Biomembrány
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie – 23.2.2015
prof. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc.
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta MU
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
2
• struktura a vlastnosti biomembrán
praktické aplikace - imunofenotypizace buněk
• fúze membrán a vezikulární transport
praktické aplikace - medicínské aspekty
praktické aplikace - liposomy a micely
• buněčná fúze
praktické aplikace - hybridomová technologie
• transport látek přes membrány
praktické aplikace - dialýza
Program přednášky:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
3
STRUKTURA A VLASTNOSTI
BIOMEMBRÁN
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
4
Lipidová dvojvrstva
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
5
Fluidita membrány
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
6
Složení plazmatické membrány:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
7
Stavba plazmatické membrány:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
8
Funkce transmembránových proteinů:
• přenašeče (Na+/K+ pumpa...)
• spojovací proteiny (intergriny...)
• receptory (EGFR, receptory pro FGF, PDGF, TNF...)
• enzymy (adenylátcykláza...)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
9
Lokalizace transmembránových proteinů:
střevní epitel
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
10
CD markery (antigeny)
• glykoproteiny na povrchu
lidských buněk
• v současnosti cca 250
• imunofenotypizace
(zejména v hematologii)
• nespecifické:
CD47, CD118
• specifické:
CD66b - granulocyty
CD85, CD205 - dendritické buňky
CD133 - kmenové, resp. progenitorové buňky
CD141 - vaskulární endotelové buňky
CD168 - buňky karcinomu prsu
CD207 - Langerhansovy buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
11
Příklady detekce CD markerů: linie HL-60
granulocyty:
CD66b
DAPI
makrofágy:
CD14
DAPI
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
12
Příklady detekce CD markerů:
linie derivované z osteosarkomů
Saos-2: CD133 / DAPI OSA-03: CD133
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
13
CD133
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
14
Imunofenotypizace
myeloidních buněk
Imunofenotypizace
lymfoidních buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
15
Imunofenotypizace buněk
pomocí průtokové cytometrie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
16
FÚZE MEMBRÁN
A VEZIKULÁRNÍ TRANSPORT
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
17
Průběh fúze
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
18
Intracelulární transport
proteinů:
• jadernými póry
• přes membrány
• prostřednictvím
vezikulů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
19
Schéma vezikulárního transportu:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
20
Gaucherova nemoc
• příčinou mutace v genu kódujícím
glukocerebrosidázu (= enzym nutný pro
rozklad glykolipidů v lysozomech)
• AR typ dědičnosti
• zvětšení velikosti a počtu lysozomů s
nedegradovaným materiálem
• základem terapie podávání chybějícího enzymu
(např. preparát Cerezyme)
• kandidát pro genovou terapii (začlenění cDNA
kódující daný enzym do kostní dřeně)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
21
Typ I:
• není zasažen nervový systém
• zvětšení sleziny, jater, poruchy
struktury kostí
• neohrožuje život člověka
Typ II:
• nervový systém je zasažen, poruchy jsou zřejmé
od raného dětství, pacienti umírají velmi brzy
Typ III:
• nervový systém je zasažen (demence), poruchy
se začnou projevovat přibližně od 10. roku věku
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
22
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
23
Gaucher cells
• makrofágy
• vyskytují se izolovaně v postižené tkáni
• pozitivní po obarvení činidlem PAS (Periodic
Acid Schiff)
Pseudo-Gaucher cells
• výskyt u onemocnění spojených s vysokým
turnoverem membrán (chronická
granulomatózní leukémie, mnohočetný
myelom, Hodgkinova choroba, AIDS…)
• ve tkáni se vyskytují ve shlucích
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
24
Gaucher cells
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
25
Příklad endocytózy: LDL (low-density lipoprotein)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
26
Poruchy příjmu cholesterolu
• příčinou porucha struktury LDL-receptoru
• buňky nepřijímají cholesterol
• cholesterol se hromadí v krvi a napomáhá
vzniku aterosklerózy
• většina pacientů umírá v raném věku na srdeční
záchvat (důsledek ucpání tepen zásobujících
srdce)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
27
Tvorba liposomů:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
28
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
29
Liposome-delivery systems:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
30
Využití liposomů a micel pro cílenou aplikaci léčiv a
dalších látek do organismu
• transport přes BBB (blood-brain barrier) / tight junctions
Yang H:
Nanoparticle-Mediated Brain-Specific
Drug Delivery, Imaging, and
Diagnosis.
Pharmaceutical Research, 2010.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
31Yang H: Nanoparticle-Mediated Brain-Specific Drug Delivery, Imaging,
and Diagnosis. Pharmaceutical Research, 2010.
 liposomy
 micely
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
32
Možnosti zacílení liposomů do nádorové tkáně
(maligní melanom)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
33
Target-specific multimodal liposome
(for combined angiogenesis imaging and therapy)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
34
FÚZE MEMBRÁN
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
35
50 nm
Přirozená fúze:
• fertilizace
• vznik syncitia
Indukovaná fúze:
• fúzogeny:
elektrické pole
chemikálie
(polyethylenglykol)
virusy
(Sendai virus)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
36
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
37
Princip mezidruhové fúze
Heterokaryon = hybridní buňka se 2 jádry
Synkaryon = hybridní buňka se zfúzovaným jádrem
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
38
Frye a Eddidin, 1970
Využití fúze buněk k průkazu fluidity membrán:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
39
Využití fúze buněk k průkazu fluidity membrán:
t = 0 min
myší antigeny
lidské antigeny
t = 40 min
lidské antigeny
t = 40 min
myší antigeny
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
40
Hybridomová technologie
= využití indukované buněčné fúze pro výrobu
monoklonálních protilátek
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
41
Přirozená role
protilátek v obraně
proti infekcím
nebo toxinům
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
42
Struktura a specifita protilátek
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
43
Polyklonální protilátky:
• produkovány velkým počtem klonů plazmocytů
(aktivovaných B-lymfocytů)
• směs stovek až tisíců odlišných molekul
imunoglobulinů
• vazba na různé epitopy téhož antigenu
Monoklonální protilátky:
• produkovány jedním klonem plazmocytů
(aktivovaných B-lymfocytů)
• jediný typ imunoglobulinu
• vazba na jediný epitop příslušného antigenu
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
44
Příprava polyklonálních protilátek
• imunizace pokusného
zvířete
• izolace směsi protilátek z
krve imunizovaného
zvířete
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
45
Princip hybridomové technologie
(příprava monoklonálních protilátek)
myelomová
buňka
aktivovaný
B-lymfocyt
HYBRIDOM
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
46
Výsledek hybridomové
technologie:
monoklonální protilátky
jsou produkovány buňkami
téhož buněčného klonu,
vážou se na stejnou
antigenní determinantu a
mají identické složení
molekuly
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
47
Využití monoklonálních protilátek v
buněčné biologii a v medicíně
• morfologické a funkční studie v základním výzkumu
(exprese proteinu, lokalizace, transport...)
• imunofenotypizace buněk a tkání (CD antigeny,
intracelulární markery...) - patologie, hematologie,
onkologie
• nová léčiva (biologická léčba)
Metodické přístupy:
• imunodetekce pro mikroskopii (imunocytochemie,
imunofluorescence, imunogold-labelling)
• Western-blotting a následná imunodetekce
• imunoafinitní sloupcová chromatografie
• imunoprecipitace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
48
Avastin (bevacizumab)
• MoAb proti VEGF (vascular endothelial growth factor)
• protinádorová léčba: inhibice angiogeneze
• kolorektální karcinom, karcinom plic, karcinom
ledviny, glioblastom
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
49
Herceptin (trastuzumab)
• MoAb proti HER2 (= receptor pro EGF)
• protinádorová léčba: zablokování signální dráhy EGF
• HER2+ karcinom prsu, HER2+ metastatický karcinom
žaludku
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
50
TRANSPORT LÁTEK
PŘES MEMBRÁNY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
51
Mechanismy membránového přenosu
• difúze
• osmóza
• iontové kanály
• přenašečový transport
• transportní váčky,
resp. endocytóza / exocytóza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
52
OSMOTICKÉ JEVY
Difúze
• permeabilní membrána
(prochází rozpuštěná látka i rozpouštědlo)
Osmóza
• semipermeabilní membrána
(prochází pouze rozpouštědlo)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
53
Hypotonické prostředí
• prostředí s nižším osmotickým tlakem
• voda proniká do buněk
• plazmoptýza (erytrocyty: hemolýza)
Hypertonické prostředí
• prostředí s vyšším osmotickým tlakem
• voda uniká z buněk do prostředí
• plazmolýza (rostlinné buňky)
• plazmorýza (živočišné buňky)
Izotonické prostředí
• prostředí o stejném osmotickém tlaku
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
54
Porovnání osmotických jevů
u živočišné a rostlinné buňky:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
55
Reakce živočišné buňky na změny
osmotického tlaku:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
56
PRAKTICKÉ APLIKACE:
DIALÝZA U PACIENTŮ
S NEFUNKČNÍMI LEDVINAMI
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
57
Dialýza = parciální difúze
(přes membránu prochází voda a nízkomolekulární látky)
hemodialýza
(umělá ledvina)
peritoneální
dialýza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
58
Princip hemodialýzy
Dialyzační roztok:
voda, NaCl, KCl, CaCl2,
MgCl2, acetát sodný
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
59
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
60
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
61
Peritoneální dialýza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
62
Princip peritoneální dialýzy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
63
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 23.2.2015
64