Zajištění exprese klonovaných genů a její optimalizace Faktory ovlivňující expresi klonovaných genů A. Regulační sekvence pro genovou expresi 1. Transkripční úroveň • Síla promotoru a jeho charakter • Terminátor transkripce • Stabilita mRNA, její posttranskripční úpravy 2. Trans lační úroveň • Účinnost vazby mRNA na ribozom • využívání kodonů • stabilita proteinu, posttranslační úpravy 3. Transport proteinu • charakter signální sekvence B. Vlastnosti vektorů • Počet kopií vektoru (počet kopií inzertu) • Stabilita vektoru C. Fyziologie hostitelské buňky • růstové podmínky • enzymový aparát hostitelské buňky Signály ovlivňující transkripci a translaci strukturního genu (bakterie E. coli) Regulační signály pro transkripci Regulační signály pro iniciaci translace _ TGTTGACA +1 sn TATAATG TAAGGAG ATG -35 ■10 Vedoucí sekvence mRNA Signální peptid Klonovaný gen protein STOP Faktory ovlivňující expresi klonované DNA Regulační sekvence vektoru Vlastnosti inzertu QI Promotor +1 Klonovaný strukturní gen, cDNA P T vedoucí oblast síla promotoru Využívání kodonů 1. signály pro iniciaci translace 2. signály pro transport Terminátor transkripce 1. sekundární struktura mRNA 2. signály pro sestřih (3' a 5' místa intronu) Sekvence bakteriálních přirozených a hybridních promotorů COISfŠENŠlíS ISC trp ■" XPL recA -35 Region 17 bp -10 Region 12 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617 * * * TTGACA ••••••••......•TAT A AT ♦f! G G C T T T A C A C T T T A T G C T T C C G G C T C G T A T A T T G T CTGT TGACAATT AATCAT CGAACTAGT TAACTAG G TG T T GACA TA AA TACCA C TG Ö CG G t G ÁT AC TG A CACT TGATACTGTA T G A A GCATACAGTATAAT TG tací radií CTGT TGACAATTAATCAT CT G T T G A CAATTAATC AT CGGCT C G T ATAA T G T CGAACTAGT T T A A T GT Hybridní promotory 15-18 bp 5-9 bp Sekvence lac, trp a tac promotoru -35 consensus 5'-TTGACA-3' .Uč: S'-...TTTACACTTTATGCTTCO -10 consensus 5'-TATAAT-31 -35 -10 RBS ATG...-3' Protein trp : 5'-...TTGACAATTAATCATCG AACTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGACA ATG. -35 -10 tac: 5'- TTGACAATTAATCATCC RBS Protein [-GGAATTGT^GCOaATAACAATTTCACACAOGAAACAadl ATG. . . -3 -35 -10 RBS Protein Hybridní promotor Regulovatelné promotory používané v expresních vektorech Promotor Zdroj Způsob regulace £ coli lac-UV5 nezávislost na katabolické represi XpL, XpR lac trp tac phoA recA tet Leftward and rightward early promoters oř X £. cofifac operon £. eoli trp operon trp-35 region /ae-10 region hybrid £ co/Zalkaline phosphatase operon £. co/irecA gene Tn 10 tetracycline-resistance gene 30*C Tryptophan in medium Excess phosphate in medium On >37*C tin clas, host) IPTG in imedium Indoleacetic acid in medium tPTG.in medium Phosphate-limited medium Mitomycin C in medium Tetracyclines in medium Promotory fága lambda vykazují velmi striktní kontrolu transkripce s krátkým lagem mezi neindukovaným a indukovaným stavem. V neindukovaném stavu nedochází vůbec k transkripci, na rozdíl od promotorů „metabolických" operonů, kdy částečná transkripce probíhá pořád. Promotor Zdroj Způsob regulace Off B. subtí/is bia cat Streptomyces gyt S. cerevisiae ADH GAL1 GPD-PH05 Bacillus licheniformts ^-lactamase gene Bacillus pumilis chloramphenicol acetyl transferase Streptomyces coelicolor glycerol operon Yeast repressible alcohol dehydrogenase {ADR) gene Yeast galactose utilisation operon Hybrid between yeast gtyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase and alkaline phosphatase gene promoters Glucose in medium High glucose in medium Glucose in medium Excess phosphate in medium On (J-lactams in medium Chloramphenicol in medium Glycerol in medium Low glucose in medium Galactoseiin medium Phosphate-limited medium Vliv vzdálenosti mezi promotorem a startem translace na množství vytvářeného proteinu cro změny vzdálenosti Transcription from íac promoter -> Recognition sequence for endonuclease Bam HI Translational start signal for cro gene SD lac SD cro I-1 AATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACÁGGÄAACASGATCCGGGACTATTTTACG^ TTAACACTCGCC TAT TGT T AAAGTGTGTCOTTTGTCCT AGGGCC TGAT A AA A TGG AT ACCGCC ACT A T T ACC A ACGT AC A TG AŤTCC'TCGA AC AT AC Delece různého rozsahu < ŕ pTR213 pTR199 pTR214 PJR188 pTR194 PTR210 pTR182 ^ pTR190 1.63 J 0.085 1.00 0.65 0.51 0.85 0.0012 <0.00O6 1 Relativní množství produkovaného proteinu cro Sekundární struktura cro-mRNA Iniciační kodon AUG je součástí smyčky - protein cro se tvoří v malém množství Vliv regulačních sekvencí na výtěžek t-antigenu SV40 z různých plazmidových konstruktů % celkového proteinu Vzdálenost SD-ATG Sekvence oblasti pro iniciaci translace vektor 0.068 9 AGGAAACAGAAAGATGGAT pTR436 1.0 9 AGGAAACAGCCAGATGGAT HP1 0.01 5 GTCGAGGAATTCCATGGAT pPLcSVt5-372 0.1 5 ATTGGAATTCCATGGAT pPLcSVt5-37 2.5 8 TTGGAATTATTCCATGGAT pPLcSVt5-379 1.0 9 TTGGAATTAATTCCATGGAT pPLcSVt5-374 0.01 9 AGGAATTCCAAAGATGGAT a ▲ pPLcSVt5-72 SD Inic.kodon Sekundární struktura mRNA (pro t-antigen) v oblasti iniciačního kodonu v různých plazmidových konstruktech Množství proteinu^ AUG 1,0 C Q ,U. ,u. u ^0&' A.1- UCACACAGGAa CCUUCAGI^C kftÚÚ (itÚttil U AUAA GGGGGUC CG Q H U G A u g . a A g U-A g-C U-A U-A A-U A-U SD 1,0 ***** AO-u c c|Xi a egu U,C,U Ú A X-g- c-g '^.-Aj-U G-A-A,A A-U A U Q AU U-G-G U-A U-A C li U-A A-U ■A-U G-C G-C A-U G-C . GiA-U G U-A- u U U U A A A AAÁÁÁÁilUÚ u-a A i a-u u . a ££. acqgaAa \-G^' rq—c. AUC..- .aCagag * a g g u a ug.cua a-u a-u a-u ..a-u-g-g.^ I r-J ÍA-íu-AjA-^ A.r C-'[Gj c_g'a U .Uuuga ucacacaggaa CrUUCAGGC ^ Aíáčnó óčúccÚúauaaggggguccí;,, g G u G A 6 A ■3' Posun vzdálenosti mezi promotorem a klonovaným genem BamH\^=-*EcoR\ BamHX Štěpení EcoRI I BamHX kohezní EcoRIkonce / \ i ľ klonovaný gen T4-ligáza EcoRI Štěpení BamH\ klonovaný gen EcoRI Štěpení Exolll a S1 nukleázami klonovaný gen EcoRI různý rozsah odbourání DNA u jednotlivých molekul /\ EcoRI r- klonovaný gen /ac-Promotor-fragment (95 bp) posun vzdálenosti klonovaný gen EcoRI Použití teplotně senzitivního represoru CI857pro regulaci promotoru Pl fága X Promotory fága lambda vykazují striktní regulaci transkripce s krátkým lagem mezi neindukovaným a indukovaným stavem. V neindukovaném stavu k transkripci vůbec nedochází, na rozdíl od promotorů "metabolických" operonů, kdy částečná transkripce probíhá stále. Problém s termoindukcí u ts promotorů je ve velkokapacitních nádobách, kde je obtížné zvýšit rychle teplotu z 30 na 41 °C. chromozom E. coli cl857 ----1-—I----Lambda cl857-lysogen Při 32°C se termolabilní represor cl857 kódovaný genem cl na chromozomu váže na operátor 0L na plazmidu a zabraňuje transkripci z promotoru PL. Zvýšením teploty na 41 °C je represor inaktivován, uvolní se z operátoru a transkripce klonovaného genu probíhá. Regulace genové exprese promotorem pL fága X mRNA Active cl protein 30°C Při 30°C se ts-represor cl, který je konstitutivně syntetizován pod kontrolou vlastního promotoru pel, váže na operátor oL promotoru pL a tím zabraňuje expresi cílového genu pcI cl gene TT Produkt se netvoří oL pL Target gene TT mRNA cl gene TT Active cl protein Inactive protein Produkt se tvoří oL pL Target gene TT Při 42°C je ts represor cl inaktivován a dochází k transkripci cílového genu Expresní vektory obsahující T7-promotor RNA-polymeráza T7 rozpoznává pouze promotory genů fága T7 Gen kódující T7-polymerázu Regulace genové exprese cílového genu kontrolovaná promotorem pT7 fága T7 17 RNA polymerase 0!k plac T7 RNA TT polymerase gene p77 Target gene TT Za nepřítomnosti induktoru (IPTG) represor lac reprimuje syntézu T7-polymerázy, která je pod kontrolou lac promotoru a lac operátoru a cílový gen se nepřepisuje. Po přidání IPTG je lac-represor inaktivován, T7-polymeráza se tvoří a je přepisován cílový gen mRNA Jací tací gene TT Gen lad může být na jiném vektoru než gen pro T7-polymerázu a cílový gen Systém T7 pro expresi proteinů v E. coli DE3 E. coli RNA poíymerase lac repressor Toxicita T7 lysozymu pro buňku Druhý vektor určený k inaktivaci nízké hladiny T7-pol vytvářené i bez indukce Terminátory transkripce používané v expresních vektorech u E. coli a) terminátory TI a T2 bakteriofága lambda b) terminátory TI a T2 z operonu rmB rRNA E. coli používají se v tandemu Účinná terminace transkripce je esenciální pro dosažení vysoké hladiny exprese: - zvyšuje stabilitu mRNA, - zvyšuje hladinu akumulovaných proteinů. Silné terminátory se zařazují rovněž před inducibilní promotory, aby zabránily transkripci z promotorů lokalizovaných před klonovaným genem („read-through") Stabilita mRNA Rychlost syntézy proteinu závisí na množství mRNA v buňce Existuje rovnováha mezi syntézou a rozkladem daného druhu mRNA/turnover/ Snížení rozkladu mRNA (kombinované působení endonukleázy a 3 exonukleázy) u E. coličiní poločas rozpadu molekul mRNA 1-2 minut poločas rozpadu mRNA genu 32 bakteriofága T4 je 20 minut a více - za zvýšenou stabilitu jsou odpovědné specifické sekvence, které se nacházejí před iniciačním kodonem genu 32 - díky této 5' nepřekládané sekvenci mohou být také stabilizovány jiné mRNA molekuly. Konstrukce plazmidu s expresní kazetou genu 32, pomocí níž je možné v buňkách E. coli syntetizovat velká množství cizích proteinů. Vzniklé hybridní transkripty mají dlouhou životnost. Poločas rozpadu se podle klonované sekvence pohybuje od 4 do 10 minut. Zajištění účinné translace Interakce mRNA s 16S rRNA při iniciaci translace 16 S rRNA 3' AU UCCUCC ftCUAG „IÁGGÁggÚI ■ S-D sequence U u 5' / U mRNA U Iniciační kodon G A C C U A U G -U A C C G A G C U J 3 5 f Me t Kromě iniciačního kodonu AUG existují v RBS ještě tři další oblasti, jejichž sekvence jsou více či méně konzervovány: 1. Shine-Dalgarnova sekvence, níž se obvykle vyskytuje sekvence 5'UAAGGAGGU 3'. 2. U mRNA (alespoň polycistronické) jsou součástí RBS jeden nebo více terminačních kodonů. 3. U genů, které jsou silně exprimovány (např. geny pro fágové kapsidy nebo ribozomální proteiny), se v RBS nachází sekvence PuPuUUUPuPu (nebo sekvence jí podobná). Bývá označována též jako RRUUURR sekvence. Může se vyskytovat vedle SD-sekvence nebo místo ní. Ukazuje se, že přítomnost této sekvence je nezbytná pro translaci eukaryotických genů v E. coli, jak bylo zjištěno při expresi malého T antigénu SV40. Synteticky připravené ribozomové vazebné místo 1. S-D sekvence - 2. RRUUURR (GGTTTAA) 3. Terminační kodon TAA klonovaný gen v , , TAAGGAGGTTTA , , smer k promotoru +— ........... / —► kódující sekvence 3' ACGTATTCCTCCAAATTCGA 5' í í Psti kohezní Hind\\\ kohezní místo místo Zajištění účinné translace použitím optimalizované RBS gen bez RBS a ATG, s terminačním kodonem lze pozměňovat sekvenci nebo vzdálenosti Syntetické RBS Gen zájmu vložen za RBS Různé čtecí rámce vzhledem k iniciaci translace genů lacZ u tří různých vektorů ,—i ,—i čtecí rámce 01 142UV5 A ATT C G C TTAA Proximální část genu pro (3-gal 02 ÁAZ2 GGG CCC TTAA A ATT C li inzert EcoRI + 2GC inzert + 2GC 03 ÁAZ3 GGGGG CCCCC TTAA A ATT C inzert V devátém kodonu genu pro p-galaktozidázu je jedinečné místo pro EcoRI. Čtecí rámec, který tímto EcoRI místem začíná, byl označen jako 1. Byly připraveny AAZ vektory se zabudovaným fragmentem v čtecích rámcích O2a03 připojením 2GC. Zvýšení genové exprese konstrukcí homopolycistronické sekvence A A i i - RBS RBS RBS RBS 11=1 jeden promotor jeden terminátor více kopií genu A Transcription Transcription from multiple RBSs Srovnání využívání kodonů silně a slabě exprimovaných genů u E. coli u u silně/slabě Phe Leu 39 113 151 102 12 1G 71 64 Leu 26 33 -* 3 34.5 73 69 22 294 lle I 67 262 156 118 Met 140 27 130 Val 192 41 119 83 108 66 .48 123 silně/slabě Ser 93 36 87 49 6 37 12 62 Pro 21 2 29 46 26 45 162 101 Thr. 103 46 137 119 15 32 28 70 Ala 173 87 48 178 119 107 129 149 silně/slabě Tyr < 34 98 96 65 ochre amber His i Gin 19 75 38 95 59 90 169 156 AsnJ Lys 13 101 159 98 259 163 106 44 Asp Glu 116 183 204 ,106 333 210 106 98 silně/slabě 13 34 CYS { 23 39 opal Trp 25 eg Arg 223 §§ ioi 133 ■> 3 -> 1 27 42 Ser Arg 10 56 49 61 3 28 -v 1 17 Gly 226 124 174 140 4 ^14 42 66 u c A G U C A G U C A G U C A G Silně exprimované geny představuje 24 druhů mRNA s celkovým počtem 5253 kodonů. Mezi tyto geny patří gen pro RNA-polymerázu, geny pro dvanáct ribozomých proteinů, několik proteinů vnější membrány a geny pro elongační translační faktory. Slabě exprimované geny představuje 18 druhů mRNA s 5231 kodony. Patří sem několik represorových genů, gen pro transponázu a p-laktamázu. Kodony, které jsou čteny jen jedinou tRNA a jejichž výběr je závislý na povaze a síle interakcí mezi kodonem a antikodonem, jsou v rámečku. Šipkami jsou označeny kodony, které jsou používány jen zřídka a mohou se podílet na regulaci genové exprese. Řešení problému rozdílného využívání kodonů 1. Koexprese genů pro tRNA pro alternativní kodony příprava kmenů s klonovanými geny pro tRNA na samostatných vektorech kmen E. coli Rosetta má geny pro tyto tRNA na plazmidu, který je kompatibilní s expresním vektorem. 2. Změna méně často používaných kodonů mutagenezí in vitro za kodony používané častěji (pracnější postup) Dosažení vysoké exprese cizorodého genu v kmenech E. coli obsahujících geny pro vzácné tRNA Standardní kmen Upravený kmen E. coli host cell E. coli host cell Plazmid s cizorodým genem 1 1 Low level of foreign gene expression Plazmid s cizorodým genem High level of foreign gene expression Overproduced tRNA Zvýšení stability cizích proteinů v E. coli Změna lokalizace (poločas krysího proinzulinu v E. coli\e v cytoplazmě 2 min, v periplazmě 10 x vyšší) Tvorba fúzních proteinů (bakteriální + eukaryotická část = beta-galaktozidáza + somatostatin, pak štěpení fúzního proteinu) Exprese v mutantách E. coli s nižší aktivitou intracelulárních proteáz (lon-proteáza - zabraňuje akumulaci denaturovaných nebo jinak pozměněných polypeptidů). Snížení degradace proteinů produktem genu pin fága T4 (protease inhibition) - stabilizace eukaryotických proteinů (interferon) Zvýšení stability proteinů změnou sekvence jeho aminokyselin Stabilita (3-galaktozidázy po přidání aminokyselin k jejímu N-konci Přidané minokyseliny Poločas Met, Ser, Ala >20 h Thr, Val, Gly >20 h Ne, Glu >30 min Tyr, Gin -10 min Pro ~7 min Phe, Leu, Asp, Lys -3 min Arg ~2 min PEST = aminokyseliny (prolin P, glutamová kys. E, serin S. treonin T), jejichž přítomnost v určitých vnitřních oblastech proteinu zvyšuje jeho citlivost k proteolytické degradaci Vytváření fúzních proteinů Fúzní protein: produkt vytvořený po spojení dvou nebo více genů/sekvencí: 1. Přirozený gen hostitelského organismu = stabilizující partner (cizí proteiny jsou v heterologních systémech často nestabilní) 2. Cizorodý gen (gen zájmu ) 3. +/- spojující sekvence (oligonukleotidový linker), kódující krátké úseky aminokyselin rozpoznávané nebakteriálními proteázami umožňují dodatečné odštěpení cílového produktu z fúzního proteinu používají se k purif ikaci rekombinantních proteinů Klonovací vektor pro přípravu fúzních proteinů Selekční marker Zkrácený gen pro p-galaktozidázu, vložený mimo čtecí rámec genu ompF N-terminální část genu ompF Abcl lacZ L Klonovací místo Signály pro transkripci, translaci a sekreci fúzního proteinu Abel Cut with Abcl Gene lacZ Abcl Cizorodý gen ■ ■ ■ ■ • • Tribridní protein ♦ ♦ ► Např. antigen pro přípravu protilátek Některé fúzní systémy používané k purifikaci cizorodých proteinů vytvářených v E. coli Fuzni partner Velikost Ligand Pod m inky eluce ZZ 14 kDa igG Low pH His tail (tag) 6-10 aa Ni2+ Imidazole Strep-tag 10 aa Streptavidin Iminobiotin PinPoint 13 kDa Streptavidin Biotin MBP 40 kDa Amylose Maltose (3-Lactamase 27 kDa Phenyl-boronate Borate GST 25 kDa Glutathione Reducing agent Flag 8 aa Specific MAb Low calcium ZZ = fragment proteinu A (S. aureus); His = histidin; Strep-tag = peptid s afinitou ke streptavidinu; PinPoint = fragment proteinu biotinylovaný in vivo v E. coli; MBP = protein vázající maltózu; GST = glutation S-transferáza; Flag = peptid rozpoznávaný enterokinázou; Mab = monoklonální protilátka. Puriflkace fúzních proteinů imunoafínitní chromatografíí interleukin-2 markerový peptid O ' další proteiny Výchozí koncentrovaná ^- směs sekretovaných proteinů Polypropylenová podložka Protilátka proti markerovému peptidu /LVU w \ Markerový pepetid se váže k protilátce Další proteiny procházejí kolonou >-! Fúzní protein je eluován 35 Fágový displej Vystavení proteinů/peptidů na povrchu bakteriofága antibody fragments (scFv) oene 3 protein (minor coat protein) gene 6 protein [minor coat protein) gene 6 protein [major coat protein) antibody genes (for Vh and V|_) gene 3 Phage Library -various peptides- gene 7 and 9 proteins (minor coat proteins) Proteolytické štěpení fúzního proteinu krevním koagulačním faktorem Xa Rozpoznávací linkerová sekvence štěpená Xa Místo štěpení i . . . Thr-Ala-Glu-Gly-Gly-Ser-lle-Glu-Gly-Arg-Val-His-Leu v__J \__J Část prvního proteinu Funkční protein klonovaného genu Linkerová sekvence není štěpena bakteriálními proteázami Fig. 7-79. Thin sections of E. coli bacteria showing granules of ß-galactosidase/proinsulin fusion peptides (fixed in formaldehyde/glutaraldehyde according to Karnofsky; embedded in Epon; stained with uranylacetate/lead hydroxide; 38 000:1; Courtesy of Dr. W. Wetekam, Hoechst AG). Tři možné způsoby transportu sekretovaných proteinů Growth medium Outer membrane Periplasmic space Inner Signal Pullulanase Signal membrane peptidase complex peptidase Cytoplasm A. obecná exportní dráha (generál export pathway, GEP) - SP + Sec proteiny (chaperony) B. dráha IgA-proteázy (SP + C-konec proteinu) C. dráha nezávislá na SP - vyžaduje ABC-transportery (ATP-dependentní transportní proteiny) Příklady signálních sekvencí různých proteinů Konec ss -3* -jji" -32 -31 -30 -29 -28 -71 -26 -2S -2'. -23 -2? -?1 - 2-i> «-1 -19 -17 -16 -1S -li. -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -t, -3 -2 Í. -,9 "1£* "lj -»*■ -ld -11 _1U "9 "8 "7 "6 ** "J '* J i et phe teu pro leu leu ala leu leu val leu trp glu pro lys pro ala glu ala ptv Preproinsulin (RatHS) met ala leu trp arg^Iet phe teu pro leu leu ala leu leu val leu trp glu pro lys pro ala glu ala ^he Pre-lmmunoglobulin-K-light chain (Mouse)IS) met asp metarg'ala pro ala gin ile phe gly phe leu leu leu leu phe pro gly thr arg cys*asp Pre-Lysozyme (Chicken)tS) met arg ser- leu leu ile leu val leu cys phe leu pro leu ala ala leu gly lys ' ' i Pre-Growth hormone IRatl(S) met ala ala asp ser gin thr pro trp leu leu thr phe ser leu leu cys leu leu trp pro gin glu ala gly ala leu i ■ Pre-Glycoprofein [Vesicular Stomatitis Virus) IM) met lys cys leu leu tyr leu ala phe leu phe ile his val" asn cys lys,.. J I Pre-p-Lactamase IpBR 322) (S) met ser ile gin his phe arg val ala leu ile pro phe phe ala ala phe cys leu pro val phe ala his i Pre-Maltose-Binding protein |e. coli)[s] met lys ile lys thr gly ala arg ile leu ala leu ser ala leu thr thr met met phe ser ala ser ala leu ala lys I Pre-OmpA-Protein (E.coli) (M) met lys lys thr ala ile ala ile 3la val ala leu ala gly phe ala thr val ala gin ala ala 1. Pre-Coat protein (Phage fdMM) met lys lys ser leu val leu lys ala ser val ala val ala thr leu val pro met leu ser phe ala ata Pre-p-Lactamase met leu lys lys phe ser thr leu lys leu lys lys ala ala ala val leu leu phe ser cys val ala leu ala gly cys ala asn asn gin thr asn ala ser (Bacillus lichenif ormis) IS) Fig. 7-78. Amino acid sequences of iV-terminal signal sequences of various precursors for membrane proteins (M), and a variety of secretory proteins (S). The vertical line indicates the transition from hydrophilic to hydrophobic regions within the signal sequences, the arrow the start of the mature proteins. N-konec obsahující polární aminokyseliny Místo štěpení SP i Hydrofobní aminokyseliny Zralý pFOteíll Instabilita vektorů 1- Segregační instabilita: Ztráta plazmidu, ke které může dojít při dělení buněk v důsledku: chybění funkce par (partitioning) u některých vektorů (pBR322), která zaručuje rovnoměrné dělení kopií do dceřinných buněk. Problém lze řešit selekcí antibiotiky, nebo lze oblast par klonovat, např. z pSC101 do pBR322 a tím plazmidy stabilizovat, vytváření multimerních forem plazmidu a následné nerovnoměrné dědění kopií do dceřiných buněk. Multimerní plazmidy nevznikají u ColE1, který využívá rekombinační systém cer xer, který rozkládá multimery. Toto místo lze klonovat do plazmidu typu pBR322 a eliminovat problémy s multimerizací. Možnou strategií pro překonání segregační instability je eliminace buněk, které plazmid ztratily (např. použití genu cl fága v klonovacím vektoru a využití lyzogenních hostitelů) 2. Strukturní instabilita: Důsledek delecí, inzercí nebo translokací v chromozomech, plazmidech nebo virech (homologní rekombinace a transpozice). Překonání segregační instability vektoru eliminací buněk, které vektor ztratily i Ztráta vektoru l Indukce profága i Lyže buněk Represor cl vytvářený rekombinantním vektorem udržuje buňku v lyzogenním stavu Vektory s dvojím počátkem replikace pro regulaci počtu kopií vektoru P-RNAII nahrazen P-lambda Počátek replikace zajišťující vysoký počet kopií Nízkokopiový počátek replikace ori pSCIOl r Funcc iona! s o r 0/V\ cl repres O I ° chroľiws oiw 30 °C - aktivní je pouze ori pSC101 4 kopie plazmidů/ chromozom hoat: X cl___ lysocen o?/ 1 indukce /OnOOoO C)\ Déo°o°aocg ho it; 1 oIÍJ? lysogen 42°C-inaktivace represoru cl, aktivace ^pl_, aktivace ori ColE1, 140 kopií plazmidů/ chromozom Příprava vektoru s regulovatelným ts-počátkem replikace a s regulovatelným ts-promotorem iáell Fragment c obsahuje ts-ori \ý Haell Haell Cut with Haell Isolate fragment c Haell Cul with Haell Isolate fragments 1 and 3 Fragment 1 obsahuje pL promotor a MCS Fragment 3 obsahuje selekční marker AmpR Li gate Haell Růst v E. coli s genem cl Haell Buňky s pCP3 nejdříve rostou při 28°C, kde je cl funkční a promotor pL je vypnut a počet kopií pCP3 je nízký. Při 42°C je cl inaktivován, pL se aktivuje a počet kopií se zvýší více než lOx / Haell Mol Biotechn 127 Vliv teploty na počet kopií plazmidů u tří expresních vektorů Plazmid Počet kopií plazmidů v buňce Promotor pL 28°C 42°C pKN402 82 512 No pPLc2833 38 42 Yes pCP3 60 713 Yes Důsledky vyplývající z přítomnosti rekombinantního plazmidu v buňkách 1. Snížení růstové rychlosti buněk 2. Změny morfologie buněk, nebo zvýšená fragilita buněk 3. Restrukturalizace klonovaného genu (rekombinace) výběr vhodného plazmidu RC x theta Vliv počtu plazmidových kopií na růstovou rychlost hostitelských buněk E. coli HB101 with plasmid Plasmid copy number Relative specific growth rate None 0 1.00 A 12 0.92 B 24 0.91 C 60 0.87 D 122 0.82 E 408 0.77 Kompetice mezi pomalu rostoucími buňkami produkčního kmene (obsahuje vektor) a rychle rostoucími mutantami (které ztratily vektor) Počet buněk, které ztratily plazmid 106- 105- 104- 103: 1Q2- 101 1 buňka ^4 Mutant {pmax = 0.693 rr1) 1. ztráta rekombinantního plazmidu (x antibiotika) 2. snížení počtu kopií plazmidu 3. restrukturalizace transgenu Parent (umax = 0.347 h"1) 11)10 Počet buněk produkčního kmene -_109 c obsahuje plazmid c a> > & a 1.08 | g "35 r-107 o 2x106buněk Cas 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Time (h) Čas 0 Integrace klonovaného genu do bakteriálního chromozomu A. Klonovaný gen je vložen do sekvence klonovaného úseku chromozomu, 2 x CO vede k integraci klonovaného genu. B. Klonovaný gen je vložen poblíž klonovaného úseku chromozomu, 1 x CO vede k integraci celého plazmidu včetně klonovaného genu. Počet kopií klonovaného genu pro a-amylázu v B. subtilis a její aktivita v buňkách Počet kopií/genom 2 ^ geny na chromozomu 5 7 y 8 9 J Multicopy plasmid (20-40 kopií) Activita (U/mL rostoucích buněk) 500 2,300 3,100 3,400 4,400 700 Gen pro a-amylázu z B. amyloliquefaciens byl vložen do oblasti pocházející z chromozomu B. subtilis nakloňované v plazmidu E. coli, konstrukt byl vnesen do B. subtilis. Plazmid nesl rovněž geny pro rezistenci k chloramfenikolu a ampicilinu. Buňky B. subtilis s plazmidem byly pěstovány v prostředí s chloramfenikolem, což vedlo k selekci buněk se zvýšeným počtem kopií integrovaného plazmidu, tím zvýšení počtu kopií genu pro amylázu a ke zvýšení jejího množství v buňkách. Struktura rozpoznávací sekvence lox P fága P1 GCATACAT t-rACCAAQ-IK! ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ | ATAAGTTČaTAŤ^) GCATACAT,'' ta: i Podle orientace loxP sekvencí je úsek DNA mezi nimi místně specifickou rekombinací prostřednictvím Cre-rekombinázy buď deletován nebo invertován Odstranění selekčního markeru po vnesení plazmidu do bakteriálního chromozomu Site of recombination Marker loxP gene loxP CJoned gene Plasmid Homologous chromosomal DNA Homologous recombination Gen cre je na samostatném + Cre protein <- plazmidu pod kontrolou lac t promotoru (indukce IPTG) Vlivy prostředí ovlivňující expresi genů a tvorbu produktů 1. Složení kultivačního media, zdroje živin (laktóza x glukóza - ovlivňují inducibilní systémy - lac) 2. Teplota (při nižší teplotě bývají cizí proteiny méně toxické) 3. pH 4. Koncentrace kyslíku Důkaz tvorby cizorodého produktu • Imunologické testy • Enzymové testy • SDS-PAGE • Minibuňky • Maxibuňky • Transkripce a translace in vitro Až 80% problému při klonování cizorodých genů spočívá v toxicitě proteinů, zbývajících 20% je způsobeno jinými faktory (např. využívání kodonů) - Toxicita jednotlivých typů rekombinantních molekul pro hostitelské buňky: Rekombinantní DNA není obvykle toxická, pokud neobsahuje repetitivní sekvence (méně než 1 % případů) Funkční rekombinantní RNA může být toxická (asi 15 % případů) Toxické proteiny (více než 80% případů) - normálně je protein vytvářen v určitém kompartmentu buňky, během definované časové periody a v určitém množství (prostorová, časová a kvantitativní exprese) - rekombinantní proteiny jsou vytvářeny do nefyziologických koncentrací - funkce rekombinantních proteinů může být pro buňky škodlivá až toxická -pomalejší růst buněk, nižší hustota buněk 55