Adultní a nádorové
kmenové buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie – 20.4.2015
prof. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc.
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta MU
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
2
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
3
• Adultní kmenové buňky (ASCs)
biologické vlastnosti a diferenciační potenciál
transdiferenciace, EMT
mikroprostředí (niche) ASCs
využití ASCs pro buněčné terapie  27.4.2015
• Nádorové kmenové buňky (CSCs)
biologické vlastnosti a hypotézy vzniku CSCs
markery CSCs
možnosti cílené protinádorové terapie
Program přednášky:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
4
ADULTNÍ KMENOVÉ BUŇKY
(ADULT STEM CELLS, ASCs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
5
Typy ASCs:
• mozek
• krev
• rohovka
• sítnice
• srdce
• tuková tkáň
• kůže
• dřeň zubu
• kostní dřeň
• cévy
• kosterní svalstvo
• střeva
• pupečníková krev
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
6
Lidské SCs kostní dřeně
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
7
Diferenciační potenciál
hematopoetických a stromálních SCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
8
Plasticita hematopoetických SCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
9
Izolace
hematopoetických
SCs pomocí FACS
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
10
Transdiferenciace
= schopnost buněk diferencovat do fenotypu
charakteristického pro jiný typ tkáně nebo
orgánu, než byla tkáň původní
• hematopoetické SCs → kardiomyocyty,
hepatocyty
Ratajczak et al. 2006
• populace velmi malých buněk v kostní dřeni,
které se podobají ESCs, mají morfologii a
markery shodné s nediferencovanými SCs
• in vitro diferenciace do fenotypu kardiomyocytů,
neurálních a pankreatických buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
11
Příklad transdiferenciace neurálních SCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
12
Epiteliálně mezenchymální tranzice (EMT)
= biologický proces, při němž polarizovaná epiteliální
buňka, která svým bazálním povrchem interaguje s
bazální laminou (ECM), prochází řadou
biochemických změn, díky nimž získá
mezenchymální fenotyp (zesílená schopnost
migrace, invazivita, vyšší rezistence k apoptóze a
zvýšená produkce komponent ECM)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
13
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
14
"Niche" (hnízdo) SCs
• mikroprostředí (microenvironment):
podpůrné buňky, extracelulární matrix, adhezní
molekuly a signální molekuly
• ASCs - po celou dobu života organismu
buňky tvořící niche
SCs (mitóza)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
15
NÁDOROVÉ KMENOVÉ BUŇKY
(CANCER STEM CELLS, CSCs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
16
Nádorové kmenové buňky:
cancer stem cells, CSCs / tumor-initiating cells, TICs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
17
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
18
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
19
Zásadní změna pohledu na biologii nádorů:
A. stochastický/klonálně evoluční model
B. CSCs model
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
20
Heterogenní prostředí
solidního nádoru
TICs = tumor initiating cells (= CSCs)
TACs = transiently amplifying cells
TD = terminally differentiated cells
C = kapilára
N = nekróza
TAM
= tumor-associated
marcophages
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
21
Přehled biologických vlastností CSCs:
• specifické mikroprostředí (niche)
• schopnost sebeobnovy (self-renewal)
• proliferační potenciál / schopnost asymetrického
dělení
• diferenciační potenciál
• vysoká telomerázová aktivita
• specifické markery, resp. jejich kombinace
• specifické signální dráhy (Wnt, Notch, SHH)
• rezistence vůči apoptóze
• metastatický potenciál / schopnost EMT, resp. MET
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
22
Mikroprostředí (niche) CSCs v solidních nádorech:
hypoxie, ECM, mezibuněčné interakce, extracelulární
(secernované) faktory a signály = "tissue makeup"
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
23
Diferenciace CSCs
z nádoru mozku v
podmínkách in vitro:
neurony
astrocyty
nediferencované CSCs
Diferenciační potenciál CSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
24
Metastatický potenciál CSCs
• změny interakcí s ECM
• vytváření invadopodií (participace CD133?)
• u CSCs karcinomů schopnost EMT/MET
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
25
Hypotézy vzniku CSCs
• nádorová transformace embryonálních SCs
(aberantní depozity embryonálních SCs v
organismu)
• nádorová transformace adultních SCs, resp.
progenitorových buněk v příslušné tkáni
• nádorová transformace diferencovaných buněk
ve tkáni (mutace podmiňující dediferenciaci na
fenotyp CSCs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
26
Hypotézy vzniku CSCs:
hCSCs
hESCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
27
SCs normální tkáně:
• hematopoetické SCs
• neurální SCs
• neuroektodermální SCs
• epiteliální SCs prsní žlázy
• epiteliální SCs renálních
tubulů
• SCs jaterní tkáně
• ovariální epiteliální SCs
• cervikální epiteliální SCs
• epiteliální SCs sítnice
Odpovídající typ nádoru:
• leukemie
• nádory mozku
• neuroblastom
• nádor prsu
• Wilmsův tumor
.
• hepatoblastom
• karcinom vaječníků
• karcinom děložního krčku
• retinoblastom
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
28
Vznik nádoru
v důsledku
transformace ASCs
nebo progenitorů:
karcinom prsu
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
29
Kategorie markerů CSCs u různých typů malignit:
• membránové / povrchové proteiny:
CD15, CD24, CD44, CD133, CXCR4, NCAM,
ABC transportéry
• cytoplazmatické proteiny:
nestin, Musashi-1, ALDH
• jaderné proteiny (transkripční faktory):
Sox2 , Oct3/4, Nanog
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
30
Markery CSCs u nádorů dětského věku:
Friedman and Gillespie, Cancers 2011
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
31
Metodické možnosti detekce markerů CSCs:
• transkript:
RT-PCR / Real-time PCR
• protein:
imunodetekční metody
(imunohistochemie, imunocytochemie,
imunofluorescence, imunoznačení pro ELM,
imunoblotting, flow cytometrie / FACS)
detekce "side population" (SD)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
32
Detekce "side population" (= SP):
• barvivo Hoechst 33342
• hodnocení při dvou emisních délkách:
450 nm (Hoechst blue) a 670 nm (Hoechst red)
• aktivita transmembránových ABC-transportérů
v CSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
33
Markery CSCs u neurogenních nádorů
Multiformní glioblastom
• nejčastější zhoubný nádor mozku u dospělých
(30-40 případy na 1 milion obyvatel ročně)
• CD133, CD15 (SSEA1), Sox-2, Musashi-1, nestin
Meduloblastom
• nejčastější zhoubný nádor CNS u dětí
(2-6 případů na 1 milion dětí do 15 let ročně)
• CD133, CD15 (SSEA1), nestin
Neuroblastom
• nejčastější extrakraniální solidní nádor u dětí
(6-8 případů na 1 milion dětí do 15 let ročně)
• CD133, nestin
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
34
CD133 (Prominin-1)
• membránový glykoprotein (5-TM family)
865 AA, 97 kDa
• apikální strana epitelií, membránové vezikly
• SCs i CSCs: organizace membránových protruzí
• účast v regulační dráze potlačující diferenciaci (?)
30 AA 30 AA
85 AA
50 AA
290 AA
255 AA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
35
CD133 (Prominin-1)
• AC133 – glykosylovaná forma
• epitop AC133: specifický pro CSCs
přístupný v závislosti na glykosylaci
CD133 / DNA AC133 / DNA
Osteosarkomová buněčná linie OSA-02
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
36
Nestin
= Neuronal Stem Cell Protein
• třída VI intermediárních filament (1621 AA, 177 kDa)
• proliferující neuroepitelium během vývoje
• v dospělosti exprese za patologických podmínek
nestin / DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
37
Markery CSCs u sarkomů
Osteosarkom
• zhoubný nádor skeletu
(4-5 případů na 1 milion obyvatel ročně)
• CD133, nestin, Oct3/4, Nanog, ALDH, ABCG2,
CXCR4(?)
Rhabdomyosarkom
• zhoubný nádor svalové tkáně, nejčastější u dětí
(5-8 případů na 1 milion dětí do 15 let ročně)
• CD133, nestin, ALDH, ABCG2, CXCR4(?)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
38
CD133Osteosarkom (tkáň)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
39
M/15
Nestin
Osteosarkom (tkáň)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
40
F/14
Nestin
Osteosarkom (tkáň)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
41
Buněčná linie Saos-2 (ATCC) – osteosarkom
CD133 / DAPI Nestin / DAPI
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
42
Identifikace markerů CSCs
v sarkomových buněčných liniích
OsteosarkomRhabdomyosarkom
CD133
Nestin
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
43
CXCR4 (CD184, fusin)
• chemokinový receptor pro ligand SDF-1 (CXCL 12)
352 AA, 40 kDa
• exprese za fyziologického stavu i v důsledku
působení stresových faktorů
• embryonální i adultní SCs, CSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
44
CXCR4 / DNA
Rhabdomyosarkomová buněčná linie NSTS-11
Identifikace CXCR4/SDF-1 v sarkomech
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
45
Markery CSCs u karcinomu pankreatu
• 110-150 případů na 1 milion obyvatel ročně
• CD24, CD44, ESA, Ep-CAM
ALDH1, CXCR4, CD133, nestin
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
46
Detekce markerů CSCs u adenokarcinomu pankreatu
CD24 / DNA ESA / DNA CD133 / DNA
Pankreatická buněčná linie P06
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
47
Funkční testy fenotypu CSCs
• tvorba agregátů (aggregation assay)
• tvorba kolonií (colony forming assay)
• tvorba sfér (sphere formation assay)
• testy klonogenity (clonogenicity assay)
• testy tumorigenicity (tumorigenicity assay)
CSC
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
48
Tvorba agregátů (aggregation assay)
• kultivace buněčných suspenzí v nádobkách s
neupraveným povrchem nebo metoda visících
kapek (hanging drops)
Linie OSA-02
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
49
Tvorba kolonií (colony-forming assay)
• vysetí naředěné buněčné suspenze na kultivační
misky  vytváření kolonií
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
50
Tvorba sfér (sphere-formation assay)
• vysetí naředěné buněčné
suspenze do měkkého agaru
 vytváření kolonií
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
51
Testy klonogenity (clonogenicity assay)
• inokulace izolovaných buněk do 96-jamkových
destiček, proliferace a tvorba kolonií (>50 buněk)
• holoklony, meroklony, paraklony
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
52
Testy tumorigenicity (tumorigenicity assay)
• subkutánní injekce buněčné suspenze myším
• monitorování růstu nádorů, histologická analýza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
53Rhabdomyosarkomová linie NSTS-11:
test tumorigenicity v NOD/SCID myších
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
54
CD133
nestin
M3A138 M3B138 M3C138
Rhabdomyosarkomová linie NSTS-11:
IHC analýza xenograftů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
55
M3A138
Rhabdomyosarkomová linie NSTS-11:
IHC analýza xenograftů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
56
Příklad komplexní
analýzy CSCs
in vitro
(osteosarkom)
(Tirino et al.,
FASEB J, 2011)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
57
Příklad komplexní analýzy CSCs in vitro (osteosarkom)
(Tirino et al., FASEB J, 2011)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
58
Důsledky "paradigmatu CSCs" pro léčbu nádorů:
• selhání konvenční protinádorové léčby
(chemorezistence a radiorezistence CSCs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
59
Konvenční vs. cílená protinádorová léčba:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
60
Mechanismy chemorezistence CSCs:
• účinná schopnost reparace DNA
• variabilní exprese a fosforylace kináz
• nízká proliferační aktivita (Ki67 index)
• aktivní mechanismy "multidrug resistance"
(exprese ABC transportérů)
Mechanismy radiorezistence CSCs:
• účinná schopnost reparace DNA
• nízká proliferační aktivita (Ki67 index)
• overexprese antiapoptotických genů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
61
Možné strategie léčby cílené proti CSCs:
• ovlivnění interakcí mezi CSCs a mikroprostředím
• indukovaná diferenciace
• ovlivnění signálních drah udržujících sebeobnovu
Riziko: poškozeních adultních SCs v nenádorové tkáni
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
62
Příklady konkrétních strategií léčby
cílené proti CSCs:
• onkolytická virová terapie s využitím
modifikovaných adenovirových vektorů proti
CD44+/CD24- buňkám – karcinom prsu
• anti-EpCAM monoklonální protilátka – karcinom
pankreatu
• ATRA-indukovaná diferenciace – neuroblastom
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
63
Mak et al., Cell Rep 2012
Hypotéza: interakce CD133/HDAC6/b-catenin
• využití inhibitorů histonových deacetyláz – degradace
b-cateninu?
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015
64