skupinu fytohormonů byly vypracovány standardní postupy na vhodných testovacích objektech (např. pro gibereliny rychlost růstu hypokotylu salátu). K biotestům se samozřejmě již nepoužívají hrubé extrakty z rostlinných orgánů, jak tomu bylo dříve, ale již separované a přesně definované sloučeniny. Vnější faktory regulující růst a vývoj Růst každé rostliny v přírodě je ovlivňován desítkami nejrůznějších vnějších fyzikálněchemických faktorů, které jsou navíc ve vzájemných interakcích. Zkoumat celý tento komplex je prakticky nemožné. Naštěstí významnost jednotlivých vnějších faktorů není stejná, a lze tedy přednostně studovat působení těch nejdůležitějších, ke kterým nepochybně patří záření a teplota. Fotorecepce, vlastnosti fytochromů a kryptochromů Záření je pro rostliny v prvé řadě zdrojem energie. V kapitolách věnovaných fotosyntéze jsme si již vysvětlili, jakým způsobem je fotosynteticky účinná část spektra rostlinou zachycena a využita. Vazba radiační energie do asimilátů je jistě základním předpokladem růstu, ale není to jediný způsob, jak záření může působit na růst. Záření je totiž pro rostliny nejen zdrojem energie, záření je i zdrojem důležitých informací o vlastnostech prostředí, ve kterém se nacházejí. Na základě těchto informací pak mohou usměrňovat růst, vývoj i pohyby jednotlivých svých částí takovým způsobem, aby bylo zajištěno přežití a reprodukce v daném typu prostředí. Informační význam nemá jen množství záření a směr ze kterého dopadá na rostlinu, ale i spektrální složení a periodicita (střídání světla a tmy v průběhu dne). Aby rostlina vůbec mohla využít informace přenášené zářením, je nutná jeho absorpce, dále pak převod a zesílení přijatého signálu. Jako fotoreceptory slouží specializované barevné sloučeniny (pigmenty). Některé z nich pohlcují jen dlouhovlnné červené záření, jiné zase mají maximum absorpce v krátkovlnné oblasti (modrá a fialová část spektra). Fytochromy jsou.nejdůležitější a také nejlépe prozkoumanou skupinou fotoreceptorů. Jsou to proteiny (obvykle homodimery) volně pohyblivé v cytosolu , které mají kovalentně (přes sirný můstek) připojen tetrapyrolový lineární řetězec (fytochromobilin). V důsledku přítomnosti této chromofórové skupiny mají charakter barviva (pigmentu) s velmi účinnou absorpcí některých složek světla. V každé rostlině se obvykle může vytvářet (v závislosti na podmínkách prostředí a ontogenetickém stádiu) několik různých fytochromů které mají rozdílné proteinové nosiče (apoproteiny), zatímco chromofór je u všech stejný. U dosud zkoumaných dvouděložných druhů bývá fytochromů nejčastěji pět (označovaných písmeny A, B, C, D, E), u jednoděložných byly zjištěny jen tři (A, B, C). Apoprotein u fytochromu A (který je v hojné míře syntetizován u rostlin za nedostatku záření či v úplné tmě) je značně specifický a bývá označován jako typ I. Strukturně-funkční vlastnosti apoproteinů ostatních fytochromů syntetizovaných u rostlin až po jisté době osvětlení (označované souhrnně jako proteiny typu II) jsou si značně podobné, i když v rostlinách plní i některé specifické funkce. Fytochromobilin je syntetizován v plastidech (dosti podobnou biochemickou cestou, jaká je využívaná pro syntézu chlorofylu), pak je exportován do cytosolu, kde dojde k jeho autokatalytickému napojení na příslušný apoprotein. Každý z uvedených fytochromů může vytvářet dvě snadno vratné formy. Základní forma všech typů fytochromů má světle modrou barvu a maximum absorpce ve spektrální oblasti jasně červeného záření (660 nm). Označuje se zkratkou Pr, (Phytochrome - red). V této formě jsou fytochromy rostlinami syntetizovány. Po ozáření světlem obsahujícím jasně červenou složku dojde v chromofóru k izomerační změně a barva fytochromu se změní na olivově zelenou s maximem absorbce v tmavě červené oblasti (730 nm). Tuto druhou formu, označovanou jako Pfr (Phytochrome - far red) lze převést zpět na základní formu ozářením tmavě červeným světlem Chromofor molekuly fytochromu a absorbční spektra obou reverzibilních forem, Pr a Pfr. Mezi oběma formami fytochromů jsou zcela zásadní rozdíly ve fyziologických účincích. Procesy v rostlinách jsou aktivovány jen formou Pfr. Rozdíly v účinnosti obou forem jsou dány změnami ve struktuře základního proteinu (ne v chromoforu), který funguje jako autokatalyzující proteinkináza (blíže bude popsáno v dalším textu). K transformaci jisté části Pr na P fr u vysoce citlivého fytochromu A postačuje velmi nepatrné množství záření s obsahem červené složky (asi 200 J m-2 , což je méně než 1 % přijaté energie z plného slunečního záření za dobu jedné minuty). Tato transformace však není úplná ani při delším ozáření jen jasně červeným světlem, což ostatně vyplývá z překryvu absopčních křivek obou forem fytochromů. V rostlinách vystavených světlu se proto vyskytují obě formy fytochromů, ovšem jejich poměr se může měnit v závislosti na aktuálním spektrálním složení dopadajícího záření. Forma Pfr je však velmi málo stabilní a proto i bez ozáření tmavě červeným světlem se u zatemněných rostlin samovolně vrací na Pr a částečně se také rozkládá. Je důležité si uvědomit, že fytochromy mohou rostlinám zprostředkovat informace o několika odlišných vlastnostech vnějšího prostředí, a sice: (a) zda se rostlina nachází ve tmě či na světle: v tomto případě může postačovat jako spouštěcí signál pouze přítomnost i velmi malého množství aktivní formy fytochromů, které se vytvoří i při velmi slabém osvětlení (přesněji malou dávkou záření) bez ohledu na jeho spektrální složení. Mezi nejcitlivější reakce na přítomnost záření patří inhibice růstu stonku (u semenáčků hypokotylu či mezokotylu) při rušení etiolace (nadměrného „vytahování“ zatemněných rostlin, pokud se např. při klíčení v půdě dostane výhonek nad její povrch). Reakci vyvolá již přeměna 0,02% zásoby fytochromů na aktivní formu. (b) jaké je spektrální složení světla v daném prostředí, zejména jaký je poměr mezi RŮST A VÝVOJ 25 zastoupení jasně červené a tmavě červené složky (R/FR). Tento poměr indikuje zejména stupeň zastínění daného místa jinými rostlinami (či hustotu porostu). Záření vlivem selektivní absorpce kratších vlnových délek (400-700 nm) asimilačními barvivy má pod hustšími porosty výrazný nadbytek tmavě červené složky (R/FR ≅ 0,2), zatímco na nezastíněných místech bývá R/FR ≅ 1. Změny spektrálního složení světla ovlivňují poměr mezi množstvím aktivní a neaktivní formy fytochromů v rostlinách, a právě tento poměr může mít zásadní význam pro řízení celé řady fyziologických procesů zahrnujících klíčení semen, aktivaci celé řady metabolicky významných enzymů, a především morfogenetické procesy (zakládání nových odnoží a listů, řízení tvaru a velikosti listů a stonků, aj.). Rostliny tolerující zastínění (sciofyta) mají mnohem slabší reakce na pokles poměru R/FR, než rostliny světlomilné (heliofyta). (c) jaká je délka dne či noci (tedy délka světlé a tmavé periody v rámci denního cyklu), což je důležité pro řízení fotoperiodicky závislých procesů v rostlinách. Tato funkce fytochromů je propojena s vnitřní časomírou a bude podrobněji popsána v další kapitole. Mechanismus působení fytochromů na fyziologické procesy je již vcelku uspokojivě prozkoumán. Přeměna neaktivní formy (Pr) do aktivní formy (Pfr) fytochromu je provázena autokatalytickou fosforylací (přenosem fosfátového iontu z ATP na vlastní molekulu, ze které pak může být přenášena na jiné proteiny a tím aktivovat jejich funkce). Fytochromy jsou tedy zářením regulované proteinkinázy (serin/threoninového typu), u kterých při fosforylaci dojde současně i k jistým koformačním změnám, usnadňujícím jejich transport do jádra a následnou aktivaci transkripčních faktorů a tím i genové exprese. Je ale známo, že fytochromovou signální cestou mohou být aktivovány i represory některých genů. I když většina aktivované formy fytochromů přechází do jádra, přesto jistá část zůstává v cytosolu (v těsné blízkosti membrán), kde může působit jako aktivátor některých rychlých procesů nezávislých na expresi genů. Zejména se jedná o aktivace metabolicky významných enzymů a transportních proteinů v membránách, včetně protonových pump. Tím může dojít ke zprostředkování např. světlem řízených změn v dlouživém růstu, které jsou měřitelné již v průběhu několika minut. Schématické znázornění funkce fytochromu jako autofosforylující proteinkinázy řízené světlem Jak již bylo zmíněno na začátku této kapitolky, v každé rostlině je syntetizováno několik druhů fytochromů (s odlišným apoproteinem), a jejichž zastoupení je různé v jednotlivých orgánech, a také se mění v průběhu ontogeneze. Každý z nich má v rostlinách poněkud odlišnou funkci (danou odlišností v biochemické reaktivitě), a proto popis mechanismu regulace určitého konkrétního procesu v rostlinách platí jen pro příslušný typ fytochromu, RŮST A VÝVOJ 26 který je do něho zapojen. Detailní popis jednotlivých regulačních cest a regulovaných procesů je již mimo rozsah tohoto učebního textu – vždyť jen u modelové rostliny Arabidopsis thalliana je již známo několik tisíc genů, jejichž exprese je regulovaná zářením se zapojením fytochromové signální cesty. Náš výklad proto bude omezen jen na několik nejdůležitějších funkčních rozdílů. Fytochrom A zprostředkovává hlavně reakce za velmi nízkých dávek záření (VLFR = very low fluence response, viz rámeček), zatímco fytochrom B je hlavním mediátorem reakcí typu LFR a HIR. Ostatní fytochromy (C, D, E) mají většinou jen přídavnou, orgánově specifickou funkci (např. prodlužování řapíků listů, stonkových internodií), ale jsou také potřebné i pro fotoperiodické řízení tvorby květů. Naše znalosti o jejich funkcích však ještě zdaleka nejsou uspokojivé, protože se s jejich výzkumem začalo relativně nedávno. Po dlouhou dobu bylo záhadou, proč reakce typu VLFR probíhají i při působení tmavě červeného světla (730 nm). K vysvětlení tohoto paradoxního jevu je nutné si uvědomit, že konverze forem fytochromů není v žádné spektrální oblasti úplná. Při ozáření tmavě červeným světlem se sice přemění 97% z celkového obsahu fytochromů do fyziologicky neaktivní formy, ale zbývající 3% zůstávají v aktivní formě (Pfr). Přitom pro aktivaci reakcí VLFR stačí již velmi nepatrné množství formy Pfr (0,02%) z celkového množství fytochromů. Receptory modrého záření Kromě fytochromů je ve všech rostlinách přítomna ještě jiná skupina fotoreceptorů aktivovaná pouze krátkovlnným zářením. Jak bylo dokázáno přesným měřením akčních spekter, tento typ fotoreceptorů je citlivý nejen na modré a fialové světlo, ale i na část ultrafialového záření (UV-A), v celkovém rozmezí vlnových délek asi od 320 do 500 nm. Izolace a identifikace těchto pigmentů byla (a stále je) obtížná, i když k nejvážnější kandidátům již delší dobu patřily flavoproteiny a karotenoidy. V současné době známe tři odlišné typy receptorů modrého záření: kryptochromy, fototropiny a zeaxanthin. Kryptochromy jsou proteinové pigmenty blízce příbuzné fotolyázám, což jsou enzymy opravující poškození DNA po působení UV záření. Na bílkovinný nosič je navázána jednak molekula FAD (flavin adenin dinukleotid), ale také pterin. Kryptochromy v rostlinách nejčastěji zprostředkují inhibici růstu stonku a hypokotylu po ozáření světlem s obsahem modré barvy. Fototropiny jsou zapojeny, jak již název napovídá, především do regulace fototropických reakcí (zakřivování částí rostlin vyvolané jednostranným ozářením, bude podrobněji popsáno RŮST A VÝVOJ 27 RŮST A VÝVOJ 28 v další kapitole). Podílí se ovšem i na některých dalších reakcích, zejména na celkové inhibici růstu stonku (ve spolupůsobení s kryptochromy) a na světlem aktivovaných vnitrobuněčných přesunech chloroplastů při náhlých změnách ozářenosti listů (slouží k omezení možné destrukce fotosyntetického aparátu nadbytečnou absorpcí záření). Fototropiny mají charakter autofosforylujících proteinkináz typu serin/threonin, ve kterých na nosný protein jsou navázány dva komplexy FAM (flavin adenin mononukleotid). Zeaxanthin je karotenoid, který hraje hlavní roli při světlem řízené otvírací reakci průduchů. Zeaxanthin vzniká snadnou přeměnou z violaxanthinu v thylakoidních membránách chloroplastů. V mezofylových buňkách dochází k jeho tvorbě až při vysoké ozářenosti listů a jeho funkcí je chránit fotosyntetický aparát před destrukcí nadbytkem excitační energie. Ve svěracích buňkách ale dochází k jeho tvorbě již při velmi malé ozářenosti (ráno za svítání), a jeho množství v průběhu dne stoupá či klesá paralelně se změnami záření. Na aktuální koncentraci zeaxanthinu v chloroplastech svěracích buněk závisí intenzita signálu, který je přenášen z chloroplastu k plazmatické membráně, kde jsou jím aktivovány protonové pumpy (H+ -ATPázy). Následná změna transmembránového potenciálu vede ke vstupu draslíkových iontů a vody do svěracích buněk a k jejich rozevření zvýšeným turgorem. Vliv záření na klíčení, růst a morfogenezi - ekologické aspekty Světlo jako zdroj informace o vnějším prostředí ovlivňuje růst rostlin už od klíčení semen. Z přibližně jednoho tisíce dosud zkoumaných druhů bylo zhruba u dvou třetin zjištěno, že jejich semena jsou lépe klíčivá na světle než ve tmě. U semen zbývající třetiny buď nebyla zjištěna žádná závislost nebo byla naopak klíčivost světlem inhibována. Pokusme se nyní vysvětlit, jaké mohou být příčiny těchto jevů. Jestliže zdravé semeno neklíčí, ačkoli vnější podmínky jsou pro klíčení příznivé, nachází se ve stavu dormance (někdy ovšem termín dormance bývá používán pro jakýkoliv klidový stav, tedy i pro případ suchých semen). Živá semena, která ani za dostatku vody, příznivé teploty a kyslíku, ale bez přístupu světla neklíčí, označujeme jako fotodormantní. Již v klasických pokusech s fotodormantními semeny salátu, které vedly k objevu fytochromů, byl zjištěn rozhodující vliv červeného světla na jejich klíčení. Jak již dnes víme, přítomnost jistého množství aktivní formy fytochromů (Pfr), vytvořené z inaktivní formy (Pr) působením světla s významným podílem jasně červené složky, významně podporuje klíčení. V suchých semenech může být jisté množství aktivní formy fytochromů uloženo, někdy (zejména u drobných semen) ale nikoliv. Tyto rozdíly jsou závislé hlavně na podmínkách, za kterých semena dozrávají. Pokud při dozrávání převažuje tmavě červená složka světla nad červenou (což je vždy, když světlo proniká k dozrávajícím semenům strukturami obsahujícími chlorofyl), pak po dozrání tato semena obsahují převážně jen neaktivní Pr a v důsledku toho jsou fotodormantní. Pokud jsou však při dozrávání příznivé podmínky pro tvorbu Pfr, pak bývá i větší množství této aktivní formy fytochromů v semenech uchováno. Taková semena pak mohou být po ovlhčení klíčivá i ve tmě (nejsou fotodormantní). Avšak i u těchto semen může dojít k inhibici klíčení z jiných důvodů. Spektrální složení světla bývá na různých stanovištích v přírodě velmi odlišné. Jak bylo již zmíněno, pod korunami lesních stromů, stejně tak i pod hustým listovým zápojem jiných porostů (louky, polní plodiny) je však až pětkrát více tmavě červeného světla (o vlnové délce 700 až 750 nm) než světla jasně červené barvy, což vede ke snížení obsahu aktivní formy fytochromů a tudíž to může vést i k inhibici klíčení těch semen, která leží na povrchu půdy. Je však nutno poznamenat, že citlivost k tomuto inhibičnímu působení je u různých druhů odlišná - u světlomilných rostlin je podstatně větší než u druhů snášejících stín. Při hlubším studiu fotodormance nás nemůže uspokojit pouhé zjištění, že přítomnost aktivní formy fytochromů (Pfr) je pro klíčení nutná, ale ptáme se, proč je vlastně nutná, tedy RŮST A VÝVOJ 29 jakým mechanismem ovlivňuje procesy spojené s klíčením semen. Pro kauzální analýzu je důležitý poznatek, že největší účinek má záření zachycené embryem (v oblasti hypokotylu a radikuly), nikoliv dělohami. Naše současná představa je taková, že klíčovou funkci má aktivní forma fytochromů obsažená v buňkách, které vstupují do fáze dlouživého růstu. Působí stimulačně především na transportní proteiny v membránách. Tím dojde ke vzestupu osmotického tlaku buněk, což je předpokladem zvýšení jejich turgoru, na kterém dlouživý růst závisí. Pokud je turgorový tlak nízký, semeno neklíčí. Stejně tak dobře může být důležitá i aktivace některých enzymů v cytosolu, a to fytochromy zprostředkovanou fosforylací. Nelze zatím spolehlivě odpovědět na otázku, jak fytochromy při rušení fotodormance ovlivňují koncentraci a účinek fytohormonů. Jako velmi pravděpodobné se ukazuje ovlivnění tvorby giberelinů a cytokininů, o nichž je známo, že při aplikaci na dormantní semena mohou nahradit účinek Pfr. Také je možné uvažovat o vlivu aktivní formy fytochromů na odbourávání inhibitorů klíčení, především kyseliny abscisové. Účinky světla na procesy spojené s tvorbou jednotlivých orgánů (morfogenezi) jsou výrazné u mladých rostlin hned po vyklíčení. U trav je světlem zastavován růst mezokotylu i koleoptile, a současně je stimulováno rozvinutí stočených listů. Tyto procesy jsou řízeny fytochromovým systémem - lze je navodit již velmi slabým červeným světlem. V tomto případě je zřejmě fytochromy stimulována tvorba giberelinů, či alespoň zvýšena citlivost některých buněk na jejich působení. Aplikací giberelinů totiž dosáhneme stejného efektu jako působením červeného světla. U klíčních rostlinek dvouděložných druhů je jednou z prvních nápadných reakcí na světlo narovnání ohybu hypokotylu (i epikotylu). Tento ohyb je pravděpodobně vyvoláván působením etylénu, jehož syntéza je na světle zastavena. Působením světla se dále zrychluje růst plochy listů i délka řapíku. Velmi rychle, často během několika hodin, dochází k tvorbě chlorofylu a plně funkčních chloroplastů z proplastidů, tedy včetně řádně fungujících thylakoidních membrán a enzymů nutných pro zabezpečení asimilačních procesů. Nejen u semenáčků, ale i u dospělých rostoucích rostlin je světlem zpomalována rychlost růstu stonku a jiných nadzemních částí (např.listů trav). Na této inhibici se významně podílí oba systémy fotoreceptorů (fytochrom i kryptochrom). Modré světlo mívá často rychlejší a výraznější účinek. Fotoperiodicky řízené procesy růstu a vývoje V těch oblastech naší planety, kde dochází k velkým a pravidelně se opakujícím změnám klimatických faktorů (což je kromě tropických oblastí téměř všude), je pro rostliny velice důležité, aby průběh jejich fyziologických funkcí byl synchronizován s ročními klimatickými cykly. Nestačí pouhé přizpůsobování se okamžitému stavu vnějších faktorů. Mnohé procesy v rostlinách potřebují ke zdárnému dokončení dosti dlouhou dobu (např. tvorba květů a dozrání semen), u některých je dokonce naprosto nezbytné, aby započaly ještě před vlastním působením kritického faktoru (např. zvýšení odolnosti vůči mrazu). Proto je pro rostliny tolik potřebná informace, v jakém ročním období se nacházejí. I v tomto případě hraje hlavní úlohu záření a jeho příjem fytochromovým systémem. Nejspolehlivějším ukazatelem fáze ročního cyklu je pro rostliny rostoucí v téže zeměpisné šířce délka světelné části dne (fotoperiody) a její postupné změny (zkracování, prodlužování). Všechny reakce rostlin, které jsou závislé na jisté délce fotoperiody, nazýváme reakce fotoperiodické. Daleko nejpodrobněji byly tyto reakce zkoumány v souvislosti s tvorbou květů, ale velký význam má délka fotoperiody i na klíčení, rychlost růstu, tvorbu odnoží, translokaci asimilátů a mnohé další procesy. Popis fotoperiodických závislostí v obecné rovině je mimořádně obtížný, neboť v nich panuje obrovská mezidruhová variabilita. Není divu, vždyť jednotlivé rostlinné druhy, a to i ty, které dnes rostou v přírodě pohromadě, často mají svůj původ v oblastech s odlišným RŮST A VÝVOJ 30 radiačním režimem (daným zeměpisnou šířkou). Navíc, vzhledem k rozdílné rychlosti růstových a vývojových procesů, může mít pro ně informace o délce dne nestejnou důležitost. Co je však zvláště závažné, to je rozdílná spojitost mezi délkou dne a klimatickou příznivostí pro růst rostlin v různých oblastech naší planety. Tak např. zkracování délky dne je pro rostliny v našem klimatickém pásmu významnou informací o nástupu teplotně nepříznivého období (zimy), ale pro rostliny rostoucí v oblastech s mediteránním typem klimatu je to naopak informace o nástupu období příznivého pro růst, neboť po letním suchu bude konečně dostatek srážek. Podívejme se nejprve na některé fotoperiodické závislosti kvetení. Jen málo druhů zakládá květy zcela bez jakékoliv vazby na délku fotoperiody (fotoperiodicky neutrální rostliny, z běžně pěstovaných druhů např. rajče, okurka či fazol). Častěji se setkáváme s nároky na jistou délku dne (fotoperiody), a podle toho rozdělujeme rostliny na dlouhodenní a krátkodenní. U rostlin absolutně (či obligátně) dlouhodenních (např. ředkvička či špenát) dochází k tvorbě květů výhradně až po překročení určité minimální délky dne. Tato kritická délka dne je specifická pro různé druhy, ale obvykle bývá delší než 12 hodin. U fakultativně dlouhodenních rostlin se s prodlužováním délky dne pouze zvyšuje pravděpodobnost tvorby květů, avšak jisté procento jedinců vykvétá i za krátkého dne. Dlouhá fotoperioda naopak inhibuje tvorbu květů u krátkodenních rostlin (např. některé druhy chryzantém, merlík bílý). Také zde se setkáváme s rostlinami absolutně a fakultativně krátkodenními. Nověji byly vyčleněny ještě další kategorie, jako např. rostliny dlouhokrátkodenní, které vytvářejí květy sice za krátkého dne, ale pouze tehdy, jestliže předcházelo období s dlouhými dny, (tedy jen na podzim a nikoli na jaře, i když aktuální délka dne může být v obou ročních dobách shodná.). K takovým rostlinám patří např. Bryophyllum crenatum. Je potřeba ještě upozornit, že i různé odrůdy téhož druhu se mohou značně lišit ve svých nárocích na délku dne, některé mohou být krátkodenní a jiné dlouhodenní. Také teplota v průběhu kultivace může značně měnit fotoperiodickou závislost! I v rámci téže kategorie fotoperiodické závislosti jsou velké mezidruhové rozdíly v počtu dní, který je nutný k navození reakce - v extrémním případě může být kvetení iniciováno jediným denním cyklem (např. u několika druhů trav, merlíků, okřehků aj.), většinou je však zapotřebí cyklů několik. Při fenomenologickém výzkumu fotoperiodismu bylo provedeno obrovské množství pokusů, ve kterých se zejména využívalo rostlin s kvetením absolutně závislým na fotoperiodě a navíc s jednodenní indukční dobou, jako např. merlík červený (Chenopodium rubrum), nebo řepeň durkoman, (Xanthium strumarium). Bylo dokázáno, že pro krátkodenní rostliny, ke kterým patří právě merlík a řepeň, není důležitá délka světelné části dne, ale musí být přesně dodržena dostatečná délka noci. Ta navíc nesmí být přerušena ani krátkým osvětlením světlem které obsahuje červenou část spektra (tedy např. běžným denním či umělým světlem bez selektivních filtrů). Pokud by ovšem následoval osvit tmavě červeným světlem, indukce kvetení by proběhla normálně. Účast fytochromů v řízení fotoperiodických reakcí byla dokázána i v jiných typech pokusů. Jak se dalo očekávat, přerušení "dne" krátkým zatemněním bylo téměř vždy bez účinku (krátké zatemnění nemá vliv na změnu forem fytochromů). Zato krátký osvit v průběhu noci působil i na dlouhodenní rostliny - ovšem opačně než na krátkodenní - vedl k indukci kvetení. Pro vysvětlení mechanismu fotoperiodické stimulace či inhibice zakládání květů bychom v prvé řadě potřebovali znát jakým způsobem vlastně rostlina "měří" délku dne či noci. Jednou z možností se zdála být postupná autoreverze Pfr na Pr, ke které dochází ve tmě. K indukci fotoperiodické reakce by pak mohlo být důležité dosažení jistého poměru mezi Pfr a Pr či úplná absence formy Pfr . Jak již víme, narušení tmavé periody světlem, při kterém se rychle mění poměr mezi Pfr a Pr , má pro fotoperiodickou reakci vždy vážné následky. Iniciace kvetení (+) u krátkodenních a dlouhodenních rostlin za různého světeného režimu. Podrobnější analýza výrazných vnitřních výkyvů v citlivosti k fotoperiodické indukci (např. při uměle prodlužované temné periodě či při narušování temné periody krátkým osvětlením v různou dobu od začátku zatemnění) ukázala, uvedený řídící systém typu "přesýpacích hodin", navíc spoléhající pouze na poměrně jednoduchou reakci, nemůže uspokojivě vysvětlit řízení všech fotoperiodicky závislých dějů. Účast fytochromového systému je zajisté nezpochybnitelná, ovšem jeho k jeho řídící funkci bude ve většině případů fotoperiodicity nutná spolupráce s vnitřní časomírou oscilátorového typu ("biologické hodiny", blíže v další kapitole). Rouškou tajemství byl dlouho také zahalen způsob tvorby a přenosu signálu pro kvetení uvnitř rostliny. Bylo bezpečně prokázáno, že fotoperiodická indukce tvorby květních základů neprobíhá přímo v apikálním meristému. Délku dne (respektive noci) detekují listy a informace musí být do meristému nějakým způsobem přenesena. Skutečnost, že jde o látkový přenos, bylo možné dokázat např. roubováním neindukovaného vrcholu na indukovanou rostlinu, či stanovením doby nutné k přenosu indukčního signálu (řádově hodiny). Spekulovalo se o existenci zvláštní látky (pracovně označované jako "florigen"), avšak úsilí o jeho izolaci dlouho nebylo korunováno úspěchem. To pak vedlo k názoru, že na indukci květů se asi podílí současně více látek (fytohormonů i jiných metabolitů) ve vzájemné interakci. Soustředěným úsilím několika vědeckých kolektivů a s použitím moderních metod molekulární biologie se ale v nedávné době konečně podařilo mnohé z uvedených záhad vyřešit. Bylo dokázáno, že skutečně specifická sloučenina indukující tvorbu květů ("florigen") existuje, má bílkovinnou povahu, a je u dlouhodenních rostlin jiná než u krátkodenních. Proces fotoperiodické indukce kvetení začíná skutečně v listech, a sice rytmickými změnami obsahu specifických proteinů, jejichž tvorba je převážně řízena vnitřní časomírou. U dlouhodenních rostlin (např. Arabidopsis thalliana) se jedná o protein označovaný zkratkou svého kódujícího genu CO (CONSTANS). Jeho tvorba se začíná zvyšovat až ve druhé polovině diurnálního (24h) cyklu, a s nástupem noci dochází k jeho rozkladu (což je řízeno fytochromy). Pokud k nástupu noci dochází později (za dlouhé fotoperiody), dochází k mnohem většímu nahromadění proteinu CO než za krátkého dne. Protein CO stimuluje aktivitu genu FT (FOWERING LOCUS T), a tím i tvorbu příslušného proteinu (FT protein), který je z listů transportován lýkem do apikálního meristému prýtu a je schopen (je-li ho dostatečné množství, tedy za dlouhého dne, a také až po spojení s regulačním proteinem FD který se tvoří v apikálním meristému) indukovat procesy vedoucí k tvorbě základů květů. Plní tedy úlohu toho dlouho hledaného mobilního přenašeče signálu mezi listy a apexem. U krátkodenních rostlin (modelovou rostlinou bývá rýže) je situace poněkud odlišná. V listech se také s pravidelnou denní rytmicitou vytváří specifický protein (označovaný RŮST A VÝVOJ 31 zkratkou Hd1, jehož nahromadění je také větší za delší fotoperiody, jenže (na rozdíl od analogického proteinu CO u dlouhodenních rostlin), je tento protein inhibitorem exprese funkčně navazujícího genu (Hd3a). Čím kratší je tedy fotoperioda, tím méně se vytváří inhibitoru Hd1, a tím více je syntetizováno proteinu HD3a, který u krátkodenních rostlin plní úlohu mobilního přenašeče signálu pro tvorbu květů z listů do apikálního meristému. Schématické znázornění tvorby a přenosu fotoperiodického signálu z listů do apikálního meristému prýtu. Bližší popis je uveden v textu. Iniciace tvorby základů květů v apikálním meristému není ovšem proces jednoduše závislý jen na dostatečném přísunu mobilních proteinů (FT či Hd3a) z listů. Jak je patrno z následujícího obrázku, tyto proteiny nejsou jedinými možnými iniciátory květotvorného procesu. Je také zřejmé, že květotvorný signál přenášený z listů může aktivovat květotvorbu jen se spoluúčastí regulačních proteinů tvořených přímo v meristému. FT protein po transportu z listů se v apikálním meristému spojuje s proteinem FD a vytváří tak regulační komplex FD/FT, který je schopen aktivovat květotvorný gen LFY, ovšem nepřímo, a to buď cestou přes aktivaci genu API, či přes aktivaci genu SOC1. Druhá cesta je využívána i při působení jiných faktorů, schopných za jistých okolností indukovat tvorbu květů, zejména vnější vernalizační signál (při působení nízkých teplot) a vnitřní (autonomní) signál, vznikající při dostatečném počtu listů. Oba tyto signály působí inhibičně na expresi genu FLC, jehož produkt je inhibitorem genu SOC1. Gibereliny a vyšší obsah sacharózy jsou schopny indukovat kvetení přímou aktivací genu SOC1. RŮST A VÝVOJ 32 RŮST A VÝVOJ 33 Délka fotoperiody ovlivňuje kromě kvetení i celou řadu dalších procesů, zejména rychlost růstu. Mnoho druhů bylin i dřevin z temperátní zóny má zpomalený růst za krátkých dní (a to i když úhrnné množství záření a jeho spektrální složení udržujeme v pokusech na stejné výši jako za dlouhých dní!). Obvykle je toto zpomalení růstu v těsné souvislosti se zvýšením odolnosti vůči mrazu. Také u jiných druhů rostoucích u nás a v severněji položených oblastech můžeme pod vlivem krátkých dní pozorovat změny v aktivitě fytohormonů vedoucí k indukci celého komplexu reakcí, označovaného jako "podzimní syndrom" (např. zastavení tvorby chlorofylu, rychlé stárnutí a opadávání listů, dormance pupenů, atd.). Velmi časté je však spolupůsobení nízké teploty, na které se nyní podíváme trochu podrobněji. Vliv teploty na růst a vývoj Růst naprosté většiny rostlin probíhá jen v poměrně úzkém teplotním rozmezí zhruba od 5 do 40 °C. Negativní účinek nízkých teplot (mrazu a chladu) a příliš vysokých teplot souvisí především s teplotní závislostí biochemických reakcí, s poruchami funkce membrán a s inaktivací enzymů. Jde tedy o stresové účinky, které budou souhrnně popsány ve 4. části těchto učebních textů. Působení nízkých teplot však také může mít příznivý vliv na průběh růstu a vývoje. U mnoha druhů rostlin z oblastí s výrazným ročním kolísáním teplot jsou nízké teploty v určité vývojové fázi přímo existenčně nutné, neboť na nich závisí tvorba květů, zrušení dormance semen a pupenů, vývoj hlíz, cibulí a některé morfogenetické procesy. Ve všech případech jde o takové působení, jehož účinek není pozorovatelný ihned, ale až s jistým zpožděním. Vernalizace patří k nejlépe známým pozitivním účinkům nízkých teplot. Označujeme tak proces, kdy pupeny některých druhů rostlin jen pod vlivem zchlazení jsou schopny přejít do fertilního stádia, tedy vytvořit květní orgány. Vernalizace se vztahuje dokonce i na semena řady druhů, která pouze při uložení za nízkých teplot (ve zvlhčeném stavu) jsou schopny po vyklíčení dát vznik fertilním rostlinám. Požadavky různých druhů na nízké teploty se však značně liší. Velmi vyhraněné nároky mají zejména jednoleté druhy, a také rostliny dvouleté. Pro přechod do reprodukční fáze dvouletek jsou nízké zimní teploty absolutně nutné, zatímco závislost jednoletek je obvykle jen kvantitativní (fakultativní). Nízké teploty u nich zvyšují pravděpodobnost kvetení a hlavně urychlují jeho začátek. U mnoha vytrvalých rostlin je iniciace kvetení vázána na nízkou teplotu a současně na krátkou fotoperiodu. Velké množství pokusů bylo zaměřeno na zjištění optimální teploty pro vernalizační procesy a nezbytnou dobu trvání těchto teplot. Byla zjištěna obrovská variabilita mezi druhy, avšak nejčastější hodnoty účinné teploty leží v rozmezí 0 až 10°C. Minimální doba působení těchto teplot kolísá od 4 do 8 týdnů, saturační doba pak od 4 týdnů do 3 měsíců. Účinkem vysokých teplot (20 až 30°C, někdy i více) bezprostředně po působení nízkých teplot je možné indukci kvetení zrušit (devernalizace), ovšem jinak vernalizační signál v indukovaných semenech či pupenech se uchovává po celé mnohaměsíční období vynuceného vegetačního klidu. Bylo dokázáno, že působení nízkých teplot není zprostředkováno jinými částmi rostliny, ale k recepci dochází přímo v apikálním meristému pupene (u semen v apikálním meristému embrya), který převádí do stavu "kompetence" pro následné květotvorné procesy. Mechanismus vernalizačního procesu zdaleka není ještě uspokojivě znám, a je téměř jisté, že se bude jednat o celou řadu odlišných mechanismů. Kromě možné spoluúčasti giberelinů jejichž koncentrace v meristémech se v průběhu vystavení nízkým teplotám zvyšuje, se nejčastěji uvažuje o epigenetické regulaci květotvorných genů (stabilní změny ve způsobu exprese těchto genů po působení nízkých teplot), jak již bylo dokázáno u modelové rostliny Arabidopsis thalliana. Tím lze vysvětlit i dlouhodobé přetrvávání "květuschopnosti" v indukovaných meristémech. RŮST A VÝVOJ 34 Dormance semen a pupenů (klidový stav se zcela zablokovanou růstovou aktivitou) je dalším významným životním projevem rostlin, při kterém hraje nízká teplota často rozhodující úlohu. Nejde při tom jen o navození vstupu do dormantního stavu nízkou teplotou, ale také o jeho překonání (tedy pokračování v růstu), a to opět pod vlivem jisté doby působení nízkých teplot. Velmi známé je příznivé působení nízkých teplot na klíčení semen některých druhů. V našich přírodních podmínkách většina semen překonává zimu v nabotnalém stavu na převážně vlhkém povrchu půdy. Pro ty druhy, které nejsou mrazuvzdorné, by vyklíčení již na podzim mělo katastrofální následky. Proto je tolik důležitá vnitřní inhibice klíčení, která mizí až po několika týdnech působení teplot blízkých nule. Jak funguje tento zábranný mechanismus a čím dochází k jeho uvolnění přesně nevíme. V průběhu působení chladu byla v semenech pozorována celá řada biochemických změn - rozklad zásobních tuků a proteinů, hromadění škrobu i osmoticky aktivních cukrů. Je však obtížné v těchto změnách najít příčinnou posloupnost. Pozoruhodný je vzestup koncentrace giberelinů a je dokázáno, že dochází i k odbourávání některých inhibitorů (zejména ABA). Dormance pupenů může být indukována nízkou teplotou, avšak je známo, že k ní často dochází už v letních měsících (např. u stromů) pod vlivem zkracování délky dne. Pro zrušení dormance bývá u některých druhů významná fotoperioda (dlouhý den), u jiných jen nízká teplota a velmi často musí být splněny oba požadavky (dlouhý den po období s nízkou tepotou). Navození i zrušení dormantního stavu je vyvoláno přímým působením teploty či záření na příslušný pupen a není převoditelné z jednoho pupenu na jiný (neošetřený). Také délka fotoperiody aktivuje přímo pupen (např.u dřevin v bezlistém stavu), ačkoli ve vegetačním období jsou listy pro příjem informace o fotoperiodě naprosto nutné. Nejúčinnější teploty pro zrušení dormance bývají v rozmezí 0 až 10 °C a minimální doba působení několik týdnů. Existují ovšem velké rozdíly jak mezi druhy, tak mezi ekotypy téhož druhu. Rychlého zrušení dormance lze mnohdy úspěšně dosáhnout aplikací giberelinů, působením par některých těkavých látek, a také ponořením příslušné části rostliny do teplé vody (40 až 50 °C) po dobu asi 15 sekund. Pro urychlení vývoje některých okrasných cibulovin (např. tulipánů) byly vypracovány přesné postupy založené pouze na změnách teplotního režimu během podzimních měsíců, které umožňují "načasovat" dobu rozkvětu na žádaný termín. Vliv denního kolísání teplot (termoperiodismus) na rostliny je poměrně malý. Jen velmi zřídka jsou větší teplotní výkyvy nutnou podmínkou pro iniciaci kvetení - spíše jen zrychlují růst, zvyšují počet květů (rajčata), u brambor zvyšují počet tvořených hlíz. Pohyby rostlin a procesy řízené vnitřními rytmy Rostliny jsou sice většinou trvale přisedlé organismy, avšak jejich orgány mají schopnost jistého pohybu (ve smyslu trvalé či vratné změny jejich prostorové orientace - tedy různé ohyby, náklony, otáčení, ale i ovíjení) . Tato schopnost je nejen velmi významná pro úspěšné přežití v měnícím se prostředí, ale navíc neobyčejně nápadná. Snad právě proto byly pohyby rostlin zkoumány už v samém počátku rostlinné fyziologie a jejich výzkum pokračuje i v dnešní době. Přesto zůstává stále mnoho nedořešeno. V našem přehledu si podrobněji probereme pouze dvě hlavní skupiny pohybů - nastie a tropismy. Pomineme tedy pohyby vnitrobuněčné (proudění cytoplazmy, pohyby organel), lokomoční pohyby některých nižších rostlin a specializovaných buněk (taxe), a také veškeré pohyby neživých částí rostlin, způsobované čistě fyzikálními procesy. Nastie Jako nastie označujeme takové pohyby, jejichž směr není určen směrem působení podnětu. Většina nastických pohybů má reverzibilní charakter, neboť je způsobována změnou tvaru buněk v motorických zónách, nikoliv nevratným růstem. K nejjednodušším pohybům patří hygronastie u listů mnoha druhů trav, a to zejména těch, které rostou na suchých stanovištích. Podélné složení či svinutí jejich listů za nedostatku vody je způsobováno změnou turgoru skupin buněk na adaxiální straně. Tyto buňky (označované jako buňky buliformní) jsou většího rozměru a mají velmi slabou kutikulu ztrácejí tudíž vodu (a tím i turgor) rychleji než ostatní. Hygronastické pohyby (skládání listů) u xerofytních druhů trav. Složitější, i když velmi dobře prozkoumané, jsou nyktinastie ("spánkové" pohyby) u řady druhů se složenými listy (např.z čeledi Fabaceae a Mimosaceae). Poloha listů (přesněji řečeno prostorová orientace roviny, ve které je umístěna listová čepel) se u těchto rostlin pravidelně každý den dvakrát mění - ve dne bývá přibližně horizontální, v noci téměř vertikální. Na bázi řapíků celého listu i jednotlivých lístků, tedy v místech, kde dochází k aktivně řízeným ohybům, lze pozorovat zvláštní vrstvy buněk ("polštářky"). Příklady nyktinastického skládání listů u bobovité rostliny a detail kloubu na bázi řapíku jednoho lístku Pohyb listu je způsoben vzrůstem turgoru v polštářkových buňkách na jedné straně řapíku a současně poklesem turgoru v buňkách na opačné straně. Změny turgoru jsou způsobeny přesunem vody, kterému předchází přesun osmoticky aktivních látek (zejména K+ , tedy obdobně, jako při pohybech průduchů. A také zde je transport draslíkových iontů podmíněn zrychleným transportem H+ , po aktivaci protonových pump v plazmatické membráně. Aktivaci způsobuje záření absorbované jak fytochromy, tak i kryptochromy v buňkách RŮST A VÝVOJ 35 polštářků, a navíc v součinnosti s vnitřními rytmickými procesy (listy obvykle nereagují na změnu světlo-tma či tma-světlo, pokud by k ní došlo mimo obvyklou denní dobu). Na rozdíl od pohybů průduchů je však zde ještě jedna komplikace - tentýž podnět (světlo či tma) způsobuje zcela opačné ovlivnění transportních procesů v buňkách horní strany polštářku než v buňkách spodní strany. K nejsložitěji řízeným pohybům patří nepochybně thigmonastie, při níž reagují především listy na dotek a otřes. Stejnou reakci však může u nich vyvolat i náhlá změna teploty či podráždění elektrickým proudem. Mechanická stránka těchto pohybů je zcela stejná jako u nyktinastií (změna turgoru u buněk polštářků), ovšem navíc zde přistupuje šíření signálu z podrážděné části rostliny do částí nepodrážděných. Šíření vzruchů, tak běžné u živočichů vybavených nervovými vlákny, je u rostlin proces mnohem vzácnější a záhadnější. I u rostlin byl sice prokázán vznik akčních potenciálů po podráždění, ovšem bylo současně dokázáno, že samotný elektrický signál je málo účinný, pokud není doplněn látkovým (chemickým) mechanismem přenosu. K uvedeným poznatkům se došlo již na začátku dvacátého století, ale teprve až v polovině osmdesátých let se podařilo izolovat a identifikovat ony záhadné chemické sloučeniny, kterými se šíří vzruchy do motorických buněk polštářků. Nejčastěji se jedná o deriváty kyseliny gallové, (např. β-D-glukosid-6-sulfát kyseliny gallové, označovaný jako PLMF 1, z angl. Periodic Leaf Movement Factor). Celá skupina těchto látek se označuje jako turgoriny, a lze je považovat za specifický typ fytohormonů. Struktura nejúčinnějšího turgorinu PLMF1. Fototropismus U všech tropismů, na rozdíl od nastií, je směr pohybové reakce závislý na směru působení podnětu. Mechanická stránka těchto pohybů je obvykle spojena s usměrněným růstem buněk (nikoli tedy jen se změnami turgoru, jak tomu bylo u nastií). Tomu nutně musí odpovídat i složitější způsob řízení. U fototropismu je orientovaný pohyb částí rostliny vyvolán působením viditelného záření (tedy světla). Typickým příkladem je zakřivování stonku směrem ke zdroji záření, či pohyby listů a květů v závislosti na poloze slunce na obloze v průběhu dne. Klasickým objektem pro analýzu fototropických pohybů byly klíční rostliny trav, zejména první list (koleoptile) klíčích obilek ovsa. Velmi brzy se zjistilo, že na příjem signálu je daleko nejcitlivější špička listu. Při velmi nízké intenzitě světla (měřené v jednotkách hustoty toku záření jednotkovou plochou čili ozářenosti daného objektu), list se ohýbá vždy směrem ke zdroji záření (= pozitivní zakřivení), a velikost ohybové reakce je úměrná celkové dávce záření (= součinu ozářenosti a doby působení). Při relativně vyšší hodnotě ozářenosti (zhruba nad 0,3 J m-2 s-1 , což u bílého světla odpovídá přibližně toku fotonů 1,4 µmol m-2 s-1 ; to je méně než jedna tisícina hustoty toku slunečního záření za jasného dne!), je závislost zakřivení na dávce záření (zvyšované délkou expozice) podstatně složitější. Zpočátku má charakter shodný s reakcí za nízké ozářenosti, avšak při stoupajících dávkách záření se koleoptile vrací do vzpřímené polohy (= zdánlivá ztráta fototropismu). Při velmi vysokých dávkách záření dochází k obnovení pozitivní fototropické reakce, tedy k ohybu směrem ke zdroji záření . RŮST A VÝVOJ 36 Typické akční spektrum fototropického ohybu koleoptile ovsa. Velikost první pozitivní fototropické reakce (za malých dávek záření) je přímo úměrná těmto dávkám a nezávislá na hodnotě aktuální ozářenosti (tedy zda stejná dávka byla aplikována světlem o velké intenzitě po krátkou dobu, či slabým světlem po delší dobu). Rozporné reakce za vyšších dávek jsou zřejmě spojeny s vlivem záření na nějaký další regulační mechanismus. Skutečně bylo zjištěno, že po jisté době (několik desítek minut) způsobují vyšší dávky záření výrazný pokles citlivosti špičky listů zkoumaných rostlin na záření . Snížení citlivosti samovolně mizí asi po dvaceti minutách expozice ve tmě. Výrazný pokrok ve výzkumu závislosti fototropických reakci na dávce záření přineslo zkoumání vlastností a heterogenity receptorového systému. Již dříve bylo dokázáno, že ohybovou reakci navozuje hlavně modré a fialové světlo (o vlnové délce přibližně 350 až 500 nm). Bylo tedy zřejmé, že fototropické reakce jsou závislé na receptorech modrého záření, které byly později identifikovány jako flavoproteiny a nazvány fototropiny. Na rozdíl od tradičních představ bylo nově zjištěno, že tyto receptory se nevyskytují jen ve špičce koleoptile, ale i v níže položených místech, kde jich je ovšem mnohem méně a hlavně potřebují k aktivaci vyšší dávku záření. Uvedená pozorování zdánlivého snížení citlivosti špičky koleoptile při vyšších dávkách záření aplikovaných intensivním světelným zdrojem si nyní vysvětlujeme nasycením fotoreceptorů na obou stranách špičky (ohybová reakce předpokládá aktivaci receptorů jen na osvětlené straně!), neboť čím větší je ozářenost listu, tím více záření prochází listem i na jeho stranu odvrácenou od světelného zdroje. Za velmi vysokých dávek záření se aktivují i málo citlivé receptory na osvětlené straně spodnější strany koleoptile (pod špičkou), což vede k obnovení pozitivní fototropické reakce (k opětovnému ohybu směrem ke zdroji záření). Dosud jsme se věnovali pouze způsobu vnímání (percepce) signálu, tedy příjmu informace o záření. To je však jen začátek celé fototropické reakce - signál totiž musí být převeden k příslušným výkonným článkům regulované soustavy, tedy k buňkám, které jsou schopny na tento signál reagovat zrychlením růstu. V případě koleoptile je tedy nutný převod informace o zachyceném záření od špičky k níže položeným pletivům, která pod jeho vlivem zpomalují růst na osvětlené straně a zrychlují růst na straně odvrácené od zdroje záření. Po dlouhá léta se nestejná rychlost růstu vysvětlovala rozdílnou koncentrací auxinů záření mělo způsobovat jejich transport do méně osvětlených pletiv (teorie Cholodného a Wenta). Bylo sneseno mnoho důkazů dosvědčujících platnost této teorie (rychlost šíření signálu se shoduje s rychlostí transportu auxinů, ohyb lze vyvolat jednostrannou aplikací auxinů po seříznutí špičky, rozdíly v rychlosti růstu obou stran koleoptile jsou komplementární, pomocí biotestů lze zjistit rozdíly v koncentraci auxinů, atd.). Teprve v nedávné době byla její obecná platnost zpochybněna. Byla totiž v některých případech dokázáno nerovnoměrné rozložení i některých jiných látek regulujících rychlost růstu (např. karotenoid xanthoxin). To ovšem neznamená, že bychom mohli auxin zcela vyloučit z role RŮST A VÝVOJ 37 RŮST A VÝVOJ 38 hlavního mediátora, neboť bez jeho přítomnosti k ohybům vůbec nedojde. Je tedy velmi pravděpodobné, že půjde o spolupůsobení několika látek, z nichž některé mohou měnit citlivost buněk k auxinům. Provádíme-li pokusy s mladými výhonky jiných rostlin než jsou trávy, většinou zjišťujeme, že percepce světelného signálu probíhá přímo v místech, která se zakřivují (= oblast dlouživého růstu buněk), nikoli tedy ve vegetačním vrcholu. Často také nejsou dokazatelné komplementární rozdíly v rychlosti růstu osvětlené a zastíněné části - dochází jen k inhibici růstu na osvětlené straně, což lze tedy vysvětlit přímou inhibicí růstu buněk na osvětlené straně. Je však zajímavé, že pokud dojde k nasycení procesů tvorby inhibitorů zářením (tím, že ozařujeme rostlinu po dostatečně dlouhou dobu ze všech stran), pak při následujícím jednostranném ozáření lze pozorovat komplementární rozdíly v růstu obou stran. Můžeme tedy předpokládat, že i u orgánů reagujících přímou inhibicí růstu osvětlených buněk se může za jistých okolností uplatňovat i mechanismus založený na translokaci auxinů. Zvláště složitým případem fototropických pohybů je diafototropismus, naklánění listů vzhledem k poloze slunce na obloze v průběhu dne (obvykle s cílem maximalizovat příjem sluneční energie). Listy jsou přitom orientovány kolmo ke směru slunečních paprsků, nikoli tedy souběžně, jak je tomu u běžného fototropismu. Mechanismus pohybů je v tomto případě stejný jako u nyktinastií, tedy reverzibilní změny turgoru v polštářkovitých buňkách na bázi řapíku. Složitá je však percepce a převod signálu. Bylo zjištěno, že směr slunečních paprsků je detekován především buňkami podél hlavních žilek na listové čepeli. V závislosti na směru ozáření produkují tyto buňky signály pro stimulaci či inhibici transportních procesů v polštářcích řapíku. Způsob přenosu signálů není dostatečně znám - je však možná účast auxinů. Navíc při řízení těchto pohybů se podílejí i jisté "programy", odvozené od vnitřních biologických rytmů - naklánění listů do jistých poloh (např. směrem k očekávanému východu slunce) probíhá v pravidelnou hodinu i při umístění rostliny v úplné tmě. Gravitropismus Fototropické pohyby, které jsme si právě popsali, mají význam pouze pro nadzemní orgány. Proto také kořeny ve většíně případů na světlo nereagují. Jen výjimečně můžeme jistou reakci zaznamenat, a sice odklon od zdroje záření (negativní fototropismus). Zato pohyby vyvolané a orientované směrem působení gravitace (gravitropické pohyby) nacházíme pravidelně u všech částí rostlin. Je všeobecně známo, že hlavní stonky rostou negativně gravitropicky (= proti směru působení gravitační síly), zato primární kořen pozitivně gravitropicky. Ovšem gravitropicky orientován může být i růst některých částí rostlin (např. větví, listů) ve směru kolmém či šikmém na směr působení gravitace. Hlavním modelovým objektem pro výzkum gravitropismu byly tradičně kořeny. Již před více než sto léty byl zjištěn velký význam kořenových špiček pro vnímání gravitace a později se podařilo dokázat, že rozhodující úlohu mají buňky v kořenové čepičce, neboť po jejich poškození dojde ke ztrátě gravitropismu. Český vědec Bohumil Němec pak jako první upozornil na nápadně pravidelný výskyt amyloplastů v buňkách kořenové čepičky a na jejich možnou úlohu při gravitropických pohybech. Úloha amyloplastů jako statolitů (a to nejen v kořenech) byla skutečně potvrzena mnoha pokusy, při kterých byl škrob různými metodami odstraňován. Při těchto pokusech bylo zároveň zjištěno, že kromě amyloplastů se škrobovými zrny mohou gravitropickou reakci vyvolat i jiné částice schopné sedimentace v cytosolu, ovšem škrob, vzhledem ke své relativně vysoké specifické hmotnosti, je zvláště účinný. Jakým způsobem však sedimentace statolitů vyvolává v buňkách kořenové čepičky podráždění, a jak potom dochází k přenosu tohoto podráždění do další části kořene, ve které dojde k růstovým změnám? Obě otázky spolu úzce souvisejí. Jedna z dřívějších teorií předpokládala, že v kořenové čepičce je produkována kyselina abscisová, která při vodorovné poloze kořene inhibuje růst buněk na spodní straně, a tím dochází k jeho zakřivení ve směru gravitace. Mnoho nově získaných výsledků však tuto teorii vyvrací (např. inhibitory syntézy ABA ani aplikace ABA v přebytku neovlivňují gravitropickou reakci, přirozená koncentrace ABA v kořenech nepostačuje k výraznější inhibici růstu, atd.) Nové poznatky dokazují, že inhibice růstu je způsobována s velkou pravděpodobností auxiny, zejména kyselinou indolyl-3-octovou (IAA). Ta proudí parenchymovými buňkami poblíž středu kořene až do kořenové čepičky, a z ní se vrací zpět buňkami korového parenchymu. Buňky čepičky proto mohou ovlivnit nestejnou distribuci IAA do korových pletiv, a to především změnami v lokalizaci specifických transportních proteinů pro auxin (vynašeče typu PIN3) v plazmatické membráně. Řízení této distribuce začíná přeskupením statolitů, které má vliv i na orientaci aktinových vláken cytoskeletu a tím i na transport váčků s nově vytvářeným proteinem PIN3 přednostně k těm částem částem plazmatických membrán, které leží ve směru působení gravitace. Ve spodní (tedy původně boční) části horizontálně orientovaného kořene se vytváří natolik vysoká koncentrace auxinů, která má již inhibiční účinek na růst buněk. Horní strana je sice auxinem zásobena již méně, ale přesto pokračuje v růstu a kořen se zakřivuje směrem dolů. Velmi zjednodušené schéma gravitropické reakce kořene položeného do vodorovné polohy. Na zakřivení kořene ve směru působení gravitace se podílí jednostranné odklonění hlavního toku kyseliny indolyl-3-octové (IAA) v oblasti kořenové čepičky směrem na spodní (původně boční) stranu. Ve svislé poloze je zpětný tok IAA po obou stranách stejný. U kořenů (na rozdíl od stonků) vytvořená vysoká koncentrace IAA již působí inhibičně na dlouživý růst buněk! Gravitropické reakce u nadzemních částí rostlin jsou odlišné od kořenů, a to už tím, že percepce signálu probíhá obvykle ve stejných místech jako ohyb (nikoli tedy jen ve vegetačním vrcholu). Funkce amyloplastů jako statolitů je shodná s kořeny. Nacházíme je nejčastěji v parenchymových buňkách vnitřní kůry,ve škrobové pochvě okolo cévních svazků a někdy též v kolenchymové vrstvě pod epidermis. Položíme-li rostoucí stonek do vodorovné polohy, sedimentace amyloplastů proběhne asi za dvě minuty a během několika dalších minut můžeme pozorovat počátek gravitropického zakřivování. Spodní část stonku pokračuje v růstu, zato buňky v horní části zastavují růst. Obdobně jako u buněk se statolity v kořenové čepičce, i u buněk v zóně dlouživého růstu stonků dochází k přesměrování toku auxinů. V té části plazmatické membrány, která je vystavena tlaku amyloplastů, dojde ke zmnožení selektivních transportních proteinů (vynašečů auxinů typu PIN), a auxiny jsou tudíž přednostně transportovány napříč stonkem ve směru působení gravitace. Vzhledem k menší citlivosti buněk nadzemních části k auxinům (ve srovnání s kořeny) jejich nahromadění ve spodní části vodorovně umístěného stonku vyvolá stimulaci dlouživého růstu buněk v této části a následný ohyb stonku směrem vzhůru. RŮST A VÝVOJ 39 RŮST A VÝVOJ 40 Změnami v rozmístění auxinových transportních proteinů se dají vysvětlit i některé po dlouhou dobu záhadné jevy, jako je např. "gravitropická paměť". Bylo totiž pozorováno, že u gravitačně stimulovaného hypokotylu (= položeného po jistou dobu do vodorovné polohy) k zakřivení nemusí vůbec dojít, pokud má malý obsah auxinu (např. po dekapitaci či po aplikaci inhibitorů syntézy IAA). Gravitropickou reakci ale je možné dodatečně vyvolat aplikací IAA na takovýto orgán. Co je však zvláště pozoruhodné, že k vyvolání gravitropické reakce (ohybu) dojde i tehdy, jestliže aplikujeme IAA na hypokotyl vrácený již do svislé polohy! Stejně tak můžeme vyvolat opožděnou gravitropickou reakci u intaktního hypokotylu, který byl uložen do vodorovné polohy za nízké teploty (4°C, při které je dlouživý růst buněk zcela zastaven) a pak ve svislé poloze ohřát. Vnitřní rytmické procesy Vzhledem k velmi pravidelným cyklickým pohybům naší planety (oběh okolo Slunce a rotace kolem vlastní osy), můžeme pozorovat v přírodě mnoho významných změn s periodou jeden rok či jeden den. Pro rostliny je velmi výhodné synchronizovat průběh některých svých funkcí s pravidelně se opakujícími změnami vnějšího prostředí prostředí, zejména pak schopnost provést fyziologické změny vedoucí k optimální interakci s faktory prostředí ještě dříve než začnou působit (např. nastavit listy vhodným směrem ještě před východem Slunce, s předstihem začít s tvorbou potřebných proteinů, aktivovat enzymy, atd.). To ovšem nutně předpokládá jistou schopnost měření času (označovanou obvykle jako biologické či fyziologické "hodiny") nezávisle na změnách vnějšího prostředí. Existence vnitřní rytmičnosti u rostlin se předpokládala již velmi dávno. První spolehlivé důkazy se však podařilo získat až ve dvacátých letech minulého století a intenzivní výzkum pokračuje dodnes. Experimenty v tomto směru jsou totiž neobyčejně technicky náročné - už proto, že zajistit zcela konstantní vnější podmínky je prakticky nemožné. V úvahu se totiž musí brát i méně běžné faktory, které mohou mít kolísavý průběh a od jejichž vlivu lze pokusné rostliny obtížně izolovat (elektromagnetické vlny velmi krátkých délek, magnetické pole, toky částic s vysokou energií, aj.). Rytmické procesy u rostlin se mohou lišit délkou periody (= trváním jednoho opakujícího se cyklu), amplitudou a průběhem jednotlivých fází (= stavů v určitých úsecích periody). Nejčastěji se setkáváme s rytmickými procesy s periodou přibližně 24 hodin (= cirkadiánní rytmy), které pokračují i po umístění rostlin v trvalé tmě, nebo naopak při trvalém osvětlení. Patří sem nejen různé pohyby listů, květů a jejich částí, které pro snadnost pozorování jsou velmi často využívány v pokusech, ale i méně nápadné změny mnoha biochemických procesů (např. aktivace enzymů v uhlíkovém metabolismu CAM). Procesy, jejichž změny mají délku periody jeden rok (např. klíčení semen mnoha druhů), se zkoumají velmi obtížně nejen pro časovou i technickou náročnost, ale i pro jejich možnou interferenci s procesy stárnutí. Již v počátcích studia cirkadiánních procesů bylo zjištěno, že uměle navozeným kolísáním záření či teploty (s jinou periodou než tomu bývá v přírodě) lze vyvolat změnu délky periody a posun fází vnitřní rytmicity, měřené v následných pokusech ve stálých podmínkách. Ke změně může dojít někdy už při jednorázovém působení, jindy pod vlivem opakujících se cyklů. Tato možnost "nastavení" biologických hodin je pro rostliny v přírodě neobyčejně důležitá pro udržení přesné synchronizace vnitřních procesů s cykličností vnějšího prostředí ta totiž není obvykle zcela konstantní (např. délka dne se obvykle mění v průběhu roku velmi podstatně!). K zajímavým výsledkům také vedly pokusy s krátkodobým osvětlením rostlin při umístění v trvalé tmě. Pokud byly osvětleny v té části dne, kdy za normálních okolností (před umístěním do trvalé tmy) bylo světlo, nemělo to na rytmické procesy žádný vliv. Osvětlení v té části dne, kdy dříve bývala tma (tzv."subjektivní noc") však již vliv mělo, avšak reakce byly závislé na načasování osvitu. Osvětlení v první polovině „subjektivní noci“ vedlo k RŮST A VÝVOJ 41 prodloužení následného průběhu procesů, avšak osvětlení v její druhé polovině vedlo ke zrychlení procesů. K velmi podobným výsledkům se došlo při experimentech nejen s rostlinami, ale i s některými houbami (Neurospora sp., tvorba konidií), s prvoky (Paramecium), s hmyzem (Drosophila) a s některými dalšími živočichy. Z vnějších faktorů které ovlivňují nastavení vnitřních rytmů stojí na prvním místě záření. Z dosud zjištěných akčních spekter je zřejmé, že není zapojen pouze jeden typ fotoreceptorů u všech rostlin. Velmi častá je citlivost na modré záření, ale v některých případech je zřejmá i účast fytochromů (v červené části spektra). Vliv teploty je mnohem menší ve srovnání se zářením. Teplota ovlivňuje především amplitudu, jen velmi zřídka i délku periody. Z dosavadních výsledků vyplývá, že u rostlin, stejně tak jako u mnoha jiných organismů, není řízení rytmicity lokalizováno do jediného místa (centra). Různé části rostliny mohou mít do značné míry autonomní projevy rytmicity. Příkladem mohou být polštářkové buňky na bázi listů řídící nyktinastické pohyby či buňky rostlin s fixační cestou CAM, řídící cirkadiánní vnitřní rytmicitu aktivity enzymů. Ústředním problémem při studiu mechanismu biologických hodin je nalezení základního "oscilátoru" generujícího základní krok časomíry, tedy pravidelné endogenní impulzy, ze kterých by bylo možné odvodit (a tím i měřit) delší časové intervaly. Již v začátcích podrobného studia vnitřní rytmicity byla totiž opuštěna představa měření času pomocí jednoduchého principu "přesýpacích hodin", tedy postupného rozpadu (či naopak hromadění) určitého metabolitu. Ani samovolný přechod aktivní formy fytochromů do neaktivní při zatemnění rostlin nemůže tuto funkci plnit, protože k němu dochází příliš rychle a navíc rychlost konverze je ovlivňována řadou dalších faktorů. V současné době je stále více zřejmé, že jak u živočichů, tak i u rostlin je vnitřní rytmicita vázána na periodickou aktivaci a inaktivaci specifických genů pomocí různě složitých regulačních smyček. V jednodušším případě se na příslušném genu pro řízení rytmicity (např. gen per u octomilky či gen frq u houby Neurospora crassa, homologní geny byly nalezeny i u rostlin) vytváří transkripcí mRNA pro specifický protein, který vstupuje do jádra a inhibuje přepis svého vlastního genu. Tím klesá množství příslušné mRNA a zpomaluje se tvorba inhibičního proteinu, což vede k opětovnému zvýšení tvorby mRNA a inhibičního proteinu. Je zřejmé, že takovéto cyklické změny se mohou opakovat libovolně dlouho a mohou tudíž sloužit jako "základní oscilátor". Výzkumy v posledních letech naznačují, že mechanismus oscilačních procesů bude složitější než naznačený příklad. Specifických genů vnitřní časomíry může být totiž v téže buňce více a mezi produkty jejich aktivity může docházet k interakcím. Jak u hmyzu, tak i u rostlin bylo dokázáno, že i v různých orgánech téhož jedince může být vnitřní rytmicita řízena odlišnými a navzájem nezávislými mechanismy. RŮST A VÝVOJ 42 Kontrolní otázky ke 3. části učebního textu Fyziologie rostlin 1. Jakým způsobem ovlivňuje rychlost a orientaci prodlužovacího růstu buněk stavba jejich buněčné stěny? 2. V jaké fázi vývoje embrya lze již pozorovat polaritu jeho buněk? 3. Popiš jakým způsobem dochází v primárním kořenu k tvorbě bočních kořenů. 4. Popiš jakým způsobem dochází v apikálním meristému prýtu k tvorbě základů listů. 5. Jak je uskutečňován mezibuněčný a dálkový transport auxinů v rostlinách ? 6. Jaké oblasti (typy) fyziologických procesů jsou regulovány pomocí auxinů ? 7. Jaké jsou hlavní fyziologické účinky cytokininů a giberelinů ? 8. V kterých částech rostliny se může vytvářet kyselina abscisová a jak je transportována ? 9. Jaké odlišné regulační účinky má zvýšené množství giberelinů a kyseliny abscisové v semenech ? 10. Jakým chemickým ošetřením s využitím znalostí o fytohormonech lze prodloužit životnost řezaných květin ? 11. Jakým chemickým ošetřením s využitím znalostí o fytohormonech lze zvýšit odolnost rostlin vůči působení stresových faktorů ? 12. Jakým chemickým ošetřením s využitím znalostí o fytohormonech lze urychlit zrání sklizeného ovoce ? 13. Jaké typy informací získává rostlina vnímáním záření a jaké typy pigmentů slouží k příjmu informačních signálů ? 14. Jaké typy fyziologických procesů mohou být aktivovány pomocí modrého záření ? 15. Jakým mechanismem jsou schopny fytochromy aktivovat v rostlinách některé enzymy ? 16. V které části rostlin je zachycována informace o fotoperiodicitě spouštějící tvorbu květů ? 17. Jaké další faktory (kromě fotoperiodického účinku záření) mohou také iniciovat tvorbu květů ? 18. Jaké jiné růstové či vývojové procesy (kromě tvorby květů) mohou být iniciovány vhodnou délkou dne ? 19. Jaké vývojové procesy mohou být iniciovány působením nízkých teplot ? 20. Jaké typy pohybů orgánů rostlin jsou řízeny změnami turgorového tlaku ? 21. Popiš průběh fototropické reakce (= vnímání signálu a řízení ohybu nadzemních části směrem ke zdroji záření). 22. Popiš průběh gravitropické reakce kořenů (= vnímání signálu a řízení ohybu ve směru působení gravitační síly). Učební text k přednášce Bi4060 na přírodovědecké fakultě MU v Brně. Určeno pouze ke studijním účelům. Autor textu Jan Gloser. 4. ČÁST - STRESOVÁ FYZIOLOGIE Funkce rostlin v různých typech prostředí - obecné problémy Většina základních fyziologických poznatků byla získána na omezeném počtu "modelových" druhů rostlin, a to ještě pěstovaných za stálých podmínek blízkých optimu. Pro analytické poznávání jednotlivých funkcí je tento postup jistě výhodný. V přírodě však rostliny rostou často za podmínek mnohem méně příznivých. Faktory prostředí, které je obklopuje, kolísají v širokých mezích, často až na samou hranici existenčního minima. Přežití v těchto podmínkách by bylo sotva možné bez schopnosti přizpůsobování (adaptability). Čím více a déle se vnější prostředí odchyluje od optima, tím více trvalých změn struktur a funkcí nacházíme u organismů žijících v tomto prostředí. Každý rostlinný druh prošel od svého vzniku složitým selekční sítem nejrůznějších kombinací vnějších podmínek. Selekce neprobíhala na úrovni jednoho procesu či funkce, ale vždy na úrovni fenotypových projevů celého organismu. Úspěšné druhy nemusejí mít proto zrovna nejlepší parametry v určitém znaku, který považujeme za nejdůležitější. Rozhodující bývá často vyrovnanost ve více znacích. Limitujících faktorů totiž působí totiž na rostlinu v průběhu krátké doby obvykle více a přizpůsobení k nim může klást protichůdné požadavky na funkční i strukturní změny. Také kolísání některých faktorů prostředí (např. záření, teploty, vlhkosti půdy) je velké a nepravidelné, takže jednoznačně optimální přizpůsobení ani není možné. Přizpůsobením rozumíme veškeré modifikace funkcí a struktury rostliny pod vlivem určitého typu prostředí, které zvyšují pravděpodobnost přežití a reprodukce. Dědičně fixované změny označujeme jako adaptace, krátkodobé, nedědičné změny v rámci fenotypové plasticity jistého genotypu jsou aklimace. Oba uvedené typy přizpůsobení mohou mít povahu kvalitativní (např. syntéza látek nové struktury) či kvantitativní (syntéza většího množství již dříve přítomných sloučenin). Může k nim docházet na buněčné úrovni i na úrovních organizačně vyšších (pletiva, orgány, celá rostlina). Přizpůsobení struktury (morfologie) a fyziologických funkcí je obvykle na sebe velmi úzce vázáno. Přechodné, aklimační zvýšení odolnosti může být založeno jak na změnách rychle pomíjivých (zvýšení aktivity některého enzymu, tvorba specifických metabolitů), tak i trvalejších (změny v tvorbě nových orgánů a v jejich vnitřní struktuře). Prostředí které působí na funkce rostlin v přírodě je složitý komplex faktorů, který nelze charakterizovat jedním souhrnným znakem, ale je nutný rozklad na jednotlivé složky. Nejběžnější je dělení faktorů prostředí do tří kategorií: fyzikální, chemické a biotické. Z prostorového hlediska je možné dělení na faktory klimatické (působící na nadzemní části rostlin) a edafické (půdní). Někdy je také výhodné rozdělit složky prostředí na zdrojové (tedy zdroje hmoty a energie pro rostliny - fotosynteticky aktivní záření, oxid uhličitý, voda a minerální živiny) a modifikační (např. teplota, toxické látky, biotické vlivy). STRESOVÁ FYZIOLOGIE 1 U těch složek prostředí, které jsou nezbytné pro funkce rostliny, můžeme stanovit jejich prahovou hodnotu (= úroveň, při které je již působení na rostlinu měřitelné), hodnotu nasycení (saturace, zabezpečující optimální funkci) a dále hodnoty inhibiční až letální. Velmi často se mohou účinky jednotlivých faktorů sčítat či násobit (aditivní a multiplikativní působení), někdy mohou být i ve složitějších typech vzájemných interakcí. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 2 Intenzivní výzkum vztahů mezi prostředím a fyziologickými procesy je velmi často motivován potřebou přispět k řešení závažných ekologických otázek. V prvé řadě jde o vysvětlení příčin výskytu a prosperity různých druhů rostlin v určitých typech prostředí, o poskytnutí podkladů pro mechanismové prediktivní modely utváření a vývoje rostlinných společenstev a rychlosti produkce rostlinné biomasy. Na tuto problematiku se zaměřuje ekologická fyziologie (ekofyziologie), která se v současné době velmi rychle rozvíjí. Jejím cílem není tedy studium základních principů fyziologických procesů, ale spíše využití detailních znalostí těchto procesů pro syntetické hodnocení významnosti různých mechanismů adaptace a aklimace rostlin k převažujícím vnějším podmínkám. Jde o rozsáhlou hraniční disciplinu, ve které nevystačíme jen se sběrem dat o fyziologických procesech rostlin v určitém typu prostředí. Obvykle je nutno s nemenším intenzitou sledovat i variabilitu faktorů prostředí, strukturní charakteristiky rostlin (např. orientaci jednotlivých orgánů v prostoru, horizontální variabilitu rozmístění rostlin v porostech, druhové složení porostů, populační dynamiku, atd.). V ekologické fyziologii často nejde jenom o zkoumání schopností přizpůsobení k aktuálnímu působení prostředí, ale také o posouzení výhodnosti jistého typu chování rostlin v delším časovém měřítku (měsíce, roky). Fyziologické procesy jsou pak chápány jako regulační člen celkového koloběhu uhlíku, vody a minerálních živin v ekosystémech. Užitečný může být také "ekonomický" pohled na funkce rostlin, spojený s hodnocením účinnosti transformace zdrojů hmoty a energie, či s aplikací analýzy náklady-prospěch (cost-benefit analysis). V rámci ekologické fyziologie se zvláště bouřlivě rozvíjí dílčí směr označovaný jako stresová fyziologie. Ta se speciálně zaměřuje jen na nepříznivé působení jednotlivých faktorů prostředí (= stresové faktory, stresory) na rostliny. Kromě rostlinných ekologů má velký zájem na tomto výzkumu zemědělská praxe, neboť vyšlechtění nových genotypů polních plodin s větší odolností k nepříznivým podmínkám je z mnoha důvodů velmi žádoucí. Racionální postup při tvorbě odolnějších genotypů by měl vycházet ze znalostí fyziologických mechanismů podmiňujících zvýšenou odolnost. Koncepční přístup ke studiu stresu u rostlin Termín stres je obvykle (i když nejednotně) používán pro souhrnné označení stavu ve kterém se rostlina nachází pod vlivem stresorů. Nejde přitom nikdy o nějaký ustálený a snadno definovatelný stav, ale spíše o dynamický komplex mnoha reakcí. Problematika stresu je u rostlin komplikovanější než ve fyziologii živočichů. Je to dáno nejen jejich přisedlým způsobem života, který neumožňuje únik před působením stresorů, ale také tím, že u rostlin je mnohem větší mezidruhová variabilita i heterogenita vnitřního prostředí (buněk, pletiv). Ta se projevuje značným kolísáním fyzikálně-chemických parametrů rostlinných buněk i v průběhu „normálního“ fungování. Potíže se stanovením reakční normy se pak nutně přenášejí i do stanovení počátku „nenormálních“, tedy stresových reakcí. Výzkum vztahů mezi vnějším prostředím a stresem v rostlinách obvykle začíná studiem přenosu podnětů vyvolávajících stres na rozhraní orgánů rostliny s vnějším prostředím, a dále pak přenosem signálů uvnitř rostliny. Stresové faktory, ať už fyzikálně-chemické či biotické, mohou pronikat do vnitřního prostředí rostlin různých druhů nestejně snadno, a to především v důsledku různě vyvinutých ochranných struktur. Tento způsob ochrany má převážně pasivní a dlouhodobý charakter (např. tlustá kutikula na listech, výrazná impregnace buněčných stěn, rezervoáry vody a snadno rozložitelných organických látek, tlumící jejich nedostatek). Jedná se vlastně o schopnost vyhnout se stresu (stress avoidance, Levitt 1980), ke které přispívají také vhodně načasované životní cykly. Z fyziologického hlediska jsou mnohem zajímavější mechanismy aktivní odolnosti (stress tolerance), omezující negativní dopad stresorů až po jejich proniknutí k plazmatické membráně buněk a do symplastu. V takovém případě dochází ke spuštění řetězce změn, který STRESOVÁ FYZIOLOGIE 3 bývá označován jako stresová reakce. S vědomím značné dávky zjednodušení lze i u rostlin přijmout obecné schéma průběhu reakce organismu na stres, známé z živočišné fyziologie. Bezprostředně po začátku působení stresového faktoru dochází k narušení buněčných struktur a funkcí (poplachová fáze). Pokud intenzita působení stresoru nepřekročí letální úroveň, dochází záhy k mobilizaci kompenzačních mechanismů (restituční fáze), které směřují ke zvýšení odolnosti rostliny vůči působícím faktorům (fáze rezistence). Ne vždy však toto zvýšení má trvalý charakter. Při dlouhodobém a intenzivním působení stresového faktoru může být vystřídáno dalším poklesem (fáze vyčerpání). Základní schéma průběhu stresové reakce ale nevypovídá vůbec nic o rozmanitosti vlastního působení stresorů, ani o koordinaci složitého komplexu reakcí kterými je podložena odpověď rostliny na jejich působení. Tato neobyčejně rozsáhlá problematika je v současné době intenzivně studována na různých organizačních úrovních, od molekulových a genetických základů až po integrující projevy celé rostliny. V následujícím textu bude možné podat jen velmi stručné shrnutí základních poznatků, a to jednak o zvláštnostech působení jednotlivých stresorů, jednak o některých společných mechanismech stresových reakcí. Předem je však potřeba zdůraznit, že průběh stresové reakce a její konečný výsledek závisí jak na intenzitě a délce působení stresového faktoru na danou rostlinu, tak i na geneticky vázaných předpokladech odpovědi, souhrnně označovaných jako adaptační schopnosti. Zvýšení odolnosti a opětovné ustavení homeostáze i za dlouhodobého působení stresorů bývá obvykle dosahováno jen za cenu jistých dodatečných energetických nákladů, hlavně na syntézu specifických metabolitů. I některé další změny v metabolismu zajišťující vysokou odolnost (např. udržování zvýšené koncentrace osmoticky aktivních látek) bývají často provázeny snížením rychlosti získávání nových zdrojů hmoty a energie, a tedy i snížením rychlosti tvorby biomasy. Změny struktur a funkcí rostliny vedoucí k nízké efektivitě získávání zdrojů mohou přetrvávat ještě hodně dlouho po návratu vnějších podmínek k optimu, někdy i po celý zbytek vegetačního období. Působení stresorů (např. nízké teploty) však může na druhé straně podmiňovat průběh důležitých morfogenetických procesů, např. klíčení či tvorbu květních orgánů, a tím zvýšit reprodukční schopnosti i kompetiční úspěšnost. Nelze se tomu divit, vždyť celý dlouhý proces evoluce rostlin nepochybně probíhal pod vlivem stresových faktorů. Ty z nich, které měly dostatečně pravidelný, periodický výskyt, mohly být "využity" nejen ke spouštění stresové reakce, ale i jako signál pro řízení jiných fyziologických procesů, které se zvýšením odolnosti neměly žádnou přímou souvislost. Z toho je zřejmé, jak obtížné může být posuzování příznivosti či nepříznivosti vnějších faktorů pro rostliny a současně jak významné je časové měřítko při tomto hodnocení. Studium stresu u rostlin rostoucích v přírodních podmínkách je dále komplikováno tím, že často více stresových faktorů působí současně (např. silné záření, vysoká teplota a nedostatek vody). Interakce mezi nimi mohou podstatně měnit charakter stresové reakce ve srovnání s působením každého faktoru odděleně. Působení stresorů bývá také často omezeno jen na jednu část rostliny (listy či kořeny) ve které dochází k lokální stresové reakci, ale ta může druhotně způsobovat stres i v ostatních orgánech. Společné mechanismy stresových reakcí Stresové a aklimační reakce, podobně jako některé jiné projevy fenotypové plasticity, neprobíhají nahodile. Jsou závislé na "programech" aktivace určitých genů, které mohou být za jistých okolností spuštěny, a to někdy i několika odlišnými mechanismy. Tyto programy jsou často evolučně velice staré. Proto také například náhlým zvýšením teploty (teplotním šokem) můžeme indukovat tvorbu skupiny proteinů, jejichž zastoupení je shodné nejen u všech druhů rostlin, ale i u mikrobů a živočichů. Hlavní abiotické stresové faktory, jako např. nedostatek vody, extrémní teploty či zasolení, formovaly metabolické procesy živých organismů už od samého začátku kolonizace souší. Dokonalá a trvalá adaptace k široké amplitudě kolísání vnějších faktorů nebyla možná, už jen z důvodů fyzikálně-chemických vlastností základních stavebních kamenů živé hmoty, makromolekul a membrán. Jediným možným řešením byla dočasná úprava struktur a metabolických cest podle aktuálního stavu vnějších podmínek, a také zajištění rychlé opravy poškozených součástí. Metabolické změny v buňkách při působení i velmi odlišných stresorů mají sice řadu společných znaků, avšak představa jediné obecně platné stresové reakce je nereálná. Jedná se spíše o jisté dílčí komplexy společných reakcí, které vedou ke zvýšení odolnosti vůči několika stresorům současně. Připomeňme si alespoň ty nejčastější společné stresové reakce rostlin. a) Příjem a vnitrobuněčný přenos signálů Stresové reakce jsou spouštěny podněty (signály), které mají fyzikální nebo chemickou povahu a pro které je v buňce vhodný receptor. Prakticky všechny dnes známé receptory jsou specializované proteiny umístěné především v plazmatické membráně, ale i v jiných částech buňky (např. v buněčné stěně, v cytosolu, v jádře). Přenos signálu z receptoru ke konečným efektorům (obvykle proteinům na kterých bezprostředně závisí nějaká fyziologická funkce, např. enzymy primárního i sekundárního metabolismu, transportní proteiny v membránách, cytoskelet, trankripční faktory ovlivňující expresi genů) není podle našich současných znalostí realizován jedním lineárním řetězem mezičlánků (druhotných přenašečů, second messangers), ale spíše složitou sítí více paralelních cest. Klíčovou úlohu v této síti mají jednak ionty vápníku, jednak početná skupina (více než 70) proteinkináz. Mnoho proteinů, zvláště enzymů, je totiž aktivováno až po navázání Ca2+ (za asistence proteinu calmodulinu) nebo fosfátové skupiny (pomocí proteinkináz). Ovšem jen zřídkakdy přenáší receptor signál přímo na proteinkinázy či na vápníkové kanály, častěji bývá přenos zprostředkován pomocí G-proteinů (či GTP-áz). Tyto proteiny se energeticky aktivují navázáním GTP (guanosintrifosfát), respektive jeho přeměnou z GDP (guanosin difosfát), ke které dojde kontaktem se stimulovanou molekulou receptoru. Aktivované Gproteiny jsou pak schopny přivádět do funkčního stavu další proteiny zapojené do šíření signálu (viz obrázek): Schéma vnitrobuněčného přenosu signálu pomocí fosfoinositidového mechanismu: po zachycení signálu v receptoru dojde pomocí G-proteinu (G) k aktivaci fosfolipázy typu C (PLC). Ta štěpí fosfatidylinositol-4,5-bisfosfát (PIP2), vznikající z fosfatidylinositolu (PI), na inositol-1,4,5-trisfosfát (IP3) a diacylglycerol (DAG). IP3 stimuluje otevření vápníkových kanálů v endoplazmatickém retikulu (ER) a ionty vápníku pak aktivují příslušný efektor buď přímo či zprostředkovaně pomocí proteinkináz (PK). Paralelně může být zapojen do přenosu signálu i diacylglycerol. Přenos signálu obvykle končí aktivací specifického genu, aktivací některého z metabolicky významných enzymů, anebo také aktivací určitých transportních proteinů v membránách. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 4 STRESOVÁ FYZIOLOGIE 5 K otevření vápníkových kanálů (nejen v ER, ale i v plazmatické membráně a v tonoplastu) může dojít i přímým působením G-proteinů, změnou transmembránového potenciálu, i mechanickými podněty (např. změnami turgorového tlaku v buňce). Vzhledem k tomu, že koncentrace Ca2+ iontů v apoplastu, ve vakuole či v ER je nejméně tisíckrát větší než v cytosolu, probíhá transport otevřeným iontovým kanálem velmi rychle (asi 106 iontů za sekundu!). Po odeznění signálu je vápník transportován zpět z cytosolu pomocí vápníkových pump (Ca2+ -ATPáz) či pomocí Ca2+ /H+ sekundárně aktivních přenašečů. K signalizaci mohou sloužit i rychlé změny (oscilace, vlny) koncentrace Ca2+ v buňce. Úloha iontů vápníku je pro vnitrobuněčnou signalizaci skutečně zásadní, je totiž známo více než sto enzymů aktivovaných navázáním Ca2+ . Aktivace neprobíhá současně v celém vnitřním prostoru buňky, nýbrž je lokalizovaná jen na místa s výskytem enzymu který má být aktivován. Přenos signálu pomocí proteinkináz může probíhat zcela nezávisle na iontech vápníku. Obvyklá cesta navazujících aktivací je: receptor → G-protein → proteinkináza → efektor, existují ovšem i další alternativní cesty a častá je taky funkce některých proteinkináz jako primárních receptorů signálu. U rostlin, stejně jako u živočichů, bývá někdy signál přenášen pomocí kaskády proteinkináz, ve které kináza aktivující efektorový protein je nejprve aktivována jinou (specifickou) kinázou, která ale opět vyžaduje aktivaci dalším typem kinázy - jedná se tedy o soustavu nejméně tří na sobě závislých kináz typu MAPK (mitogen activated protein kinases). Popsaný způsob přenosu signálu je používán nejen za stresových situací, ale i k přenosu informací koordinujících růstové procesy, kdy primárním (vnějším) signálem může být záření či fytohormony. Za stresových situací však význam rychlé signalizace zvláště výrazně stoupá a k druhotným přenosům se využívají i některé další sloučeniny (např. peroxid vodíku, glutation, askorbát, jasmonáty a polyaminy). b) Tvorba stresových proteinů Pod vlivem náhlého působení stresových faktorů a za asistence příslušných receptorů s navazujícím řetězcem vnitrobuněčných přenašečů signálů dochází často již během jedné hodiny k velmi dramatickým změnám v kvantitativním i kvalitativním zastoupení proteinů v buňkách. Tvorba některých prudce stoupá, tvorba jiných se naopak zastavuje. V hojné míře se ale také syntetizují proteiny, které se za normálních okolností vůbec nedají v buňkách zjistit. Změny v syntéze proteinů obvykle kulminují několik hodin po začátku působení stresoru. Poté dochází k pomalému návratu do původního stavu. Z několika desítek proteinů, jejichž syntéza se prudce zvyšuje (stresové proteiny), jen jistá část je specificky vázána na určitý stresový faktor. K indukci mnoha dalších dochází zcela pravidelně pod vlivem stresu obecně, tedy bez ohledu na to, jakým typem stresoru je vyvolán. Nově tvořené stresové proteiny mají velmi rozmanitou velikost i funkci. Není příliš obtížné rozdělit je pomocí vhodných detekčních metod (např. pomocí dvojrozměrné gelové elektroforézy, přesněji pak pomocí hmotností spektrometrie) do skupin podle molekulové hmotnosti, která bývá obvykle v rozmezí od 8 do 260 kDa. Mnohem obtížnější je určit jejich funkci. Nejčastěji se jim přisuzuje významná úloha v ochraně strukturní integrity proteinů, nukleových kyselin a membrán (např. udržováním hydratačních obalů), a podílí se také na odstraňování či reparaci poškozených buněčných struktur. Někdy se jedná o konstitutivní proteiny, které patří k pravidelné výbavě všech buněk, ovšem za stresu se jejich množství mnohonásobně zvyšuje. Často plní funkci chaperonů, které slouží nejen k řízení změn konformace proteinů při transportech přes membrány, ale jsou schopny upravit jejich konformaci i při mírném poškození. Pokud ovšem dojde k velkým, nenapravitelným změnám, pak je takový protein „označen“ malou molekulou ubikvitinu a rozložen pomocí proteáz na aminokyseliny, které jsou využity k syntéze nových proteinů. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 6 c) Koordinace stresových reakcí pomocí fytohormonů Pro zvýšení odolnosti vůči stresům je obvykle výhodné, aby reakce v jednotlivých buňkách probíhaly koordinovaně, a to i v okolí postiženého místa. To je zvláště důležité při mechanickém poranění rostliny či při pronikání patogenní houby. K šíření signálů mezi buňkami i na delší vzdálenosti využívají rostliny hlavně fytohormony. I když jsou to sloučeniny značně mobilní a mohou pronikat nejen k receptorům v plazmatické membráně, ale až do buněčného jádra, jejich působení na buněčné funkce (zejména na aktivaci genů) je téměř vždy zprostředkováno pomocí některého z článků vnitrobuněčné soustavy přenosu signálu, jak již bylo popsáno v kapitolách o fytohormonech ve 3. části učebních textů. Kyseliny abscisová (ABA), etylén a brassinosteroidy patří ke základním fytohormonům, jejichž zvýšená tvorba pravidelně provází působení většiny stresorů. Známe již desítky genů aktivovaných za stresových situací těmito fytohormony, ovšem zdaleka ještě neznáme význam všech nově syntetizovaných produktů. Vedle vyloženě kladných účinků (např. aktivace tvorby stresových proteinů a některých hydroláz) mají i výrazné inhibiční účinky na tvorbu některých enzymů (např. Rubisco, α-amyláza, aj.), což vede ke zpomalení růstu. Význam ABA a brassinosteroidů pro zvýšení odolnosti vůči suchu a mrazu je všeobecně uznáván, úloha etylénu je již poněkud nejednoznačná - kromě aktivace antistresových mechanismů působí i rychlejší stárnutí postižených orgánů. Jasmonáty (kyselina jasmonová, metyljasmonát), polyaminy (především spermin, spermidin a putrescin) a kyselina salycilová patří také k látkám fytohormonálního typu, jejichž koncentrace za stresů roste a jejichž ochranný účinek byl bezpečně prokázán. Jejich větší významnost je však omezena jen na některé taxonomické skupiny rostlin. d) Tvorba a odstraňování reaktivních forem kyslíku Stresové reakce rostlin jsou neodmyslitelně spojeny se zvýšením tvorby reaktivních forem kyslíku (singletní kyslík, superoxidový radikál, hydroxylový radikál a peroxid vodíku), ale současně i se zvýšením potenciálu pro jejich odstraňování. Mechanismus jejich vzniku i způsob odstraňování je dosti různý. Také úloha těchto látek ve stresovaných rostlinách je značně rozmanitá a do jisté míry rozporná. Jednak vznikají jako nebezpečné produkty při působení řady stresových faktorů, jednak mohou mít kladnou úlohu jako signály či ochranné látky při některých typech stresů. Tvorba reaktivních forem kyslíku probíhá u všech rostlin, a to i při jejich růstu v optimálních podmínkách. Je nevyhnutelně spojena s transformací energie a s redoxními reakcemi v různých částech buňky včetně buněčné stěny. Stresové faktory mohou tuto tvorbu podstatně zrychlit, a to zejména: • selektivním ovlivněním metabolických reakcí spojených s redoxními výměnami, • celkovým poškozením metabolismu a tím i poklesem účinnosti antioxidačních systémů. První sloučeninou vznikající částečnou redukcí kyslíku je superoxid a jeho další redukcí dochází ke tvorbě peroxidu vodíku: O2 + e→ O2 - (1) O2 + e+ 2H+ → H2O2 (2) Reakce (1) vyžaduje dodání energie, zatímco reakce (2) probíhá samovolně, ovšem velmi pomalu. Katalytickým působením enzymu superoxiddismutázy se její průběh velmi zrychluje. Superoxid a peroxid vodíku nejsou příliš nebezpečné sloučeniny, ale jejich společný výskyt může vést ke vzniku vysoce reaktivního hydroxylového radikálu (OH . ): O2 + H2O2 → OH . + OH + O2 (3) Tvorba hydroxylového radikálu je velmi zrychlována v přítomnosti železnatých či měďnatých iontů: Fe2+ + H2O2 → OH . + OH + Fe3+ (4) Největší množství aktivních forem kyslíku se vytváří v chloroplastech, vznikají však i v mitochondriích a v jiných membránových systémech (plazmalema, tonoplast, peroxisomy, glyoxysomy). Ve většině případů jako redukční činidlo slouží NAD(P)H ve spojení s příslušnou NAD(P)H oxidázou. Negativní působení reaktivních forem kyslíku spočívá především v peroxidaci lipidů. Nejvíce náchylné jsou membránové lipidy s vysokým obsahem nenasycených mastných kyselin. Poškozeny mohou být i některé aminokyseliny, proteiny a nukleové kyseliny, přičemž nejvíce náchylný k poškození je histidin, metionin, tryptofan a guanin. Mechanismy ochrany před oxidativním poškozením: Nejuniverzálnější ochranu před poškozením reaktivními formami kyslíku ve všech částech buňky poskytují některé specializované enzymy a antioxidační substráty. K hlavním enzymům patří především již zmíněná superoxiddismutáza (SOD), která katalyzuje přeměnu superoxidu na peroxid vodíku. V rostlinách se vyskytují dokonce tři typy SOD (Cu/Zn SOD, Mn SOD a Fe SOD), a ve většině buněčných organel nacházíme alespoň jeden z nich. Peroxid vodíku je dále rozkládán buď katalázou (především v peroxisomech a glyoxisomech), nebo askorbátperoxidázou (AP, zejména v chloroplastech, kde chybí kataláza, někdy i v cytosolu jinými typy peroxidáz). K reakci katalyzované AP je nutný askorbát a k regeneraci vznikajícího dehydroaskorbátu také redukovaná forma glutationu, společně s enzymy dehydroaskorbátreduktázou a glutationreduktázou. Klíčovou úlohu v antioxidační ochraně hraje askorbát a glutation. Obou sloučenin bývá zejména v chloroplastech velké množství. Askorbát může reagovat se superoxidem a singletním kyslíkem i přímo, bez účasti enzymů, navíc přispívá k regeneraci α-tokoferolu (vitamin E), významné lipofilní sloučeniny chránící membránové lipidy před peroxidací. Schéma inaktivace superoxidu a peroxidu vodíku s navazujícími regeneračními cykly askorbátu a glutationu s finální redukcí pomocí NADPH. Protistresová úloha reaktivních forem kyslíku dosud není uspokojivě prozkoumána ve všech souvislostech. Zcela zásadní roli mají nepochybně v hypersensitivní reakci (bude blíže popsána později). Peroxid vodíku je zapojen i do dalších obranných reakcí rostliny při napadení patogeny. Zrychluje tvorbu ligninu (a tedy zpevnění buněčné stěny), může působit na otevření vápníkových kanálů - vtok Ca2+ má pak dalekosáhlé aktivační účinky. V součinností s kyselinou salycilovou (ta je schopna inaktivovat katalázu a tím dočasně udržet zvýšenou koncentraci peroxidu vodíku v buňce) indukuje tvorbu některých stresových proteinů. Funkce peroxidu vodíku jako přenašeče signálu pro expresi některých genů je významná i u živočichů a bakterií. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 7 Působení abiotických stresových faktorů Záření jako stresový faktor Ultrafialové (UV) záření v oblasti vlnových délek 200 až 400 nm představuje jen asi 7 % z celkového slunečního záření dopadajícího na naši planetu. UV záření kratších vlnových délek, označované jako UV-C (200 až 280 nm), a částečně i UV-B (280 - 320 nm) je z větší části absorbováno v atmosféře Země, zejména pak ve stratosférické ozónové vrstvě. Nejméně je atmosférou filtrována oblast UV-A (320-400 nm), která však má na živé organismy mnohem méně škodlivý účinek než pronikající zbytek záření UV-B. UV záření s kratší vlnovou délkou (B, C) je velmi silně absorbováno celou řadou biologicky významných sloučenin, zvláště pak aromatickými aminokyselinami a nukleotidy, a tudíž i makromolekulami proteinů a nukleových kyselin. Po absorbci UV záření dochází u excitovaných molekul k fotochemickým reakcím, které poškozují jejich normální funkce. K nejčastějším změnám u proteinů patří fotooxidace thyrosinu a tryptofanu, a také rozštěpení disulfidických můstků mezi cysteinovými zbytky, které zajišťují správnou terciární strukturu proteinů. U nukleových kyselin dochází po excitaci ke vzniku nových vazeb mezi blízkými pyrimidinovými nukleotidy. Zvláště častá je tvorba dimerů thyminu uvnitř jednoho či mezi dvěma vlákny DNA - následkem jsou poruchy v replikaci DNA i v expresi genetické informace. UV záření může způsobit u rostlin také poškození asimilačního aparátu a tím snížení rychlosti fotosyntézy. Nejvíce citlivé jsou proteiny D1 a D2 ve fotosystému II, a také proteiny centra oxidace vody. Poškozeny však mohou být i asimilační pigmenty a redoxní systémy, zejména plastochinony. V horní části obrázku je uvedeno zastoupení UV-záření ve spektru slunečního záření jednak nad stratosférou a jednak po průchodu atmosférou s neporušenou ozónovou vrstvou na zemský povrch. V dolní části obrázku jsou uvedeny křivky relativní absorbance některých významných součástí buněk Adaptace rostlin směřující k omezení škodlivých účinků UV záření spočívá především v zamezení jeho vstupu do vnitřních částí exponovaných orgánů, zejména tedy do asimilačního parenchymu listů. Velmi účinnou ochranu představují kutikulární vosky na vnějším povrchu a flavonoidní pigmenty ve vakuolách epidermálních buněk. Při vyšších dávkách UV záření se syntéza ochranných pigmentů velmi rychle zvyšuje. K rychlé opravě poškozených nukleových kyselin slouží především skupina specifických STRESOVÁ FYZIOLOGIE 8 STRESOVÁ FYZIOLOGIE 9 enzymů fotolyáz, které štěpí vazby nově vzniklých dimerů. Tento proces se nazývá fotoreaktivace. Fotolyázy jsou flavoproteiny aktivované krátkovlnným zářením (370 - 450 nm). Radiační energie zachycená flavinovým chromoforem a přenesená na redoxní skupinu FADH (na tomtéž proteinu) je využita ke štěpení nežádoucího dimeru. Kromě toho může být poškozená DNA opravena, i když pomaleji, pomocí jiných enzymatických systémů (endonukleázy, DNA-polymerázy, ligázy). Poškozené proteiny je obvykle nutno rozložit a nahradit novými. Rychlost resyntézy proteinů tedy rozhoduje době nutné k návratu buněčných funkcí do původního stavu. V běžných přírodních podmínkách dochází jen velmi zřídka k vážnějšímu poškození vyšších rostlin UV zářením. Výsledky pokusů ukazují, že i při zvýšení toku UV-B záření na zemský povrch o 10 % (v důsledku oslabení filtrační vrstvy ozónu ve stratosféře) budou ochranné mechanismy většiny běžných druhů rostlin ještě dostatečně spolehlivě chránit před vážnějším poškozením. Nesmíme však zapomínat na skutečnost, že rostliny pěstované ve stínu či v umělých podmínkách (např. ve sklenících - sklo nepropouští UV záření!) nemají dostatečně vyvinuté strukturní ani funkční ochranné mechanismy vůči působení UV záření a při jejich náhlém přemístění na volné prostranství může k poškození dojít. Viditelné záření (světlo) v oblasti vlnových délek 400 až 700 nm představuje energeticky nejbohatší část spektra slunečního záření a je listy rostlin velmi účinně absorbováno. K absorbci slouží hojné asimilační pigmenty napojené na centra zpracování zachycené energie ve fotochemickch procesech. Ne vždy však může být veškerá absorbovaná energie také skutečně využita. Plně osluněné listy absorbují mnohem více záření, než mohou fotochemicky zpracovat. Rostliny jejichž růst a metabolismus je zpomalen např. nízkými teplotami či nedostatkem vody, mají možnosti využití radiační energie ještě menší, přesto však i v jejich listech probíhá absorbce záření a přenos excitonů do asimilačních center. Zpracování velkých dávek absorbované radiační energie v chloroplastech je pro všechny rostliny velmi nebezpečná operace, neboť v relativně uzavřeném prostoru s vysokou koncentrací kyslíku se vytvářejí silná oxidační i redukční činidla, která mohou poškodit velmi jemné struktury tylakoidní membrány. K závažným změnám struktury a funkce fotosyntetického aparátu působením světla také skutečně běžně dochází - souhrnně jsou označovány jako fotoinhibice. Projevují se snížením jak maximální rychlosti fotosyntézy (při saturační ozářenosti), tak snížením hodnot kvantového výtěžku. Toto snížení bývá obvykle plně vratné, i když až po několika hodinách či dnech. Mechanismus vzniku fotoinhibice je v současné době velmi intenzivně studován a naše poznatky o něm nejsou tudíž zdaleka ještě úplné. Víme však, že nejvíce náchylný na poškození je fotosystém II, ve kterém dochází k oxidaci vody a k počátku přenosu uvolněného elektronu necyklickou cestou. Při nedostatečné rychlosti odvodu elektronů z fotosystému II (např. v důsledku hromadění nevyužitých produktů primárních procesů fotosyntézy, ATP a NADPH) zůstávají po delší dobu v plně redukovaném stavu volné plastochinony i chinony QA a QB. Nejsou tedy schopny přijímat elektron, který je předáván z chlorofylu P680 na feofytin. Rekombinací náboje mezi oxidovaným chlorofylem P680 a redukovaným feofytinem dojde k přechodu molekuly P680 do tripletního stavu. Následnou reakcí s běžným (tripletním) kyslíkem vzniká vysoce reaktivní singletní kyslík. Ten pak může způsobit poškození součástí elektontransportního řetězce ve fotosystému II a poškození vlastního proteinu D1. Popsaný sled událostí se označuje jako fotoinhibice na akceptorové straně a přítomnost kyslíku je zde nutná. Avšak i bez účasti kyslíku může dojít k fotoinhibici, a to zejména tehdy, když je omezena funkčnost centra štěpení vody a nelze tudíž zajistit dostatečně rychlou redukci molekuly chlorofylu P680. Tato molekula je po separaci náboje mimořádně silným oxidačním činidlem schopným poškodit součásti reakčního centra (fotoinhibice na donorové straně). K fotoinhibici může docházet i poškozením fotosystému I, ale již méně často. Také zde může vznikat tripletní molekula chlorofylu reakčního centra P700 a tím i reaktivní singletní kyslík. Dalším toxickým produktem necyklického transportu elektronů je superoxidový radikál, který vzniká přenosem elektronů z redukovaného ferredoxinu na kyslík (Mehlerova reakce, viz dále), a může poškodit redoxní systémy ve fotosystému I. Singletní kyslík, superoxid a další odvozené formy aktivního kyslíku vznikající jako vedlejší, nežádoucí produkty fotochemických procesů, mohou poškozovat nejen fotosystémy, ale i jiné součásti chloroplastu, včetně chlorofylu, membránových lipidů, enzymů a nukleových kyselin. Ochrana asimilačního aparátu před poškozením zahrnuje jednak regulační mechanismy které směřují k předcházení vzniku fotoinhibice, a jednak mechanismy směřující k nápravě škod, tedy zejména k rychlé obměně poškozených proteinů a k rychlému odstraňování reaktivních forem kyslíku. Zmíním se stručně alespoň o těch nejdůležitějších. a) snížení účinnosti funkce světlosběrných komplexů (antén). Asimilační pigmenty v anténách absorbují většinu dopadajícího záření a zachycenou energii jsou schopny s velkou účinností (až 85 % u fotosystému II) převést do reakčních center k využití ve fotochemických procesech. Zbývající část se ztrácí přeměnou na teplo (asi 10 %) a na fluorescenční záření (5 %). Přeměnou na teplo (nepřímo, reakcí s karotenoidy) jsou deexcitovány hlavně ty molekuly chlorofylu, které přešly do tripletního stavu. Karotenoidy v anténách za normálních podmínek tedy velmi účinně brání reakci tripletních chlorofylů s kyslíkem, která by vedla ke vzniku nebezpečného singletního kyslíku. V případě nadbytku radiační energie lze pozorovat aktivaci dalších systémů ochrany, jejichž smyslem je snížit množství energie převáděné z antén k reakčním centrům: • dochází ke strukturním změnám ve vnějších anténách fotosystému II, a sice k aglomeraci molekul chlorofylu, k agregaci proteinpigmentových jednotek a dokonce i k odpojení části antén od fotosystému II a k jejich přesunu k fotosystému I. • dochází k podstatnému zvýšení deexcitační činnosti karotenoidů, které přebírají a přeměňují na teplo energii nejen od tripletních, ale i od singletních excitovaných molekul chlorofylu, a v případě potřeby zneškodňují i singletní kyslík. Obě tyto reakce "automaticky", reversibilně a hlavně velmi rychle reagují na aktuální energetickou potřebu fotochemických procesů pomocí citlivosti na změny pH v lumen tylakoidu. Při nasycení fotochemických procesů zářením dochází k zvláště velkému nahromadění vodíkových iontů v lumen (není dostatek ADP pro tvorbu ATP) a nízké pH aktivuje enzymy které se podílejí na zmíněných změnách. Ochranná funkce xantofylů při přeměně nadbytku radiační energie na teplo je mimořádně významná - zvláště účinný je v tomto směru zeaxantin, který se vytváří snadnou deepoxidací z neúčinného violaxantinu právě jen za nadbytku záření a poklesu pH v lumen: Schéma funkce xantofylového cyklu při regulaci přeměn excitační energie ve světlosběrných komplexech. Aktivita deepoxidázy je stimulována nízkým pH (= za silného záření), naopak epoxidáza má optimální funkci při pH 7,5 a je tedy nejvíce aktivní za tmy či za velmi slabého záření. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 10 STRESOVÁ FYZIOLOGIE 11 b) snížení účinnosti vlastních fotochemických procesů. Hromadění produktů primárních procesů fotosyntézy, ať už v důsledku jejich příliš rychlé tvorby (vysoká ozářenost), nebo jejich malé spotřeby (zpomalení růstu působením stresu) vede ke zpomalení až zastavení fotochemických procesů, a tím i ke zvýšení nebezpečí fotodestrukce. Snížení účinnosti energetických přeměn v primárních procesech fotosyntézy, tedy i snížení rychlosti tvorby ATP a NADPH, může být v uvedených případech výhodné, neboť umožňuje zachovat po delší dobu transport elektronů. Jednou z cest ke snížení účinnosti primárních procesů by mohl být přenos části elektronů z plastochinonů na cytochrom b559, který je součástí fotosystému II, a jejich návrat zpět do reakčního centra na chlorofyl P680. O skutečné významnosti tohoto cyklického transportu ve fotosystému II u rostlin v přírodních podmínkách však dosud mnoho nevíme. Nepochybně významný je však jiný způsob "znehodnocení" transformované energie, a to v samém závěru lineárního transportu elektronů, které z redukovaného ferredoxinu nepostupují obvyklou cestou na NADP, nýbrž redukují kyslík (Mehlerova reakce). Vznikající silně reaktivní superoxid je ale nutno velmi rychle inaktivovat pomocí enzymu superoxiddismutázy a navazující série reakcí v přítomnosti antioxidačních substrátů, askorbátu a glutationu, kterých je v chloroplastech vždy velké množství. Reakce již byly schematicky znázorněny na straně 7. Je zřejmé, že se při nich spotřebovává i jisté množství NADPH. Zachování lineárního toku elektronů pomocí Mehlerovy reakce i při nedostatku obvyklého akceptoru (NADP) pomáhá tedy udržovat transport protonů do lumen tylakoidu. Nízké pH v lumen, jak již víme, má zásadní důležitost pro správnou funkci dalších ochranných mechanismů, především xantofylového cyklu. c) snížená rychlost opravy fotosystému II. Poškození proteinu D1 ve fotosystému II je nejčastějším průvodním znakem fotoinhibice. Současně je však možná i jeho velmi snadná výměna (syntéza probíhá v chloroplastu a je mimořádně rychlá!). K výměně poškozeného proteinu se však musí celý fotosystém přemístit z přitisknuté (granální) části tylakoidní membrány do volné (stromatální) části. Ukazuje se, že snadná inaktivace proteinu D1 může být vlastně velmi účinným způsobem ochrany ostatních částí chloroplastu před poškozením. Proces obnovy proteinu D1 je totiž zajímavě regulován. Jeho syntéza se zrychluje se vzestupem ozářenosti, ovšem po dosažení saturačních hodnot se opět zpomaluje. Většina inaktivovaných fotosystémů zůstává za nadměrné ozářenosti ve granální části membrán a absorbované záření se v nich přeměňuje na teplo. Teprve po poklesu ozářenosti přestávají plnit ochrannou funkci a jsou rychle opraveny. Stresové účinky příliš vysokých a nízkých teplot Vliv vysokých teplot Při zvýšení teploty zhruba nad 40°C dochází u většiny druhů rostlin k zásadním změnám ve fyzikálně-chemických vlastnostech buněčných membrán i proteinů. U některých zvláště citlivých druhů lze tyto změny zaznamenat již v teplotním intervalu 35 až 40°C. Lipidová vrstva membrán přechází do lamelárně-kapalného (superfluidního) stavu, ve kterém nemůže plnit svoje základní funkce. Stává se propustnou pro ionty a přestává poskytovat dostatečně pevnou oporu pro membránové proteiny. U proteinů (nejen membránových) dochází navíc za vysoké teploty ke změnám konformace a tím i ke ztrátě jejich funkce. K nejdříve postiženým pravidelně patří thylakoidní membrány v chloroplastech. Velmi nápadným indikátorem vznikajícího stresu je poškození fotosystému II, které lze lehce zjistit měřením fluorescence chlorofylu in vivo. Za zvyšující se teploty dochází nejprve k rozpadu jednotlivých částí fotosystému (především k odtržení světlosběrných komplexů), a teprve až později k denaturaci proteinů. Jinou rychlou metodou k určování stupně odolnosti k vysokým teplotám je mikroskopické pozorování buněk za postupného zvyšování jejich teploty. Dosažení kritické teploty se projeví zastavením proudění cytoplazmy v důsledku rozpadu cytoskeletu. Teplotní rozmezí přechodu membránových lipidů do tekutého stavu, vedoucí ke ztrátě funkčnosti membrány, závisí hlavně na jejich chemickém složení. Ke zvýšení kritické teploty (a tím i ke zvýšení odolnosti k vysokým teplotám) přispívá vyšší podíl nasycených mastných kyselin (v poměru k nenasyceným kyselinám), a také vyšší obsah sterolů v lipidové vrstvě. Stavová změna lipidové vrstvy je vratná a při poklesu teploty pod kritickou hodnotu dochází rychle k obnovení původní struktury a funkce. Poškození termolabilních proteinů, včetně enzymů s klíčovým postavením v metabolických a transportních procesech, je mnohdy nevratné a je nutné je nahradit novými. Obnova normálního provozu buňky po snížení teploty tedy závisí na tom, do jaké míry zůstala zachována funkčnost proteosyntetického aparátu. Celkový stupeň poškození buněk je dán součinem aktuální teploty a doby jejího působení. Při teplotách nad 50 až 55°C i krátkodobé působení, trvající několik desítek minut, způsobuje nevratné poškození exponovaného orgánu a jeho odumření. K vzácným výjimkám patří některé vytrvalé druhy rostlin z teplých pouští a polopouští. Zejména pak sukulenty, které se velmi špatně "zbavují" tepla jak konvekcí (malý povrch), tak i výparem (mají zavřené průduchy v nejteplejší části dne). U několika druhů nopálu (Opuntia) bylo dokázáno úspěšné přežití teplot 60 až 65°C po dobu několika desítek minut. To už je ale skutečně horní hranice termotolerance pro eukaryotní organizmy v aktivním stavu; odolnější jsou již jen některé sinice a bakterie žijící např. v horkých pramenech při teplotách blízkých bodu varu. V dormantním stavu mají rostliny vyšší odolnost k přehřátí než za aktivního růstu. Zcela mimořádně odolná jsou semena, která v některých případech přežívají bez poškození krátkodobé zvýšení teploty na 120°C. Semena některých druhů rostlin z oblastí s častým výskytem požárů dokonce takové teploty vyžadují ke stimulaci klíčení. Aklimační reakce na zvýšenou teplotu lze pozorovat již za necelou hodinu od začátku působení, a to především ve výrazných změnách v zastoupení proteinů. Ke změnám chemického složení membrán dochází pomaleji, obvykle až za několik dní. Díky aklimačním změnám může být kritická teplota posunuta až o pět stupňů . Proteiny indukované zvýšenou teplotou (heat shock proteins, HSP) patří k nejdéle známým a také k evolučně nejstarším, neboť řada z nich se vytváří při zvýšení teploty (přibližně nad 35 °C) jak u rostlin a živočichů, tak i u bakterií a hub. K indukci jejich tvorby dochází po navázání specifických proteinů regulujících transkripci (heat-shock factors) na příslušné úseky DNA (heat-shock elements) v těsné blízkosti genů pro HSP. Regulační proteiny jsou přítomny v buňkách stále, ovšem v nefunkčním stavu, a. k jejich aktivaci dojde až po náhlém zvýšení teploty. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 12 Závislost rychlosti růstu na teplotě u mladých rostlin prosa (C4 rostlina s optimem růstu za vyšších teplot!). Plná čára - kontrolní rostliny pěstované při teplotě 35°C, čárkovaně jsou vyznačeny reakce rostlin vystavených 24 hodin před měřením teplotě 45°C (po dvě hodiny). Poškození rostlin chladem Mnoho tropických a subtropických rostlin, u nás pak některé užitkové rostliny původem z teplejších oblastí (např. okurky, rajčata, papriky a kukuřice), mohou být vážně poškozeny nízkými teplotami ještě nad bodem mrazu (chladem). Doba po kterou chlad působí je velmi důležitá. Například listy okurky jsou poškozeny při teplotě +10°C až po týdenní expozici, při +8°C již za 3 dny a při +3°C již během několika hodin. Velmi citlivé na chlad jsou také květní orgány v raném stadiu vývoje a v průběhu gametogeneze, a to i u rostlin, jejichž vegetativní orgány na chlad citlivé nejsou. Většina proteinů není nízkými teplotami poškozována, a tak primární účinky nepříznivého působení chladu je nutno hledat především ve změně fyzikálně-chemických vlastností membrán. Pokud jejich lipidová vrstva přejde z optimální polotekuté konzistence do stavu pevného gelu, nedaří se již udržovat dokonalou celistvost membrány, a to zejména v důsledku oslabení vazby lipidů k membránovým proteinům. Volná propustnost membrán pro ionty vede ke ztrátě transmembránového potenciálu, k zastavení selektivního a aktivního transportu, a také k poruše osmotických funkcí, včetně udržování turgorového tlaku. Propustnost thylakoidních membrán v chloroplastech a vnitřní membrány mitochondrií znemožňuje nahromadění vodíkových iontů při transportech elektronů, a není tudíž možné vytvářet ATP pomocí H+ -ATP-syntáz. Po jisté době trvání tohoto stavu (několik hodin až dní) musí nutně dojít k vyčerpání energetických zdrojů a k odumření buňky. K poruše struktury a funkce membrán při působení chladu může dojít i nepřímo peroxidací membránových lipidů. Nebezpečí oxidativního poškození membrán vzrůstá za nízkých teplot hlavně proto, že jsou zpomaleny až zastaveny růstové procesy. Hromadění nevyužitých produktů fixace CO2 v chloroplastech působí inhibičně na tvorbu produktů fotochemických procesů a přebytek excitační energie vede k tvorbě reaktivních forem kyslíku. Obecné zpomalení všech biochemických procesů za nízkých teplot vede, kromě jiného, i ke snížení rychlosti syntézy antioxidačních substrátů, což jen přispívá ke zvýšení nebězpečí oxidačního poškození. Za nízkých teplot bývají zjišťovány i změny ve struktuře cytoskeletu (depolymerace mikrotubulů). Z organel jsou nejcitlivější na nízké teploty chloroplasty, méně již mitochondrie a peroxisomy. Tonoplast a plazmatická membrána patří k relativně nejvíce odolným buněčným strukturám. Aklimační změny za nízkých teplot jsou spojeny s hromaděním osmoticky aktivních látek, s tvorbou stresových (chladových) proteinů, s tvorbou "antioxidačních" enzymů a substrátů, a se změnami chemického složení lipidové vrstvy membrán. Zvyšuje se v ní zastoupení nenasycených mastných kyselin, které vede ke snížení kritické teploty přechodu lipidů do gelového stavu. Na řízení aklimačních změn se podílejí i některé fytohormony, ze kterých nejvýznamnější úlohu má kyselina abscisová. Změny struktury biologických mebrán pod vlivem nízké teploty STRESOVÁ FYZIOLOGIE 13 STRESOVÁ FYZIOLOGIE 14 Poškození rostlin mrazem Při poklesu teplot pod nulu °C (= mráz) již voda může přejít do pevného skupenství, což představuje pro všechny rostliny vážné nebezpečí. Toto nebezpečí vyplývá nejen z možného mechanického poškození buněk krystalky ledu, ale i z náhlého snížení tenze vodních par nad ledovými krystalky (tedy velké "suchosti" vzduchu). Led se může tvořit ve všech vodou bohatých strukturách, v symplastu i v apoplastu, tedy i v cévách a sítkovicích. Led vytvořený uvnitř živých buněk vede téměř vždy k jejich rychlému odumírání, ovšem tento typ mrznutí se však vyskytuje jen výjimečně u zcela neodolných rostlin či při velmi rychlém poklesu teploty. Daleko nejčastěji dochází k tvorbě ledu jen v apoplastu, tedy především v buněčných stěnách a ve xylému. Voda v apoplastu rostlin začíná mrznout při teplotách -1 až -3°C, v závislosti na obsahu osmotik, které snižují bod tuhnutí. Avšak ani při teplotách nižších než je očekávaný bod tuhnutí nemusí ještě nutně dojít k tvorbě ledu. Pokud nejsou přítomná vhodná krystalizační jádra, zůstává voda v apoplastu i v symplastu v tekutém podchlazeném (metastabilním) stavu, a to v krajním případě až do teploty -38°C, kdy už dochází ke spontánní krystalizaci. K iniciaci krystalizace podchlazené vody v apoplastu mohou přispívat i látky (včetně specifických proteinů) vylučované do prostředí některými druhy bakterií, které žijí na povrchu listů (např. Pseudomonas syringae, Erwinia herbicola - jejich odstranění vede k výraznému zvýšení odolnosti k mrazu!). Při delší době trvání mrazu se krystalky ledu postupně rozrůstají. Růst krystalů je podporován transportem vody z cytosolu v důsledku značně nízkého vodního potenciálu na povrchu ledu (při -5°C jen asi -6 MPa!). Při překročení jisté hranice procesu mrznutí, která je specifická pro různá pletiva a druhy, dochází k nevratnému poškození buněk. Bezprostřední příčinou odumírání může být jednak silná dehydratace buněčného obsahu, jednak roztržení buněčné stěny a plazmalemy krystalky ledu z apoplastu. Pronikající krystaly také indukují tuhnutí zbytků tekuté vody udržované v podchlazeném stavu uvnitř buňky. Odolnost rostlin vůči mrazu (mrazuvzdornost) je založena v prvé řadě na schopnosti zabránit vzniku ledu uvnitř buněk (v symplastu) a dlouhodobě tolerovat přítomnost ledu v apoplastu (omezit jeho mechanické i dehydratační účinky). Snížení bodu tuhnutí roztoků v symplastu je možné přítomností velkého množství osmoticky aktivních látek (cukrů, aminokyselin, polyalkoholů ...). Tyto sloučeniny mají současně i významný vliv na tlumení negativních účinků dehydratace (společně s některýni stresovými proteiny, viz níže). Další možností je schopnost udržovat po dlouhou dobu vodu v symplastu v tekutém podchlazeném stavu, což je podmíněno odstraněním všech látek, které by mohly sloužit jako krystalizační jádra. K omezení destrukčních účinků ledu vznikajícím v apoplastu. je nutná zvýšená mechanická pevnost buněčné stěny. Odolnost k extrémně nízkým teplotám (pod -25 až -30°C) je vždy spojena se schopností snášet silnou dehydrataci buněk (vakuoly téměř mizí, voda zůstává v tenkých zbytcích cytosolu okolo organel a plazmalemy). Bližší popis mechanismů, na kterých je založena tolerance značného vyschnutí cytosolu, je uveden v následující kapitolce věnované vlivu nedostatku vody na rostliny. Proteiny indukované nízkou teplotou mají mimořádně významnou úlohu při zvyšování odolnosti vůči chladu a mrazu. Časté jsou glykoproteiny a několik typů silně hydrofobních proteinů s velmi účinnou schopností chránit některé enzymy před denaturací. Nízkou teplotou je indukována exprese celé řady genů, která vede k syntéze jak kryoprotektantů a odolnějších enzymů, tak i strukturních proteinů. Tak například v buněčných stěnách hrachu se po několikadenním pěstování za teploty 2 °C zdvojnásobilo množství proteinů bohatých na hydroxyprolin (především extensin), které zpevňují buněčnou stěnu o tím omezují poškození při mrazové dehydrataci. Chladem a se také indukují specifické enzymy lipidového metabolismu, jejichž činností dochází ke změnám složení lipidové vrstvy membrán. Zvláštní skupinu tvoří protimrazové proteiny (antifreeze proteins), které se objevují v hojném množství v apoplastu mrazuvzdorných druhů po indukci nízkou teplotou. Mají unikátní schopnost přilnutí (adsorbce) na povrch vznikajících krystalků ledu. Přístup dalších molekul vody ke krystalku je pak omezen a jeho růst se velmi zpomalí. Tímto způsobem je také inhibována rekrystalizace ledu, při které přednostně rostou velké krystaly na úkor malých. Při vzniku velkých krystalků vždy vzrůstá nebezpečí mechanického poškození buněčné stěny a plazmatické membrány. Dosažení vysoké odolnosti k nízkým teplotám je spojeno s utlumením většiny buněčných funkcí a vlastní proces dehydratace musí probíhat pomalu, řízeně. Nelze jí tedy dosáhnout náhlým poklesem teploty ani trvale udržovat jako konstituční znak. Odolnost vůči mrazu má z těchto důvodů silně sezónní charakter. I ty druhy, které jsou v zimním období vysoce odolné (naše jehličnaté dřeviny, ozimé obiloviny, aj.), by v letních měsících utrpěly vážné poškození při náhlém poklesu teplot pod -3 až -4°C. Proces zvyšování odolnosti vůči mrazu (otužování) má u různých druhů odlišný charakter. Nejsložitější bývá u dřevin, kdy k zastavení růstu a k některým dalším přípravným změnám dochází již koncem léta. Pod vlivem postupně se snižujících denních teplot a zkracování délky dne dochází pak k plynulému zvyšování odolnosti až do nástupu zimních mrazů. U většiny mrazuvzdorných bylin je indukce odolnosti rychlejší a jednodušší, obvykle stačí několik dnů s teplotami blízkými nule. Indukce odolnosti vůči mrazu je podmíněna přítomností kyseliny abscisové ve zvýšené koncentraci a dostatkem asimilátů. Průběh změn v odolnosti vůči mrazu u rostlin Arabidopsis thaliana po přenesení do kultivačního boxu s teplotním režimem 4°C ve dne a 2°C v noci. Z obrázku je zřejmá jednak rychlost aklimačních změn, a jednak neschopnost aklimace rostlin s poruchou tvorby kyseliny abscisové (ABA). Po ošetření rostlin postřikem ABA k aklimaci došlo. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 15 Vliv nedostatku vody na funkce rostlin Ze všech abiotických faktorů, které omezují růst a produktivitu rostlinstva na kontinentech naší planety, stojí na prvním místě nedostatek vody. Voda, na rozdíl od minerálních živin, má velmi rychlý koloběh v ekosystémech a její zásoba v rostlinách i v půdě stačí jen na poměrně krátkou dobu. Doplňování zásob vody srážkami bývá obvykle nepravidelné, náhodné, a nejsou tedy vyloučeny ani delší periody sucha. Navíc vodní potenciál vzduchu v okolí listů je po jistou část dne velmi nízký, a proto terestrické rostliny ve všech typech prostředí jsou ohroženy vodním stresem. K udržení maximální rychlosti růstu je zapotřebí udržovat plně turgescentní stav buněk, což se však v denních hodinách daří jen velmi zřídka. Příjem oxidu uhličitého pro fotosyntézu otevřenými průduchy je obvykle spojen s takovou ztrátou vody, jakou nelze okamžitě nahradit. Nejvíce postiženým orgánem jsou vždy listy. U běžných mezofytních druhů rostlin hodnoty vodního potenciálu listů do -0,5 MPa indikují působení mírného vodního stresu, od -0,5 do - 1,5 MPa stres středně velký. Při hodnotách pod -1,5 MPa jde o stres velmi silný, při kterém již často klesá turgorový tlak v buňkách listů na nulu a listy začínají vadnout. Nejcitlivější reakce na nedostatek vody bývá pravidelně zjišťována u dlouživého růstu buněk postižených orgánů. Je to pochopitelné, vždyť rychlost růstu je od jisté prahové hodnoty lineárně závislá na turgorovém tlaku. K měřitelnému zpomalení růstu dochází již při velmi malé ztrátě vody, kdy turgor klesne jen o 0,1 až 0,2 MPa z maximální hodnoty (tomu odpovídá pokles vodního potenciálu z nuly na přibližně -0,1 až -0,2 MPa). Úplné zastavení růstu nastává při poklesu turgoru na prahovou hodnotu pro růst, která leží obvykle mezi 0,3 až 0,4 MPa. K zastavení růstu tedy dojde dříve než ke zjevnému vadnutí listu (nulový turgor), či k ovlivnění hlavních metabolických procesů včetně fotosyntézy. V důsledku toho se v rostlině hromadí nevyužité asimiláty. Při dalším poklesu vodního potenciálu buněk zhruba na hodnotu -0,2 až -0,8 MPa dochází k rychlým změnám aktivity enzymů. Aktivita některých se snižuje (např. nitrátreduktázy), u jiných naopak stoupá ( α-amyláza, ribonukleáza a některé dalších hydrolázy). To má za následek změny v rychlosti mnoha procesů, dochází např. ke zrychlení hydrolýzy škrobu a naopak ke zpomalení redukce nitrátů. Dále je snížena tvorba cytokininů a zpomaluje se buněčné dělení. Rozdíly mezi citlivostí růstových procesů a fotosyntézy na pokles vodního potenciálu u slunečnice. Přibližně ve stejném rozmezí hodnot vodního potenciálu dochází v buňkách k velmi podstatnému (až čtyřicetinásobnému) zvýšení koncentrace kyseliny abscisové, zejména v listech, kde má za následek zavírání průduchů. Změna v otevřenosti průduchů pak vede ke snížení rychlosti výměny plynů, a tím i rychlosti fotosyntézy a transpirace. Existuje řada důkazů, že zvýšení koncentrace kyseliny abscisové je při působení vodního stresu řízeno poklesem turgorového tlaku přes receptory mechanického napětí v plazmatické membráně, STRESOVÁ FYZIOLOGIE 16 STRESOVÁ FYZIOLOGIE 17 nikoli tedy přímo změnami termodynamického stavu (chemického potenciálu) vody. Při větším poklesu vodního potenciálu k hodnotám okolo -1,0 MPa dochází u mnoha druhů k tvorbě aminokyseliny prolinu, jejíž koncentrace se zvyšuje často až stonásobně. Některé druhy reagují syntézou jiných metabolitů, zejména cukrů, složitějších alkoholů (polyolů) a kvartérních dusíkatých sloučenin (betainy). Tyto syntézy vedou k výraznému zvýšení osmotického tlaku v buňkách (tzv. osmotické přizpůsobení, angl. osmotic adjustment), které umožňuje osmotický příjem vody do buněk i za klesajícího obsahu vody (a tím i sníženého vodního potenciálu) v apoplastu (včetně xylému) a v půdě okolo kořenů. Zmíněné organické sloučeniny nenarušují ani ve větší koncentraci enzymatické procesy v buňkách (= kompatibilní osmotika) a hrají také významnou úlohu pri ochraně hydratačních obalů buněčných makromolekul (proteinů, nukleových kyselin) a biomembrán. Jestliže se vodní potenciál listů dále snižuje (od -1,0 do -2,0 MPa), dochází již u běžných mezofytních rostlin k vážným metabolickým změnám. Rychlost fotosyntézy klesá na nulu a zpomalují se vnitrobuněčné transportní procesy. Aktivita hydrolytických procesů (a někdy i rychlost respirace) se obvykle naopak zvyšuje. Překvapivě málo citlivé k vodnímu stresu jsou dálkové transportní procesy v lýku. To umožňuje rostlinám i při velkém vodním deficitu mobilizovat rezervy organických látek ve starších orgánech a přesunout je do mladších, zejména pak do generativních orgánů k dokončení reprodukčního procesu. Pokud v této pokročilé fázi vodního stresu dojde k doplnění ztrát vody, všechny buněčné funkce se postupně vracejí do normálního stavu, i když tento návrat není okamžitý (obvykle trvá několik dní). V případě delšího trvání nedostatku vody může silnou dehydratací dojít k tak vážným změnám (především funkce membrán a organel), že odumření orgánu či celé rostliny je nevyhnutelné. Uvedené komplexní změny metabolických procesů v průběhu působení nedostatku vody jsou spojeny s regulací genové aktivity, na které bezprostředně závisí zvyšování či snižování rychlosti tvorby enzymů i strukturních proteinů, nepřímo pak rychlosti tvorby ostatních metabolitů. Kyselina abscisová patří k významným mediátorům exprese genů pro stresové proteiny za nedostatku vody. Proteiny indukované dehydratací (dehydration-induced proteins) jsou do značné míry podobné skupině chladových proteinů a také skupině stresových proteinů indukovaných vysokým obsahem solí v půdě. Je to pochopitelné, protože jak za nízkých teplot, tak při zasolení půdy jsou rostliny ohroženy dehydratací buněk. Je ale potřeba upozornit na to, že tvorba části chladových proteinů je indukována pouze nízkou teplotou a nikoliv dehydratací či kyselinou abscisovou. Dehydratace vyvolává především tvorbu enzymů nezbytných pro zvýšení syntézy osmoticky aktivních látek. Tak např. k syntéze glycinbetainu z cholinu je nutná cholinmonoesteráza a betainaldehyddehydrogenáza. Podstatně se zvyšuje tvorba řady enzymů metabolismu sacharidů, což vede k hromadění jednoduchých cukrů a fruktanů. Jejich významná úloha pro zachování funkčnosti membrán a stabilizaci struktury proteinů i za pokročilého vodního stresu byla již mnohokrát dokázána. Zvláštní skupinou asi dvaceti stresových proteinů které se nově vytvářejí při nedostatku vody v buňkách jsou dehydriny. Jsou prakticky totožné s proteiny které se hromadí při normálním (tedy nestresovém) procesu zasychání embrya v dozrávajících semenech, a pro které bylo již dříve zavedeno označení LEA-proteiny (Late Embryogenesis Abundant proteins). Nejčastěji se jim přisuzuje funkce ochrany strukturní integrity proteinů, nukleových kyselin a membrán (udržováním hydratačních obalů), a také spoluúčast na reparaci poškozených buněčných struktur.Tvorba dehydrinů je regulována fytohormonálně (především kyselinou abscisovou a brassinosteroidy). Pro přežití silné dehydratace jsou naprosto nezbytné. Suchovzdorné rostliny (xerofyty nesukulentního typu), rostoucí v aridních oblastech (pouště, polopouště), obvykle tolerují mnohem větší pokles obsahu vody v buňkách než mezofytní druhy z oblastí na srážky bohatších. Extrémním případem suchovzdornosti jsou druhy, které snášejí téměř úplné vyschnutí bez vážného poškození. Tuto obdivuhodnou schopnost mají nejen některé evolučně starší skupiny organismů (řasy, lišejníky a některé mechy), ale i některé cévnaté rostliny - jednak kapradin (asi 200 druhů), ale i krytosemenných (asi 100 druhů, např. z čeledí Poaceae, Cyperaceae, Scrophulariaceae, Gessneriaceae), rostoucích hlavně v aridních oblastech Afriky a Austrálie. U některých z nich byla dokázána úspěšná regenerace všech orgánů i po několikaměsíčním uložení v téměř absolutně suchém vzduchu. Funkční podstata vysoké odolnosti je založena na několika současně přítomných strukturně-funkčních znacích (předpokladech). Je nutno zejména: • zabránit mechanickému poškození plazmatické membrány a plazmodesmat, • obnovit funkčnost xylému po úplném zavzdušnění (kavitaci) cév, • zabránit destrukci membrán a proteinů při ztrátě vody z hydratačních obalů, • zabránit oxidačnímu poškození buněčných struktur reaktivními formami kyslíku. Je potřeba zdůraznit, že schopnost tolerovat vyschnutí měly všechny prvotní terestrické rostliny. V průběhu evoluce však pokročilejší skupiny rostlin byly schopny dlouhodobě udržovat vodu ve svých tělech, jednak jejím efektivnějším příjmem a transportem (rozvoj kořenů, vznik xylémové transportní soustavy), jednak omezením ztrát výparem (tvorba kutikuly, průduchová regulace). U těchto skupin rostlin pak došlo ke ztrátě schopnosti tolerovat vyschnutí, ovšem genetická informace pro tuto schopnost zůstala v jejich genomu zachována. Došlo tedy ve skutečnosti jen ke ztrátě vybavování genetické informace, která se může opět obnovit vhodným procesem indukce: Popsaná tolerance k velkým ztrátám vody je vcelku pasivní adaptační strategie (ve smyslu překonávání období s nedostatkem vody v téměř inaktivním stavu). Je výhodná v oblastech se silnou periodicitou srážek, kde růst a reprodukce může proběhnout v příznivější části roku. Pokud ovšem silný vodní stres působí trvale po celý rok, pak dočasný útlum životních procesů nic neřeší. V takových podmínkách musí být rostliny schopny nejen přežívat, ale i vytvářet dostatečné množství asimilátů pro svůj růst. Úspěšnost adaptace je tím větší, čím více uhlíku se jim podaří fixovat na jednotku vydané vody. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 18 K minimalizaci ztrát vody při příjmu nezbytného množství CO2 pro fotosyntézu slouží v prvé řadě průduchová regulace výměny plynů mezi listem a okolním vzduchem. Její základní principy byly již dříve vysvětleny. Zbývá jen dodat, že i u rostlin rostoucích na stejném stanovišti bývá obvykle velká mezidruhová variabilita v reakcích průduchů na vodní stres. Již zmíněný mechanismus zavírání průduchů, spouštěný snížením turgoru a přenosem signálu pomocí kyseliny abscisové, je kupodivu častější u mezofytů než u xerofytů. U této druhé skupiny bývá zato vyvinuta extrémně citlivá zavírací reakce působením snížené vlhkosti STRESOVÁ FYZIOLOGIE 19 vzduchu přímo na svěrací buňky (tedy i za plné turgescence mezofylových buněk!). Na druhé straně jsou však známy xerofytní druhy, které zavírají průduchy až při značné ztrátě vody, při hodnotách vodního potenciálu okolo -4 až -5 MPa. Nejčastěji však u xerofytů dochází k zavírání průduchů při -1 až -2 MPa, zatímco u mezofytů při -0,5 až -1,0 MPa. Mimořádně účinnou adaptací k omezení ztrát vody při asimilaci uhlíku jsou varianty fixačních cest typu C4 a CAM, které se hojně vyskytují u rostlin ve všech aridních oblastech. Jak již víme z výkladu o biochemické podstatě těchto fixačních cest, dochází při jejich fungování ke zvýšení koncentrace CO2 v okolí chloroplastů. Současně však, díky vysoké afinitě PEP-karboxylázy, bývá snížena koncentrace CO2 v intercelulárách listů. Při stejné otevřenosti průduchů je u rostlin typu C4 rychlejší tok CO2 do listů, a tudíž transpirační spotřeba vody na jednotku vytvořené sušiny (transpirační koeficient) je podstatně menší než u rostlin typu C3: typ rostliny transpirační koeficient [kg (vody). kg-1 (sušiny)] C3 500 - 800 C4 200 - 350 CAM 50 - 100 Sukulentní rostliny vybavené metabolickou cestou CAM jsou ze všech rostlin nejdokonaleji adaptované k úspornému hospodaření s vodou. Je nutno zdůraznit, že hlavní podíl na jejich úspěšnosti nemají zásoby vody ve zdužnatělých orgánech, ale právě metabolismus CAM, umožňující ponechat průduchy ve světelné periodě dne zcela uzavřené. Koncentrace osmoticky aktivních látek je u nich pravidelně velmi malá, a tím i možnost většího snížení vodního potenciálu při zachování turgescence není možná. Nemohou proto přijímat vodu z tak suché půdy jako jiné xerofyty a jsou odkázány pouze na rychlý příjem při náhodných srážkách. Existuje však celá řada adaptačních mechanismů, které usnadňují rychlé a účinné využití srážkové vody (např. rychlý růst tenkých sorpčních kořenů kaktusů po ovlhčení půdy, okamžité naplnění kapacity velamenu u kořenů orchidejí či příjem vody sorpčními šupinami na povrchu listů bromélií). Fixační cesta CAM u sukulentních rostlin umožňuje udržovat fotosyntetickou aktivitu a pozitivní uhlíkovou bilanci i v podmínkách, kdy je příjem vody dočasně zastaven. Tyto rostliny mají také možnost dlouhodobě uzavřít průduchy a provádět vnitřní recyklaci uhlíku. Jde tedy o vynikající adaptaci pro podmínky extrémního sucha, ovšem v méně extrémních podmínkách není již tak prospěšná. I v případě přechodu na přímou efektivnější fixaci CO2 (u fakultativních CAM-rostlin) nelze změnit základní morfologické charakteristiky nevýhodné pro rychlý růst (zdužnatělé orgány s malým asimilačním povrchem) a sotva proto mohou obstát v kompetici s rychleji rostoucími druhy. Vliv nedostatku minerálních živin v prostředí Nejpotřebnějšími prvky pro růst rostlin jsou uhlík, kyslík a vodík, které tvoří více než 90% biomasy. Rostlina je přijímá hlavně v plynné formě ze vzduchu (CO2, O2), a také z vody. Všechny ostatní nezbytné prvky (= minerální živiny) získává rostlina z půdy, kde se vyskytují ve formě solí. Dostupné množství těchto prvků v půdě však mnohdy nestačí pokrýt potřebu rostlin, a pak dochází ke zpomalení růstu až k vážnému poškození. Za nezbytné prvky považujeme ty, bez kterých rostlina nemůže dokončit svůj životní cyklus, neboť jsou složkou některé nepostradatelné sloučeniny v rostlinném organismu. K nim patří v prvé řadě (kromě C, H, O), šest makroživin (makroelementů): N, P, K, Ca, Mg, S, jejichž obsah v jednom kilogramu sušiny rostlinné biomasy obvykle přesahuje jeden gram. Podstatně nižší zastoupení (obvykle méně než 0.1 g.kg-1) mají některé další prvky, označované jako mikroživiny (mikroelementy). Nepochybně nezbytné pro všechny rostliny jsou Fe, Cl, B, Mn, Zn, Cu, Mo, Ni, i když v některých případech (např. u niklu) zásoba v semenech postačuje k pokrytí potřeby i více generací. Kromě uvedených minerálních živin známe ještě několik prvků, které pro rostliny nejsou sice nezbytné, ale pro jisté skupiny rostlin jsou velmi prospěšné (benefiční), neboť stimulují jejich růst a zvyšují jejich odolnost ke stresům. K takovým prvkům patří např. Na, Si, Co, Se. Obsah makroživin, mikroživin a benefičních prvků v sušině lučních rostlin. Sloupečky udávají obvyklý rozsah variability hodnot (bez extrémů) u různých druhů rostlin v různých typech prostředí. Jen velice vzácně může dojít k tomu, že by některý z nezbytných prvků v půdě zcela chyběl. Častějším případem je snížená koncentrace v přijatelné iontové formě. Způsob, jakým se projeví nedostatek živiny závisí zejména na tom, jakou má v rostlině funkci a jak snadno může být translokována ze starších orgánů do mladších. Nedostatek živin se obvykle projevuje mnohem pomalejší změnou funkcí rostliny, jako tomu bývá u jiných stresových faktorů. Nejčastěji pozorujeme zpomalení růstu, fotosyntézy a jiných procesů až po několikadenním působení. Rostliny mívají jistou část živin uloženou v zásobních formách, ze kterých mohou čerpat při jejich náhlém nedostatku v půdě. Také sama půda má značné tlumící schopnosti dané postupným doplňováním odčerpaných živin mikrobiální dekompozicí půdní organické hmoty, zvětráváním minerálních částic a uvolňováním iontů živin ze slabých vazeb na koloidních částicích sorpčního komplexu půdy. Změny v rychlosti růstu, ve tvaru a v barvě orgánů, či dokonce jejich zrychlené stárnutí a odumírání lze pozorovat jen při velmi vážném nedostatku živin. Proto vizuální diagnóza poruch v minerální výživě není spolehlivá. Analýza obsahu živin v půdě také neposkytuje dostatečně uspokojivou informaci o jejich možném nedostatku pro rostliny. Ne vždy je totiž možné stanovit chemickou analýzou půdních extraktů skutečnou dostupnost živin pro kořeny. Analýza rostlin (obvykle listů) je již spolehlivější, i když i tento přístup má svoje úskalí. Především je nutno empiricky zjistit, jaký je vlastně optimální obsah té které živiny v biomase rostliny pro zajištění všech funkcí. Potíž je právě v tom, že optimální hodnoty (či spíše rozmezí hodnot) obsahu jednotlivých živin jsou silně závislé na druhu a stáří rostlin, a navíc jsou ovlivňovány vzájemnými interakcemi (mezi jednotlivými živinami). Užitečné informace lze získat i pomocí biochemických metod, neboť nedostatek některých mikroživin se projevuje velmi specifickými změnami enzymatické aktivity (viz dále u jednotlivých prvků). Mladé, rostoucí části rostlin získávají minerální živiny nejen přímo z půdy, ale i z jiných, stárnoucích orgánů. To je velmi časté u těch prvků, které nejsou zabudovány v příliš pevných vazbách. K prvkům s velkou mobilitou uvnitř rostliny patří dusík, fosfor, draslík, hořčík a STRESOVÁ FYZIOLOGIE 20 STRESOVÁ FYZIOLOGIE 21 Draslík je prvek, jehož nedostatek v přírodě bývá mnohem méně častý než v případě dusíku a fosforu. Obsah draslíku v půdě velmi závisí na typu matečné horniny - živce, slídy i některé jíly mají draslíku dostatek a půdy na nich vzniklé jsou jím bohatě zásobeny. V případě nedostatku draslíku je silně omezen růst všech orgánů, vytvářejí se malé plody a hlízy, na listech vznikají nekrózy (od špičky a okrajů směrem k bázi). Stonky i kořeny jsou slabé a málo odolné vůči infekci i vůči jiným stresovým faktorům (sucho, mráz). Draslík není stavební součástí žádných trvalých struktur, ale přesto je nejhojnějším kationtem v rostlinných tekutinách (100 až 200 mM, jak v cytosolu, tak i ve vakuolách a v chloroplastech). V rostlinách není metabolizován, nevytváří chlor. Jsou snadno translokovány především ze starých listů do mladých (a také do plodů), proto první příznaky nedostatku se objeví u starých listů. Mnohem menší mobilitu má síra, zinek, mangan a měď. Vápník, železo a bor jsou po zabudování do biomasy téměř imobilní. Jejich nedostatkem proto trpí nejvíce listy mladé. Podívejme se nyní na nejzávažnější následky nedostatku jednotlivých živin. Dusík je nejdůležitější ze všech minerálních živin - je přijímán z půdy v daleko největším množství a jeho hmotnostní podíl v biomase rostlin bývá obvykle 2 až 4 %. Přijatelných forem dusíku (hlavně nitrátových a amonných iontů) je v půdě vždy jen omezené množství, které navíc velice kolísá v závislosti na činnosti půdní mikroflóry. Proto je v přírodě růst rostlin téměř vždy do jisté míry omezován nedostatkem dusíku. Průvodním znakem většího nedostatku je pokles obsahu bílkovin. Velmi nápadný je také snížený obsah chlorofylu. Listy, zvláště ty starší, jsou světleji zelené, později žloutnou a usychají. Úměrně s poklesem obsahu dusíku v listech se snižuje rychlost fotosyntézy listů a v důsledku toho i rychlost růstu. Nedostatek dusíku v půdě je pravidelně provázen zvýšením poměru biomasy kořenů k nadzemním částem. Z toho je zřejmé, že nedostatek dusíku ovlivňuje procesy regulující meziorgánovou distribuci asimilátů v rostlině a tím i růstové procesy. Existuje několik hypotéz o možném regulačním mechanismu vycházejících jednak z působení metabolitů asimilace dusíku (některé aminokyseliny) a uhlíku (sacharóza) na alokaci asimilátů, jednak ze změn obsahu fytohormonů (cytokininy, kyselina abscisová) a následného ovlivnění růstových procesů. Stresové účinky nemusí mít jen celkový nedostatek dusíku, ale i jeho jednostranná nabídka v amonné formě (např. v kyselých, podmáčených či v trvale chladných půdách, kdy je inhibována aktivita nitrifikačních bakterií). Příjem a asimilace amonných iontů jsou procesy spojené s výdejem vodíkových iontů, a tudíž i s poklesem pH jak v buňkách kořenů, tak i v rhizosféře. V citlivosti na toxické působení amonných iontů jsou ovšem velké mezidruhové rozdíly. Fosfor bývá v půdním roztoku vždy jen ve velmi malé koncentraci (pod 2 µM). Malá je také jeho celková zásoba ve většině půd a rychlost uvolňování z půdních minerálů i z půdní organické hmoty. Proto rostliny trpí velmi často jeho nedostatkem. Fosfor (vesměs ve formě fosfátových iontů) plní v rostlinách velmi rozmanité funkce: • je stavební součástí nukleových kyselin a fosfolipidů, • zajišťuje rychlé energetické výměny pomocí vazeb v nukleotidech (ATP, GTP, aj.), • aktivuje enzymy (fosforylací proteinu - apoenzymu), • svou koncentrací reguluje celou řadu procesů (rychlost respirace, fotosyntézy, transportu). Nadbytečné (rezervní) fosfátové ionty jsou ve vegetativních částech rostlin ukládány ve vakuolách, v semenech bývá fosfor uložen ve formě polyfosfátů (fytáty). Příznaky deficience se projevují zcela jinak než u dusíku. Listy zůstávají sytě zelené, neboť obsah proteinů a chlorofylu na jednotku listové plochy nebývá snížen. Stonky a listy zakrňují, a také rychlost růstu kořenů se zpomaluje, i když méně než u nadzemních částí. Dozrávání plodů bývá za nedostatku fosforu opožděno. Pohyb fosforu v rostlině je snadný a tudíž i jeho translokace ze stárnoucích orgánů do mladých, rostoucích částí je zcela běžné. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 22 pevné komplexy (na rozdíl od Ca2+ a Mg2+ ). Není proto kompetitorem pro jiné kationty a jeho transport v rostlině je mimořádně rychlý, k čemuž přispívají i hojné draslíkové kanály v membránách. Draslík má v rostlině několik značně odlišných funkcí: • aktivuje mnoho enzymů, a to především udržováním optimální konformace a afinity k substrátu. Při nedostatku draslíku proto dochází kromě jiného i k hromadění primárních asimilátů v listech, neboť nejsou aktivní příslušné syntázy a kinázy kytalyzující syntézu škrobu a transportních forem sacharidů, • aktivuje procesy syntézy proteinů a činnost ATP-ázy v plazmatické membráně, • je nutný pro dálkový transport aniontů jako doprovodný kationt, v lýku i jako osmotikum, • je nutný pro všechny procesy závislé na osmotickém tlaku, tedy především pro dlouživý růst, pohyby průduchů a některé další nastické pohyby (jako hlavní osmotikum zajišťuje dostatečný turgorový tlak). Síra ve formě snadno rozpustných síranů bývá v půdě obvykle v dostatečném množství, a proto ke zjevnému nedostatku dochází jen velmi zřídka. Pokud k němu dojde, pak se vizuálně projevuje blednutím mladých listů, neboť redistribuce ze starších listů je velmi malá. Asimilace síry v rostlině byla již probrána ve 2. části učebních textů. Z přijatých síranů je vždy asimilováno jen takové množství, které rostlina nutně potřebuje. Neredukované sírany mohou být uloženy ve vakuole, ale také zabudovány do sulfolipidů a polysacharidů, Významnou zásobárnou redukované síry představuje glutation, kterého je zvláště velké množství (asi 50 %) v chloroplastech. Tam také plní významnou antioxidační funkci. Glutation je výchozí sloučeninou pro tvorbu fytochelatinů (viz dále v kapitolce o působení těžkých kovů). Síru obsahuje i celá řada sekundárních metabolitů (např. alliin v česneku a cibuli, glukosinoláty u brukvovitých). Nedostatek síry vyvolává poruchu syntézy proteinů a chlorofylu, a v důsledku toho dochází ke zpomalení růstu nadzemních částí. Kořeny obvykle nebývají postiženy. Hořčík je také prvek, kterého bývá ve většině půd dostatek. Přesto se v současné době stává hlavní limitující živinou pro vegetaci v oblastech s kyselými půdami. Za nízkého pH a za zvýšeného přísunu aniontů (NO3 , SO4 2) ve srážkové vodě bývá vyplavován ze sorpčního komplexu rhizosféry do hlubších vrstev půdy. K prvním symptomům nedostatku hořčíku patří žloutnutí starších listů (úbytek chlorofylu), snížený obsah proteinů a snížená rychlost fotosyntézy. Kromě vazby v molekule chlorofylu hořčík aktivuje celou řadu enzymů, včetně hlavního karboxylačního enzymu Rubisco. Vápník je obsažen v nedostatečném množství pouze v některých velmi kyselých půdách. Obdobně jak u hořčíku, kyselé deště přispívají k jeho rychlému vyplavování z půdy. Nedostatek vápníku se nejvíce projevuje u mladých orgánů. Vápník (na rozdíl od hořčíku) není transportován lýkem a proto také není retranslokován ze starých orgánů do mladých. Nejvíce jeho nedostatkem trpí meristematická pletiva, protože bez Ca-pektátu nelze vytvořit střední lamelu při dělení buněk a ani dostatečně pevnou buněčnou stěnu. Dochází k deformacím růstu, někdy až k odumření meristémů. Také správná funkce membrán není bez vápníku možná - je nutný k zachování soudržnosti fosfolipidové vrstvy. Celkový obsah vápníku bývá v rostlinách (zejména dvouděložných) značný, ovšem většinou se na něm podílejí nerozpustné soli (hlavně uhličitan a šťavelan) uložené ve vakuole či v buněčné stěně. Koncentrace vápníku v cytosolu je přísně udržována na velmi nízké úrovni (0,1 až 0,2 µM). Důvodů prototo omezení je několik. Především by mohlo dojít k inaktivaci fosfátů tvorbou nerozpustných vápenatých solí. Za vyšší koncentrace v cytosolu by také vápník sotva mohl plnit významnou úlohu při vnitrobuněčných přenosech signálů a u celé řady enzymatických aktivit. Při transportu v buňkách je vápník obvykle vázán na specifickou bílkovinu calmodulin. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 23 Železo se vyskytuje v hojné míře prakticky ve všech půdách, ovšem ne vždy ve formě dostupné pro rostliny. Při hodnotě pH 5 a více přechází za dostatku kyslíku většina rozpustných železnatých sloučenin na mnohem méně rozpustné soli železité. Nedostatek dostupného železa je proto častý na půdách s alkalickou reakcí (např. na vápencovém podkladu). Zjevné příznaky špatného zásobení rostlin železem jsou podobné jako u hořčíku (ztráta chlorofylu), avšak s tím rozdílem, že jako prvé jsou postiženy mladé listy. Translokace železa ze starších listů není téměř možná, neboť je vázáno v pevných komplexech. Železo je významnou součástí mnoha enzymů, především v hemových skupinách cytochromů, peroxidázy a katalázy, ale i v nehemových vazbách Fe-S proteinů (např. ferredoxin, akonitáza, Fe-superoxiddismutáza). Všechny tyto enzymy mají redoxní funkci, neboť snadná a vratná změna oxidačního stupně železa umožňuje přenosy elektronů. Známe ovšem i neredoxní typy enzymů s obsahem železa, které jsou nutné pro syntézu etylénu, mastných kyselin a chlorofylu. Proto se nedostatek železa projevuje nejnápadněji blednutím listů (= sníženým obsahem chlorofylu). Pro příjem železa z málo rozpustných forem v půdě jsou u některých druhů rostlin vyvinuty zajímavé adaptace. Jednou z možností, kterou využívají hlavně dvouděložné rostliny, je vylučování komplexotvorných organických kyselin a fenolických látek. Železité ionty jsou pak na povrchu kořenů uvolněny z komplexů, redukovány na Fe2+ a teprve pak přijímány. Dokonalejší adaptační strategií, účinnou i na velmi alkalických půdách, je chelátová vazba trojmocného železa bez nutnosti okyselovat okolí kořene. Předpokladem však je tvorba a vyloučení zvláště silných chelatizačních sloučenin, označovaných jako fytosiderofory (obvykle typu iminokarboxylových kyselin). Rostlina pak přijímá celý chelátový komplex, a až v kořenech dochází k uvolnění Fe3+ a k redukci na Fe2+ . Tato cesta získávání železa je obvyklá jen u trav. Chlor je přijímán ve formě chloridů, a to obvykle ve větším množství, než kolik je nutné. Příznaky jeho nedostatku se u rostlin v přírodě neprojevují, lze je však vyvolat pokusně: růst je pak velmi zpomalen, listy blednou a vadnou. Stopová množství chloru lze nalézt v rostlinách ve více než stovce organických sloučenin (včetně bílkovin), z nichž mnohé zabezpečují zcela základní funkce (např. fotolýzu vody při fotosyntéze, aktivaci ATP-ázy v tonoplastu, dělení buněk, růstové regulace). Významná je i funkce chloridových iontů jako osmotika, zejména při pohybech průduchů. Manganu je všude v přírodě dostatek, i když, obdobně jako v případě železa, rozpustnost jeho solí je při vyšším pH malá. Je přijímán jako Mn2+ či v chelátové formě a jeho nedostatek (což je vzácný případ) se projeví v prvé řadě rozpadem thylakoidních membrán chloroplastů, navenek pak mozaikovitou chlorózou listů. Mangan má klíčovou úlohu při fotolýze vody, je aktivátorem několika desítek enzymů a součástí některých redoxních systémů. Bór je prvek, jehož obsah v půdách značně kolísá a příznaky jeho nedostatku byly pozorovány už dávno (srdéčková hniloba řepy, skvrnitost jablek, snížení rychlosti fixace dusíku hlízkovými bakteriemi, aj.). Často jde však o interakci s jinými prvky. Prvním, i když méně zjevným příznakem nedostatku bóru, je zpomalení buněčného dělení v apikálních meristémech, což se dává do souvislosti s prokázanou inhibicí syntézy nukleových kyselin, syntézy membrán a buněčné stěny. Detailní informace o všech aspektech mechanismu působení bóru v rostlině nám dosud chybí. Není součástí žádného ze známých enzymů, ani žádný neaktivuje. Zcela jistě však má nezastupitelnou úlohu při tvorbě funkčních komplexů s řadou sacharidů, hemicelulóz a fenolických látek. Zinek, měď, molybden a nikl patří sice mezi prvky nezbytné pro růst, avšak jejich potřeba je tak nepatrná, že se s projevy nedostatku v přírodě sotva setkáme. Všechny tyto prvky jsou především významnou součástí některých enzymů. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 24 Zinek obsahují např. alkalické fosfatázy, RNA-polymeráza, alkoholdehydrogenáza a karbonátanhydráza. Kromě toho aktivuje několik desítek dalších enzymů nutných pro syntézu proteinů, pro metabolismus sacharidů, degradaci RNA, syntézu tryptofanu a auxinů. Měď je součástí mnoha proteinů s redoxní funkcí, např. cytochromoxidázy, askorbátoxidázy, polyfenoloxidázy a plastocyaninu. Molybden je obsažen především v molybdopterinovém kofaktoru enzymů nitrogenázy, nitrátreduktázy a xantinoxidázy/reduktázy. Nedostatek molybdenu se projevuje zpomalením růstu, chlorózami a nekrózami listů. Zvláště náchylné jsou bobovité rostliny, kukuřice a květák. Nikl byl zařazen mezi nezbytné prvky teprve nedávno (Dalton et al. 1988), když se ukázalo, že nikl obsahující enzym ureáza je skutečně nutná pro biochemické funkce rostlin, zejména pak těch druhů, které vytvářejí hodně ureidů jako transportních dusíkatých látek (např. bobovité a javorovité). Sodík patří už mezi benefiční prvky, stejně tak jako následující křemík, kobalt a selen. Zvláště důležitý je pro halofytní rostliny, ale i pro některé další tzv. natrofilní druhy včetně řepy a kukuřice. U halofytů může nahrazovat draslík v úloze hlavního osmotika. U C4 rostlin významně stimuluje syntézu fosfoenolpyruvátu z pyruvátu. Křemík je zvláště hojně přijímán rostlinami z čeledí šáchorovitých a lipnicovitých. Zpevňuje buněčnou stěnu a tím zvyšuje i mechanickou odolnost listů a stébel vůči mechanickému poškození (poléhání), i vůči ataku herbivorů a patogenů. Kobalt je nutný pouze pro zdárný vývoj symbiotické fixace dusíku u těch druhů rostlin, které jsou ji schopny provozovat (je součástí vitaminu B12 v hlízkových bakteriích). Selen je vázán v aminokyselinách selenocysteinu a selenometioninu. Na rozdíl od živočichů však pro rostliny tyto aminokyseliny nejsou nezbytné. Nedostatek kyslíku Nadzemní části rostlin jsou obklopeny vzdušným prostředím, ve kterém je koncentrace kyslíku vysoká a stálá (přibližně 21 objemových procent). Ve zcela jiné situaci jsou ale podzemní orgány, neboť koncentrace kyslíku v plynné fázi půdního systému je trvale snížena ve srovnání s volnou atmosférou. Kyslík je totiž nepřetržitě odebírán nejen respiračními procesy kořenů, ale i respirací půdní mikroflóry. V půdě s dostatkem velkých pórů není toto snížení velké (nanejvýš na polovinu koncentrace ve volné atmosféře), díky rychlému doplňování difúzním tokem ze vzduchu nad povrchem půdy. Pokud je ovšem vzdušných pórů málo a navíc jsou úzké, jak tomu bývá u těžkých jílových půd, nebo v důsledku zvýšeného obsahu vody v půdě (zamokření), pak může koncentrace kyslíku v rhizosféře klesnout na hodnoty blízké nule. Tyto hypoxické až anoxické podmínky způsobují vážný stres u těch druhů rostlin, které nemají vhodné adaptace. Jakmile koncentrace kyslíku v půdním vzduchu v okolí kořenů klesne pod 2 až 4 % (objemová), dochází k inhibici aerobních respiračních procesů, a to jak v buňkách kořenů, tak i u půdních mikroorganismů. V prvé řadě je zpomalena až zastavena funkce elektronového transportního řetězce v mitochondriích a hromadící se NADH inhibuje činnost citrátového cyklu. Glykolýza inhibována není, neboť nevyžaduje kyslík a její hlavní produkt, pyruvát, může být zpracován náhradní anaerobní cestou (fermentací). Při fermentačním metabolismu je spotřebováván i NADH vznikající při glykolýze, takže nic nebrání tomu, aby reakce probíhaly tak dlouho, dokud je k dispozici primární substrát. Přechod na uvedené anaerobní disimilační procesy má pro rostlinu velmi vážné následky. Především trpí nedostatkem energie. Zatímco z jednoho molu glukózy lze získat aerobní cestou až 32 molů ATP, anaerobním rozkladem jen dva. Na pokrytí normálních energetických potřeb musí proto rostlina v prostředí bez kyslíku spotřebovat mnohonásobně větší množství organických látek (zrychlenou glykolýzou), což brzy vede k jejich úplnému vyčerpání. Dalším nebezpečím jsou konečné produkty fermentace, neboť etanol a zejména kyselina mléčná jsou ve vyšší koncentraci toxické sloučeniny. Možné cesty zpracování produktů glykolýzy při zablokování oxidačních procesů v mitochondriích nedostatkem kyslíku. Kromě přímého negativního působení nedostatku kyslíku na fyziologické procesy dochází i v chemismu půdy k celé řadě změn, které nepřímo ohrožují rostliny. Mnoho druhů půdních mikroorganismů je dobře adaptováno pro život v anaerobním prostředí. Mají totiž schopnost při svých respiračních procesech využívat místo kyslíku i jiné látky jakožto akceptory elektronů a převádět je do redukovaného stavu. Jednou z možností je redukce nitrátů na molekulový dusík (denitrifikace). Pro rostliny mnohem nebezpečnější je však redukce síranů na sirovodík, a také uvolnění dvojmocných iontů železa a manganu redukcí oxidovanějších nerozpustných forem. Vzniklé látky jsou ve vyšší koncentraci toxické a navíc Fe2+ váže volné fosfátové ionty do nerozpustné soli. Za nedostatku kyslíku je silně inhibována činnost nitrifikačních bakterií. Většina přijatelného dusíku je proto ve formě amonných iontů, které mohou působit ve vyšší koncentraci na některé druhy rostlin inhibičně až toxicky. Aklimační reakce na náhlé snížení koncentrace kyslíku (např. při silných deštích či po zaplavení půdy) má značně komplexní charakter. Dochází především ke změnám v koncentraci fytohormonů a k syntéze stresových proteinů. Zvyšuje se syntéza kyseliny abscisové, která zprostředkovává regulaci řady procesů i v nadzemních orgánech (zavírání průduchů, inhibici růstu, aj.). Tvorba cytokininů v kořenech je naopak zpomalena a stejně tak i tvorba etylénu, protože vyžaduje kyslík. Přesto koncentrace etylénu v kořenech vzrůstá, neboť jsou značně omezeny jeho ztráty difúzí do okolního prostředí. Bylo také zjištěno, že hypoxickém prostředí stoupá citlivost buněk na působení etylénu. Etylén je pravděpodobně hlavním signálem ke spuštění celé řady dalších aklimačních reakcí. Jednou z prvních je indukce tvorby enzymů rozkládajících pektinové střední lamely buněčných stěn. Dochází tak k rychlé tvorbě rozsáhlých intercelulár v parenchymatických pletivech kořenů a stonku. Jejich propojením vznikají podélné kanálky, kterými do kořenů difunduje kyslík z nadzemních částí. Nově vytvářené kořeny v hypoxickém prostředí jsou nápadně ztlustlé a velmi málo větvené. Proteiny indukované sníženou koncentrací kyslíku (anaerobic stress proteins, ASP) můžeme v buňkách dokázat nejen za úplné anoxie, ale už při snížení koncentrace kyslíku ve vzduchu v okolí rostliny asi na 4 %. Jejich indukce je poněkud pomalejší než u předešlých skupin stresových proteinů, nicméně už po pěti hodinách trvání nedostatku kyslíku představuje tvorba ASP přibližně tři čtvrtiny celého objemu proteosyntézy. Je to dáno také tím, že jejich tvorbě předchází útlum syntézy mnoha proteinů vyskytujících se v buňkách za dostatku kyslíku. Početnou skupinu v ASP, kterých celkem známe asi 20, tvoří enzymy nutné pro některé specifické cesty metabolismu sacharidů, ale i pro glykolýzu a fermentační procesy (např. alkoholdehydrogenáza, pyruvátdekarboxyláza a laktátdehydrogenáza, které patří k nejhojnějším). STRESOVÁ FYZIOLOGIE 25 I přes velmi nepříznivé účinky hypoxického prostředí na rostliny a velmi dramatické změny v buňkách po jeho náhlém navození, známe celou řadu druhů, které úspěšně rostou na trvale zamokřených či zaplavených půdách. Na těchto lokalitách bývají dokonce dosahovány špičkové hodnoty produkce biomasy (např. rákosiny, rýžová pole). Z toho je zřejmé, že adaptační schopnosti některých druhů jsou skutečně dokonalé. Základem úspěšného přizpůsobení mokřadních rostlin je zajištění rychlého transportu kyslíku do kořenů. Rozsáhlý systém intercelulár, tvořící až 60 % z celkového objemu pletiv ve stoncích a kořenech, patří u nich k trvalým, konstitučním znakům. Transport plynů v intercelulárách neprobíhá pouze difúzí, ale i mnohem rychlejším hromadným tokem (massflow). K tlakovému rozdílu jakožto hybné síly hromadného toku dochází jednak kolísáním teploty nadzemních částí v průběhu dne, jednak snadným únikem vydýchaného oxidu uhličitého do vody v okolí kořenů. Kyslík transportovaný do kořenů je využíván nejen k respiračním procesům, ale i k detoxikaci rhizosféry, především k oxidaci Fe2+ a Mn2+ na nerozpustné sloučeniny . U kořenů rostoucích za dostatku kyslíku v půdě (levý obrázek) nejsou téměř žádné interceluláry, avšak za nedostatku kyslíku (po náhlém zaplavení) se rychle vytvářejí (vpravo). Adaptované rostliny mají kromě výhodných morfologických znaků i řadu trvalých metabolických zvláštností. Patří k nim např. velmi dokonalé řízení rychlosti glykolýzy a tudíž u nich nedochází za nedostatku kyslíku k tak prudkému zrychlení rozkladných procesů, které by vedlo k vyčerpání rezerv. Také konečné produkty fermentace (především etanol) bývají velmi účinně vylučovány z kořenů do vnějšího prostředí. Někdy také mohou převažovat méně toxické produkty, jako např. malát, alanin či glycerol. U druhů tolerantních k nedostatku kyslíku dochází k syntéze stresových proteinů rychleji než u druhů netolerantních. Silně zasolené a kyselé půdy Zasolené půdy se vyskytují nejen v blízkosti moře, ale i ve vnitrozemských oblastech, kde potenciální výpar (tj. množství vody které by se za daných klimatických podmínek odpařilo pokud by byla voda v půdě stále v dostatečném množství) převažuje nad srážkami. Jde především o rozsáhlé pouště a polopouště na všech kontinentech. K lokálnímu zasolení může dojít i na dlouhodobě zavlažovaných pozemcích. Problémy, kterým rostliny musí čelit při růstu na zasolených půdách, jsou komplexní povahy. Kromě vlastního toxického vlivu vysoké koncentrace některých iontů (zejména Na+ , Cl, SO4 2a Mg2+ ) to bývá velmi nízký vodní potenciál a zhoršené fyzikální vlastnosti půdy. Neadaptované rostliny hromadí ve svých buňkách uvedené ionty v takovém množství, které je neslučitelné s normální funkcí enzymů. Velmi brzy pak dochází k zastavení dělivého i dlouživého růstu a nakonec k odumření celé rostliny. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 26 Přesto známe řadu druhů, které snášejí bez poškození i značné zasolení půdy (halofytní rostliny). Adaptace k zasolení probíhala několika směry. U části druhů je příjem solí dokonale kontrolován vysokou selektivitou plazmatické membrány pro transport iontů do buněk kořenů, takže i v podmínkách silného zasolení (např. u mangrovů na mořských pobřežích) proudí v xylému téměř čistá voda. Tyto druhy mají též schopnost dobrého rozlišení iontů Na+ a K+ (s preferencí příjmu K+ ). U většiny halofytů však není příjem solí tak dokonale řízen, což vede k jejich hromadění v listech. Avšak i u těchto druhů jsou organely a enzymy v cytosolu citlivé na vyšší obsah solí, a proto jsou soli ukládány do vakuoly a apoplastu. Vysoký osmotický tlak vakuolární šťávy musí být vyrovnáván zvýšenou koncentrací kompatibilních osmoticky aktivních látek v cytosolu (sacharidů, prolinu, aj.). Část solí bývá vylučována na povrch listu . Hodnoty vodního potenciálu zasolených půd bývají běžně sníženy pod -1 MPa. Pokud je vystavena běžná, neadaptovaná rostlina náhlému působení zasolené půdy, jednou z prvních reakcí je zvýšení osmotického tlaku v buňkách kořenů (osmoregulací). Jen tak lze v aktivním (turgescentním) stavu snížit hodnoty vodního potenciálu na úroveň nižší, než je v půdě, což je podmínkou pro zachování příjmu vody. U halofytů obou uvedených skupin jsou hodnoty osmotického tlaku trvale velmi vysoké (i více než 10 MPa!). Další významnou reakcí je tvorba stresových proteinů, které jsou velmi podobného typu jak při stresech z vysoké teploty a z nedostatku vody. Silně kyselé půdy představují v současné době závažný problém nejen ve střední Evropě, ale i na jiných kontinentech. Nadměrná kyselost půdy může mít velmi rozmanité příčiny i následky pro růst rostlin. Na poklesu pH půdy se podílí nejen vstup vodíkových iontů z kyselých srážek, ale i nevhodný způsob obhospodařování (nadměrné hnojení dusíkatými hnojivy, dlouhodobé pěstování monokultur stejných plodin, sklizeň a odvoz veškeré biomasy). Vzestup koncentrace H+ je účinně tlumen pouze na půdách s vyšším obsahem CaCO3. Na většině ostatních půd má dominantní úlohu v řízení pH komplex s hydratovanými ionty hliníku, který umožňuje pokles pH až na hodnotu 3,5. Hodnoty nižší jsou již v přírodě výjimečné (např. některé rašelinné půdy či půdy s vyšším obsahem síry). Přímé poškození rostlin vysokou koncentrací vodíkových iontů je poměrně vzácné, neboť k němu dochází obvykle až při hodnotě pH 3 a nižší. Mnohem významnější je tedy nepřímé negativní působení zvýšenou rozpustností některých sloučenin v půdě při nízkém pH. Zejména dochází k uvolňování vysoce toxických iontů hliníku (Al3+ ). Také volné ionty Fe2+ a Mn2+ působí v nadbytku toxicky. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 27 Vysoká koncentrace vodíkových iontů v půdě vytěsňuje kationty (zejména Ca2+ , Mg2+ a K+ ) ze sorpčních vazeb na koloidech a snadno dojde k jejich vyplavení z půdy. Rostliny pak trpí nedostatkem těchto kationtů. Dále je snížena dostupnost fosforu (vazbami na volné ionty hliníku a železa se tvoří nerozpustné sloučeniny) i nitrátového dusíku, protože nitrifikační bakterie jsou citlivé na pokles pH. Rostliny které úspěšně rostou na kyselých půdách, jsou adaptovány především k tolerování nepřímých vlivů nízkého pH. V prvé řadě to bývá tolerance k vysoké koncentraci hliníku, manganu a železa. Tyto adaptované druhy nejsou z fyziologického hlediska obligátně acidofytní, neboť v kultivaci dobře rostou ve značně širokém rozmezí pH. Vyhraněná ekologická vazba na stanoviště s nízkým pH půdy bývá podmíněna nepřímo řadou dalších faktorů, které jsou často jen v koincidenci (nikoli tedy v příčinném vztahu) s hodnotou pH. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 28 STRESOVÁ FYZIOLOGIE 29 Toxické látky v prostředí Plynné, kapalné i pevné složky prostředí ve kterém v přírodě rostliny rostou jsou velmi pestrou směsí desítek chemických sloučenin, z nichž některé mohou mít výrazně inhibiční až toxické účinky. Z plynů je nejvíce nebezpečný ozón a oxid siřičitý, v půdě pak ionty těžkých kovů a aromatické organické látky. Stále vyšší obsah toxických látek v prostředí je spojen hlavně s průmyslovou a zemědělskou činností člověka (spalování fosilních paliv, používání umělých hnojiv, pesticidů, detergentů atd.). Tak se dostávají do prostředí i sloučeniny, které se v přírodě nikdy dříve nevyskytovaly (xenobiotika). Ozón je obvykle nejtoxičtější složkou přízemní vrstvy atmosféry (troposféry), i když jeho koncentrace velmi kolísá jak časově tak místně (průměrná hodnota maxim bývá v rozmezí 300 až 500 µg m-3 ). Naprostá většina troposférického ozónu vzniká fotolýzou oxidů dusíku (NO, NO2), a také některých plynných organických sloučenin (uhlovodíků). K rozkladu těchto látek dochází účinkem ultrafialového záření. Velké koncentrace ozónu se proto nejčastěji vytvářejí v horních vrstvách znečištěného ovzduší vystavených intenzivnímu slunečnímu záření, zvláště je-li inverzní typ počasí s malou turbulentní výměnou. Vznikající ozón může být v tom případě velmi nebezpečný pro rostliny v horských oblastech. Koncentrace ozónu ve vzduchu bývá obvykle nejmenší v noci a nejvyšší v odpoledních hodinách. Nejvíce poškozené bývají druhy s intenzivní výměnou plynů v listech. Ozón vstupuje do listů výhradně průduchy a již v intercelulárách, v kontaktu s vlhkými buněčnými stěnami, se rychle rozkládá. Průnik nerozloženého ozónu přes plazmatickou membránu je stěží možný. Při rozkladu ozónu vzniká nejen molekulový kyslík, ale jako meziprodukty i reaktivní superoxid (O2 ), peroxid vodíku a hydroxylový radikál OH. ). Tyto sloučeniny v prvé řadě způsobují nekatalyzovanou oxidaci složek buněčné stěny (zejména proteinů a fenolických látek), a složek plazmatické membrány (lipidů i proteinů). Tvorba nekrotických skvrn na listech poškozených ozónem velmi často připomíná symptomy hypersensitivní reakce na poškození patogeny (viz str. 37). Na počátku této reakce, vedoucí k náhlé smrti buněk, je také tvorba aktivních forem kyslíku v buněčné stěně a tak lze oprávněně spekulovat o obdobném mechanismu obou reakcí, i když je spuštěn velmi odlišnými primárními podněty. Pak už není tolik překvapující zjištění, že ozónem bývá indukována (kromě jiného) tvorba proteinů se specifickým ochranným účinkem proti patogenům, např. lytické enzymy chitináza a glukanáza. Při působení ozónu dochází velmi rychle ke zvýšené tvorbě etylénu (expresí genu pro ACC-syntázu), ovšem tvorba etylénu spíše urychluje poškození a smrt buněk (při zablokování tvorby etylénu je poškození menší!). K zesílení negativního působení ozónu může pravděpodobně přispívat reakce uvolněného etylénu s ozónem v buněčné stěně provázená vznikem superoxidu a reaktivních aldehydů. Odumírání buněk pod vlivem vyšších dávek ozónu nemusí být způsobováno pouze "programovanou" hypersensitivní reakcí, ale i neregulovaným způsobem po vážném narušení integrity plazmatické membrány peroxidací lipidů. Ne vždy však působení ozónu musí končit odumíráním buněk. Při interakci menších (neletálních) dávek ozónu s buněčnou stěnou se aktivují i některé ochranné mechanismy, které omezují možné poškození buněk. Zvyšuje se aktivita glutation-s-transferázy, která odstraňuje produkty peroxidace lipidů. Zvyšuje se také aktivita "antioxidačních" enzymů, superoxiddismutázy, askorbátperoxidázy a glutationreduktázy. Je stimulována tvorba ligninu a extensinu v buněčných stěnách. Při dlouhodobém působení i poměrně nízké koncentrace ozónu však může dojít ke chronickému poškození listů, které se vyznačuje snížením antioxidační ochrany, úbytkem enzymu Rubisco, poklesem rychlosti fotosyntézy a zrychleným stárnutím. Mechanismus tohoto typu poškození se však experimentálně studuje jen velmi obtížně. Oxid siřičitý se sice v atmosféře Země vyskytoval i před industriální érou (z vulkanických emisí), ovšem v důsledku spalování uhlí s velkým obsahem síry se jeho koncentrace postupně zvyšovala až do fytotoxických hodnot. V současné době již nepůsobí SO2 tak vážné problémy jako kdysi, neboť uhlí se spaluje již méně a velké spalovny (hlavně tepelné elektrárny) jsou vybaveny odsiřovacím zařízením. Oxid siřičitý vstupuje do listů hlavně otevřenými průduchy a difúzí v intercelulárách se snadno šíří ke všem buňkám listového mezofylu. Po proniknutí buněčnou stěnou se rychle rozpouští a mění na siřičitanové anionty, jejichž naprostá většina vstupuje do chloroplastů. Tam se v menších koncentracích neprojevují škodlivě, neboť za dostatku záření dochází právě v chloroplastech k jejich redukci (na sirníkový iont o k zabudování do organických sloučenin. Ve vyšší koncentraci však siřičitanové ionty způsobují nadměrné snížení pH cytosolu a blokují činnost karboxylačního enzymu Rubisco, čímž je inhibován i průběh sekundárních procesů fotosyntézy. V odolnosti k toxickému působení SO2 existují velké mezidruhové rozdíly. Nejvíce ohroženy bývají druhy s dlouhověkými listy, zejména jehličnaté stromy, a také některé stélkaté rostliny s růstovou aktivitou v zimním období. V zimě bývá zpravidla koncentrace SO2 nejvyšší. Aklimační reakce na působení SO2 zahrnují zvýšení aktivity enzymů metabolismu síry a také zvýšení tlumící (pufrovací) kapacity buněk. Tato kapacita je ale závislá na dostatečném zásobení rostliny bazickými kationty (Ca2+ , Mg2+ ). Nedostatek těchto prvků je běžný na acidifikovaných půdách, ke kterým patří většina našich lesních půd, především pak v horských oblastech. Deficitní rostliny z těchto oblastí jsou proto značně náchylnější na poškození oxidem siřičitým. Bylo zjištěno, že druhy s fixační cestou C4 jsou mnohem odolnější vůči toxickému působení SO2 než rostliny typu C3. Je to dáno hlavně menší citlivostí PEP-karboxylázy k SO2 a lokalizací Calvinova cyklu do velmi dobře chráněných buněk pochev cévních svazků se zvýšenou koncentrací CO2. Těžké kovy, zejména zinek, olovo a kadmium, se dostávají do půdy ve větších množstvích usazováním prachu z průmyslových procesů, z výfukových plynů, z kontaminovaných odpadních vod a hnojiv. Ionty těchto kovů jsou velmi snadno přijímány kořeny, neboť selektivita transportních proteinů je zřejmě nedostatečná pro jejich rozlišení od těch prvků, které jsou pro život rostliny nezbytné. Po vstupu do buněk inaktivují některé enzymy a redoxní systémy. Inhibice dělení a dlouživého růstu buněk, která se projevuje zejména zpomalením růstu primárního kořene, bývá jedním z prvních příznaků jejich toxického působení. V kořenech také dochází k největšímu hromadění těžkých kovů. Vliv iontů těžkých kovů na aktivitu nitrátreduktázy, která je zvláště citlivá na jejich působení. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 30 Do nadzemních orgánů je translokována jen menší část přijatých iontů těžkých kovů, přesto jejich působení na inhibici základních metabolických procesů v listech (asimilace uhlíku, dusíku, respirace) je obvykle vážné a velmi brzo prokazatelné. V odolnosti rostlin k působení těžkých kovů existují velké rozdíly nejen mezi druhy, ale i uvnitř téhož druhu. Odolné rostliny (např. některé trávy) mohou především značně znesnadňovat vstup toxických iontů do cytosolu, a to jednak vylučováním organických kyselin do rhizosféry, sorpcí na pektinové látky v buněčných stěnách, a konečně i větší selektivitou transportních proteinů v plazmatické membráně. K vnitrobuněčným detoxifikačním mechanismům patří tvorba obecně stresových (nespecifických) proteinů a odolnějších izoenzymů. Další velmi účinnou aklimační reakcí je tvorba specifických sloučenin (fytochelatinů) schopných inaktivovat těžké kovy vazbou do chelátových komplexů. Fytochelatiny jsou zvláštní malé polypeptidy odvozené od tripeptidu glutationu (viz rámeček). Vznikají spojením dvou až 11 molekul kyseliny γ-glutamové a cysteinu s jednou molekulou glycinu. Syntéza fytochelatinů neprobíhá na ribosomech, ale přímou biochemickou cestou, nicméně je indukována až přítomností iontů kovů v cytosolu. Komplexně vázané toxické ionty jsou transportovány do vakuoly, kde po uvolnění z fytochelatinu jsou opět inaktivovány vysokou koncentrací organických kyselin. Podobnou chelatizační funkci mají i proteiny ze skupiny metallothioneinů, které jsou běžné u živočichů, ale jejich tvorba byla prokázána i u některých druhů rostlin. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 31 STRESOVÁ FYZIOLOGIE 32 Působení biotických faktorů na funkce rostlin Při studiu vztahů mezi prostředím a funkcemi rostlin nemůžeme zanedbat biotické složky prostředí, protože rostliny v přírodě nežijí nikdy bez interakcí s jinými organismy. Mechanismus vzájemného ovlivňování může být založen na změnách fyzikálně-chemických složek prostředí (kompetice o zdroje, alelopatie), anebo na přímém působení (herbivorie, parazitismus, symbiózy). Kompetice, alelopatie, mykorrhiza Ke kompetici dochází v těch případech, kdy množství zdrojů hmoty a energie (hlavně záření, vody a minerálních živin) není dostatečné pro optimální růst všech rostlin na určitém místě, a proto rychlost růstu některých z nich (nebo všech) je snížena. Toto snížení však musí být vyvoláno aktivitou sousedících rostlin, nikoli jen obecným nedostatkem zdroje. Různé druhy rostlin nemají obvykle stejnou schopnost využívat zdroje, a tak se velmi často setkáváme s dominancí jednoho, nejlépe adaptovaného druhu nad ostatními. Zvláště zřetelný je tento vztah při kompetici o záření, kdy vysoká potenciální rychlost růstu stonků a listů rozhoduje o kompetiční úspěšnosti. Vzhledem k jednosměrnému toku záření znamená rychlé vytvoření velké listové plochy jedním druhem v dostatečné výšce nad ostatními téměř úplné využití tohoto zdroje. Konkurence o vodu a živiny, vzhledem k jejich difusnímu charakteru, je méně dramatická a není jen otázkou potenciální rychlosti růstu kořenů. Velmi záleží i na jiných jejich vlastnostech, např. na schopnosti snížit vodní potenciál či na efektivitě příjmu živin. Základní mechanismus kompetičních vztahů, založený na rozdílech ve využívání zdrojů, je jednoduchý, ale jeho fungování v přírodě je často obtížně vysvětlitelné. Především pro silný synergický vztah mezi kořeny a nadzemními částmi - rychlejší příjem živin vede k rychlejšímu růstu listů, a tudíž k výhodě při kompetici o záření. Obdobně zase vrozená schopnost rychlejšího růstu stonků a listů, umožňující dokonalejší příjem záření a vyšší rychlost fotosyntézy, vede i k rychlejšímu růstu kořenů a k výhodě v kompetici o živiny. Určit primární příčinu kompetiční úspěšnosti je velmi obtížné. Často může být založena jen na zcela malém a obtížně měřitelném rozdílu na počátku růstu, který vzhledem k exponenciálnímu průběhu růstových procesů má dalekosáhlé následky. Kompetice je velmi významnou (nikoli však jedinou) biotickou interakcí, určující strukturu a fungování rostlinných společenstev. Její podstatou jsou genotypově vázané rozdíly v základních fyziologických procesech. Naše znalosti o průběhu těchto procesů v přírodních podmínkách však obvykle nedostačují k uspokojivému vysvětlení kompetice zjednodušené spekulace mohou velmi zkreslovat skutečný stav. Alelopatie je zvláštním případem vzájemného ovlivňování rostlin na čistě chemickém základu. Každá rostlina obsahuje velké množství sekundárních metabolitů, z nichž některé mohou působit inhibičně až toxicky na jiné rostliny vyskytující se v jejich těsné blízkosti. Pokud skutečně dojde k přenosu účinné látky a k ovlivnění sousední rostliny, pak teprve hovoříme o alelopatii. Významnost alelopatie jako příčiny biotických stresů rostlin v přírodních podmínkách stále patří mezi velmi rozporuplnou a málo probádanou oblast rostlinné fyziologie. Existují sice nesčetná pozorování negativního vzájemného ovlivňování rostlin a také potenciální účinek mnoha rostlinných metabolitů na jiné rostliny je dobře znám, ovšem k důkazu alelopatického působení to ještě zdaleka nestačí. Účinné látky musí být z jedné (zdrojové) rostliny vyloučeny a přeneseny na jinou (cílovou) rostlinu v dostatečné koncentraci. Při tomto transportu nutně dojde k poklesu jejich koncentrace vzhledem k neusměrněnému šíření difúzí, možné sorpci na koloidech či částečnému mikrobiálnímu rozkladu. Z toho ovšem vyplývá, že zdrojová rostlina musí být vůči účinné látce mnohem méně citlivá než rostlina STRESOVÁ FYZIOLOGIE 33 cílová. Uvolňování a přenos malých koncentrací organických sloučenin je zejména v půdě velmi obtížné sledovat. Ještě obtížnější je ale v silně heterogenním půdním prostředí dokázat, že výsledný efekt (ovlivnění cílové rostliny) byl vyvolán pouze metabolity vyloučenými ze zdrojové rostliny, a ne nějakým jiným způsobem. Vzhledem k uvedeným potížím je hodnověrných důkazů o alelopatickém působení látek vyloučených z živých rostlin velmi málo. Toto působení je teoreticky možné i u nadzemních orgánů přenosem těkavých látek (hlavně terpenů) či smýváním netěkavých metabolitů vyloučených na povrch listů, ale hlavní význam bude mít nepochybně v kořenové zóně. Velká pozornost je v současné době věnována těm druhům, které sice mají špatné kompetiční předpoklady (zejména pokud mají vrozeně pomalý růst a tudíž i malý odběr živin a vody z půdy), ale přesto v přírodě vytvářejí souvislé porosty ve kterých se jiným druhům nedaří. K takovým druhům patří např. metlička křivolaká (Avenella flexuosa), česnek medvědí (Alium ursinum), nebo bažanka lesní (Mercurialis perennis). Velmi častým objektem zájmu je také vzájemné ovlivňování trav a jetelovin, u kterých bylo dokázáno alelopatické působení ve zjednodušených podmínkách vodních kultur. K vzájemnému ovlivňování u nich dochází především pomocí fenolických sloučenin (skopoletin, eskulin). Poněkud lépe prozkoumané je nepřímé alelopatické působení zprostředkované metabolity uvolněnými mikrobiálním rozkladem z odumřelých částí rostlin. Zvláštní postavení mají i v tomto případě fenolické látky, které se nacházejí v půdě v hojném množství jako produkty rozpadu některých složek biomasy, především ligninu. K těm jednodušším patří např. kyselina fenyloctová, benzoová, hydroxycinnamová, nebo i známý juglon (5-hydroxy-αnaftochinon), který způsobuje silnou toxicitu rozkládajících se listů ořešáku na řadu druhů zahradních rostlin. Ze složitějších sloučenin bývají hojné flavonoidy a taniny. Mechanismus působení látek s potenciálním alelopatickým účinkem je dosud znám velmi nedostatečně. Inhibice membránových funkcí včetně příjmu iontů minerálních živin, inhibice dělivého i dlouživého růstu buněk, a inhibice klíčení patří k nejčastěji pozorovaným účinkům. Citlivost různých druhů rostlin je vůči zmíněným sloučeninám značně rozdílná a lze proto předpokládat existenci rozdílně účinných detoxikačních schopností. Mykorhiza je velmi dokonale řízený vztah mezi kořeny rostlin a některými druhy hub. Existuje dokonce několik kvalitativně odlišných typů tohoto těsného spojení. U ektomykorhizy (EcM) jsou kořeny obaleny pochvou z houbových vláken, které částečně pronikají i do mezibuněčného prostoru v kůře, ale nikoliv do buněk. Hyfy hub (převážně z třídy hub stopkovýtrusných, Basidiomycetes, v menší míře to mohou být i houby vřeckovýtrusné, Ascomycetes) jsou nejen nahloučeny kolem kořene, ale bohatě se větví i v půdě. Tento typ mykorhizy je velmi častý u lesních stromů a mykobionty mohou být stovky druhů hub. U endomykorhizy pronikají houbová vlákna přímo do buněk kůry. Kromě velmi specializovaných variant u rostlin čeledi Orchidaceae a řádu Ericales, je u většiny čeledí vyšších rostlin daleko nejčastější arbuskulární mykorhiza (AM). Jedná se o celosvětově nejrozšířenější typ mykorhizy, který zcela dominuje ve všech porostech trav a jiných bylin. Zúčastněných druhů hub je sice jen malý počet (jedná o glomeromycety, Glomeromycota) avšak jsou neobyčejně rozšířené. Žijí pouze symbioticky (ne saprofyticky, jako většina hub), nelze je tedy pěstovat bez hostitelské rostliny a ani u nich neznáme žádná pohlavní stadia. Jejich hyfy prorůstají do korových buněk, ve kterých se větví do charakteristického "stromečkového" útvaru (arbusculus). Na takto zvětšeném povrchu hyf probíhá veškerá výměna metabolitů mezi hostitelskou rostlinou a mykobiontem. Vnější, mimokořenové mycelium vytváří rozsáhlou síť v okolní půdě a někdy dokonce propojuje několik hostitelských rostlin navzájem. Toto propojení umožňuje i výměnu metabolitů (především uhlíkatých látek) mezi jednotlivými rostlinami v daném společenstvu, jak bylo v nedávné době bezpečně prokázáno. To může být velmi výhodné např. pro mladé semenáčky stromů, pokud vyrůstají v silně zastíněných podmínkách a mají tudíž nedostatek asimilátů. Přesun části asimilátů ze starších, výhodněji exponovaných jedinců (i jiného druhu!) může zajistit jejich přežití a zrychlení růstu. Síť mycelia dokonce může zprostředkovat i úplné a trvalé parazitování některých nezelených rostlin (např terestrických orchidejí z čeledi hnilákovitých, Monotropaceae) na blízkých dřevinách. Charakteristické útvary na kořenech rostlin s vyvinutou mykorhizou dvou nejčastějších typů.. Mykorhiza usnadňuje rostlinám příjem vody a minerálních živin. Daleko největší význam má pro příjem fosforu, kterého je v půdním roztoku vždy jen nepatrná koncentrace a transport fosfátových iontů ke kořenům rostlin ze vzdálenějších míst je velmi pomalý. Hyfy hub podstatně zvětšují sorpční povrch (délka hyf je až tisíckrát větší než délka kořenů!), a tím zrychlují odběr živin i z málo koncentrovaného půdního roztoku. Význam mykorhizy vzrůstá nejen v živinami chudé půdě, ale také při malé půdní vlhkosti, kdy difúze vody a solí k sorpčnímu povrchu kořenů je zvláště zpomalena. Mykorhiza je samozřejmě výhodná i pro zúčastněné houby, které získávají z rostliny organické látky (hlavně cukry a aminokyseliny). Tento odběr představuje přibližně 5 až 10 % všech asimilátů vytvářených fotosyntézou. Arbuskulární mykorhiza, na rozdíl od ektomykorhizy, je velmi proměnlivý typ vzájemného vztahu, jehož intenzita velmi kolísá v průběhu roku. Snadno může také přejít od oboustranně výhodné symbiózy k parazitismu. Rychlost výměn uhlíkatých látek a fosforu mezi houbou a rostlinou velmi závisí na vnějších podmínkách i na vývojovém stádiu rostliny. Proto také rostliny s mykorhizou nemusí mít vždy rychlejší růst (či výnos u zemědělských plodin) ve srovnání s rostlinami stejného druhu bez mykorhizy. Růstová deprese infikovaných rostlin bývá obvykle pozorována na půdách s dostatkem fosforu. V současné době se množí důkazy o velkém významu mykorhizy pro ochranu kořenů před infekcí patogenními mikroorganismy (hlavně houbami). Zvláště u druhů s kořeny hodně větvenými, které mají velké množství citlivých meristematických zón, může převažovat tato ochranná funkce nad nutričními výhodami, které z mykorhizy mohou plynout. Poznatky o významnosti mykorhizy pro růst a zdravotní stav rostlin se rychle přenášejí i do zemědělské praxe. Semena celé řady plodin (zejména obilovin) se již nezřídka ošetřují před výsevem inokulem vhodných kmenů mykorhitických hub. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 34 Reakce rostlin na patogenní organismy a ochrana před herbivory Interakce s herbivory Rostliny jsou vystaveny stálému nebezpečí poškození svých orgánů mnoha druhy živočichů, zejména z početných skupin fytofágního hmyzu, ale i pastvou evolučně vyspělejších býložravců. Kromě mnoha morfologických a morfogenetických adaptací k omezení herbivorie (např. ostré trny či trichomy, vysoký obsah tuhých sklerenchymatických pletiv či schopnost rychlé regenerace poškozených orgánů) jsou také velmi časté i rozmanité biochemické adaptace. Z velkého množství sekundárních metabolitů, které se syntetizují v rostlinách, mnohé působí odpudivě až toxicky na herbivorní živočichy. Z hlediska množství, v jakém se vyskytují, lze je rozdělit do dvou kategorií. První z nich zahrnuje látky kvalitativně významné, které se sice vyskytují jen v malých koncentracích, ale zato jsou pro živočichy velmi toxické. Patří sem nejrůznější alkaloidy, glykosidy uvolňující kyanovodík, glukosinoláty a mnoho dalších. Rostliny s kvalitativně významnými ochrannými metabolity jsou sice před většinou herbivorů dobře chráněny, nicméně bývají ohrožovány specializovanými škůdci, kteří v koevolučním procesu získali dokonalou rezistenci vůči příslušnému toxinu (např. vytvářejí specifický enzym, který je schopen toxin inaktivovat). Do druhé kategorie řadíme kvantitativně významné metabolity, které sice nejsou tak toxické, ale ve větším množství (často tvoří více než 10% sušiny!) způsobují špatnou stravitelnost, nechutnost až toxicitu (např. lignin, taniny a fenolické látky). Energetická náročnost syntézy těchto metabolitů je vysoká a rostliny, které jsou jimi vybaveny, mají obvykle pomalejší růst. Tato zdánlivá nevýhoda však za jistých okolností může být vyvážena bezpečnější ochranou před poškozením, neboť jen málo živočišných druhů ji dokáže překonat. Interakce býložravých živočichů s rostlinami je do značné míry dynamický proces, ve kterém hrají významnou úlohu také stresové reakce postižené rostliny. Jejich podrobný výzkum je teprve v začátcích. Přesto je dokázáno, že syntéza toxických metabolitů, např. inhibitorů proteáz, se může až překvapivě rychle zvýšit po napadení rostliny živočišným škůdcem. Ke zrychlení syntézy dochází nejen v narušeném orgánu, ale i v ostatních částech rostliny, které nebyly narušeny. To ovšem vyžaduje přenos signálu, ke kterému může být využita jak chemická cesta (pomocí sloučenin typu fytohormonů, např. jasmonové kyseliny, viz obrázek), tak i změny elektrického potenciálu. Dokonce existují důkazy o bezkontaktním přenosu signálu k tvorbě inhibitorů proteáz z poraněné rostliny na sousední zdravé rostliny pomocí těkavé sloučeniny metyljasmonátu. Schéma přenosu signálu pomocí jasmonové kyseliny, která se tvoří z linolenové kyseliny (dehydrací a β-oxidací) za účasti enzymu lipoxygenázy. Linolenová kyselina je uvolňována membránově vázanou lipázou po její aktivaci signálem přeneseným z receptoru. Tato cesta, běžná při poranění listu herbivory i některými patogeny, vede zejména k tvorbě inhibitorů proteáz, které působí herbivorům poruchy trávení. (G = G-protein, PK = proteinkináza). STRESOVÁ FYZIOLOGIE 35 Reakce na patogenní mikroorganismy Kromě živočichů ohrožují rostliny i patogenní mikroorganismy (viry, bakterie, houby). Jejich průnik do buněk je sice ztížen pevnou buněčnou stěnou, avšak ani ta není pro řadu z nich nepřekonatelnou překážkou. Především patogenní houby disponují celou řadou velmi účinných lytických exoenzymů. Není snad potřeba připomínat, že také každé mechanické poranění rostlinných orgánů představuje otevřenou bránu infekci. Nejen průnik, ale často již kontakt patogenního organismu s buňkou vyvolává celou řadu koordinovaných vnitrobuněčných procesů, jejichž cílem je omezit či zcela eliminovat jeho vstup a šíření do dalších buněk. Jen málo z těchto procesů má zcela obecný charakter, spíše lze pozorovat velkou rozmanitost u jednotlivých skupin rostlinných druhů i u jednotlivých orgánů. Na počátku všech obranných reakcí musí ovšem být podnět k jejich spuštění, kterým obvykle bývá specifický metabolit (elicitor) uvolňovaný při počáteční interakci buňky s patogenem a identifikovaný vhodným receptorem hostitelské rostliny. Jako elicitory mohou sloužit jednak některé metabolity vylučované patogeny (exogenní elicitory, např. některé polysacharidy, specifické enzymy a peptidy), ale i sloučeniny, které se uvolňují z narušovaných buněčných stěn obou organismů (endogenní elicitory). K těm patří např. oligomery chitinu, oligoglukany a glykoproteiny uvolňované hydrolýzou buněčné stěny patogenních hub, či oligogalakturonany uvolňované z buněčné stěny napadené buňky. Většina obranných reakcí rostliny je závislá na aktivaci vhodných genů. Elicitory obvykle neovlivňují genovou aktivitu přímo, ale zprostředkovaně pomocí specifických receptorů v plazmatické membráně a navazující sítě vnitrobuněčného přenosu signálu, jejíž obecné rysy byly již zmíněny. Způsob vlastního přenosu se může lišit podle typu elicitoru a intenzity jeho působení. Kromě "klasické" signalizace zvýšenou koncentrací iontů vápníku a aktivací proteinkináz bývá velmi často pozorována i tvorba superoxidu a dalších aktivních forem kyslíku vyvolaná elicitory . Na signalizaci se podílí především peroxid vodíku, jehož zvýšené množství je možné zjistit už po 5 až 10 minutách působení elicitoru. Kromě možného přímého účinku peroxidu vodíku na expresi genů existuje ještě nepřímá cesta, při které nejprve peroxidací lipidů v membránách vzniká kyselina jasmonová a metyljasmonát a ty pak ovlivňují transkripci Při napadení rostliny patogeny se rychle zvyšuje tvorba etylénu, který se rovněž podílí na iniciaci genové exprese, a to i v buňkách sousedících s buňkou napadenou.Vlastní obranné reakce zahrnují jednak tvorbu specifických stresových proteinů a jednak syntézu a hromadění chemicky jednodušších sloučenin s výrazným antibiotickým účinkem. Proteiny indukované patogeny tvoří mimořádně početnou a různorodou skupinu, která je dále dělena na podskupiny podle velikosti a podle převažujících funkcí. Kromě mnoha obecně stresových proteinů, jejichž význam pro zvýšení nespecifické odolnosti a nápravě poškozených částí buněk byla již zmíněna, vyskytují se zde některé proteiny se specifickými STRESOVÁ FYZIOLOGIE 36 antimikrobiálními účinky. K těm patří zejména enzymy chitináza a 1,3-β-glukanáza, které jsou schopny hydrolyzovat buněčnou stěnu patogenů a přitom produkovat elicitory dalších obranných reakcí. Silné fungicidní účinky mají proteiny inaktivující ribozómy. Zvláštní skupinu obranných proteinů tvoří tioniny, které lze nalézt velmi rychle po kontaktu buňky s patogenem v buněčné stěně. Působí na široké spektrum patogenů, pravděpodobně vytvářením pórů v jejich membránách. Velmi rychle jsou také indukovány proteiny přenášející lipidy. Kromě přenosu lipidů do organel jsou potřebné i k tvorbě zesílené kutikuly. U několika dalších stresových proteinů indukovaných patogeny byl zjištěn silný antivirový účinek. Sekundární metabolity s ochrannou funkcí jsou u některých druhů rostlin přítomny trvale, i když v menším množství než při infekci. Patří k nim nejrůznější flavonoidy, terpenoidy, fenolické látky a alkaloidy, které bývají souhrnně označovány jako fytoncidy či inhibitiny. Zvláštní skupinu specifických nízkomolekulárních obranných látek tvoří fytoalexiny, které se za normálních okolností v buňkách nevyskytují, ale začnou se vytvářet až po napadení patogenem. V současné době je známo více než 300 fytoalexinů, které po chemické stránce patří mezi velmi různorodé typy sloučenin. U systematicky příbuzných druhů se obvykle vyskytují také podobné druhy fytoalexinů. Tak např. u rostlin čeledi Fabaceae převažují izoflavonoidy, u jiných čeledí to mohou být seskviterpeny (Solanaceae), diterpeny (Poaceae), furanokumariny (Apiaceae), či stilbeny (Vitaceae). U téže rostliny se někdy mohou tvořit dva i více různých typů fytoalexinů. Většina z těchto sloučenin je lipofilní povahy, což jim usnadňuje pronikání přes plazmatickou membránu patogenů. Poškození membránových funkcí patří také k nejčastějším mechanismům působení fytoalexinů na patogenní organismy. Fytoalexiny mají vysoce toxické účinky již v koncentracích od 10-6 M hlavně na patogenní houby, méně pak na bakterie. V horní části obrázku jsou uvedeny chemické vzorce dvou hojných fytoalexinů: rishitin (seskviterpenový derivát z infikovaných brambor) a glyceollin (izoflavonoid z rostlin sóji). V dolní části obrázku je znázorněn jednoduchý způsob inaktivace fytoalexinu pisatinu v rostlinách hrachu patogenní houbou Nectria haematococca. Poměrně častá a překvapivě účinná reakce na průnik patogenů je řízená tvorba ochranných nekróz. V napadené buňce mohou být během několika desítek minut po kontaktu houbové hyfy s plazmalemou spuštěny biochemické procesy vedoucí k rychlé zkáze jak vlastní buňky, tak i houbové hyfy. Při této tzv. hypersenzitivní reakci dochází k rozpadu membránového systému hlavně náhlým zvýšením koncentrace aktivních forem kyslíku ("oxidative burst") a aktivací lipáz, i když někdy je provázeno tvorbou některých dalších toxických látek (např. polyfenolů). Tvorba aktivních forem kyslíku obvykle začíná aktivací NADPH-dependentní superoxidsyntázy v plazmatické membráně vhodnými elicitory vylučovanými buď přímo patogenem či vznikající po narušení buněčné stěny a plazmalemy. STRESOVÁ FYZIOLOGIE 37 STRESOVÁ FYZIOLOGIE 38 Současně také dochází k inhibici antioxidačních enzymů v buňce. V konečném důsledku pak dochází k rychlé peroxidaci a k rozpadu membránových systémů, a tím i ke smrti buňky. V další fázi dojde k odumření buněk i v blízkém okolí místa infekce. Lokalizovaná nekróza většinou dosti spolehlivě zastaví pronikání a další šíření infekce. Jiným typem obranných reakcí rostlin je rychlé zvýšení tvorby polysacharidu kalózy (1,3β-glukan), který pak vyplňuje buňky v okolí infikovaného místa. Kalóza je velmi odolná vůči houbovým hydrolázám. Pokud je šíření infekce pomalé, pak se po jisté době může poblíž ohniska infekce založit sekundární meristém (felogen), produkující silně suberinizované či lignifikované buňky s velmi dobrou ochrannou funkcí. Někdy dochází i k tvorbě odlučovací vrstvy a celá infikovaná část rostliny odpadne. Uvedená ochranná opatření rostlin vůči patogenům nejsou samozřejmě zcela nepřekonatelná, zejména pro některé silně virulentní kmeny hub. Jejich úspěšnost spočívá jednak v mimořádně rychlém růstu hyf (šíří se rychleji než se stačí aktivovat obranné reakce), jednak v tvorbě specifických látek (supresorů), které potlačují vznik hypersenzitivní reakce, tvorbu stresových proteinů a ostatních ochranných metabolitů. Patogenní houby také disponují bohatým arzenálem buněčných jedů, jako je např. fusicoccin (diterpenglukozid houby Fusicoccum amygdalii) způsobující hyperpolarizaci buněčných membrán silnou stimulací činnosti protonových pump. Detailním studiem interakcí rostlin s patogenními organismy se zabývá specializovaný vědní obor fytopatologie.