BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie - 20.4.2015 Adultní a nádorové kmenové buňky prof. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ Tato prezentace je spolufinancována Evropským sociálním fondem a státním rozpočtem České republiky BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 Program přednášky: • Adultní kmenové buňky í ASCs) biologické vlastnosti a diferenciační potenciál transdiferenciace, EMT mikroprostředí (niche) ASCs využití ASCs pro buněčné terapie -> 27.4.2015 • Nádorové kmenové buňky fCSCs) biologické vlastnosti a hypotézy vzniku CSCs markery CSCs možnosti cílené proti nádorové terapie BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 3 ADULTNI KMENOVÉ BUNKY (ADULT STEM CELLS, ASCs) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 Where They've Been Found •Brain •Blood •Cornea • Retina •Heart • Fat • Skin • Dental Pulp • Bone Marrow • Blood Vessels • Skeletal Muscles • intestines Umbilical Cord Corel Blood Stem Cell Neural Stem Cell C C C C • C Platelets Red Blood White Blood Mesenchymal Glial Cells Neurons Ceils Ceils Cells Typy ASCs: mozek krev rohovka sítnice srdce tuková tkáň kůže dřeň zubu kostní dřeň cévy kosterní svalstvo střeva pupečníková krev BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 5 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 6 Diferenciační potenciál hematopoetických a stromálních SCs BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 7 8 Plasticita hematopoetických SCs BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 8 Izolace hematopoetických SCs pomocí FACS BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 9 10 Transdiferenciace = schopnost buněk diferencovat do fenotypu charakteristického pro jiný typ tkáně nebo orgánu, než byla tkáň původní • hematopoetické SCs —► kardiomyocyty, hepatocyty Rataiczak et a L 2006 • populace velmi malých buněk v kostní dřeni, . Liilhiii • Monica Vcncrc • M ,i lumli .i S. Kan • Jeremj N. Rich UROLOGIC ONCOLOGY Urologie Oncology: Seminars aid Original Investigations 26 (2008) 581-58° ^^^^^^^^^^^^^= Review article "Cancer stem cells"—Lessons from Hercules to fight the Hydra Felix Roman Moltzalm. M.D.1. Jens-Peter Volkmer. M.D.1 *. Daniel Rottke. M.D.. Rolf Ackermann. M.D.2 BJ8120 Aplikovanä bunecnä biologie / 09 / 20.4.2015 Journal of Pathology JPothol2009:2l7:282-298 Published online 23 September 2008 in Wiley hterScience (www.inierscience.wiley.com) DOI: 10. l002/path,2453 Invited Review Stem cells in liver regeneration, fibrosis and cancer: the good, the bad and the ugly -K1VI1W AKIll n Cytometry Die Hard: Are Cancer Stem Cells the Bruce Willises of Tumor Biology? folia His toche mica Review article etcytobiologica Vol. 4J. No. 4.2005 pp. 175-1S1 Cancer stem cells - normal stem cells " Jedi" that went over to the "dark side" Mnriusz Z. RsUajczak Bi8120 Aplikovana bunecna biologie / 09 / 20.4.2015 19 Zásadní změna pohledu na biologii nádorů: A. stochastický/klonálně evoluční model B. CSCs model B. BT->^ ^^^^k —\--____ o #^ #^ • • O B^1® BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 19 Heteroaenní prostředí solidního nádoru C = kapilára N = nekróza TAM = tumor-associated marcophages 20 VjCAF StAM •Lymphocyte QTICs /%TACs • " ^ TD TICs = tumor initiating cells (= CSCs) TACs = transiently amplifying cells TD = terminally differentiated cells BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 20 Přehled biologických vlastností CSCs: • specifické m i kro prostředí (niche) • schopnost sebeobnovy (self-renewal) • proliferační potenciál / schopnost asymetrického dělení • diferenciační potenciál • vysoká telomerázová aktivita • specifické markery, resp. jejich kombinace • specifické signální dráhy (Wnt, Notch, SHH) • rezistence vůči apoptóze • metastatický potenciál / schopnost EMT, resp. MET BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 21 Mi kro prostředí (niche) CSCs v solidních nádorech: hypoxie, ECM, mezibuněčné interakce, extracelulární (secernované) faktory a signály = "tissue makeup" 22 Blood vessels Secreted factors ■ Stroma CSC Non-CSC tumor cells CSC ^ Self- _^ niche renewal Drug resistance Radiation resistance CSC-specific antigens Differentiation f 'y Stern cell niche Stem cell Daughter cell © oo 0|m Progenitor cells Lineage-committed cells Current Opinion in Biotechnology BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 22 Diferenciační potenciál CSCs 23 Diferenciace CSCs z nádoru mozku v podmínkách in vitro\ neurony astrocyty nediferencované CSCs BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 23 Metastatický potenciál CSCs • změny interakcí s ECM • vytváření invadopodií (participace CD133?) • u CSCs karcinomů schopnost EMT/MET BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 25 Hypotézy vzniku CSCs • nádorová transformace embryonálních SCs (aberantní depozity embryonálních SCs v organismu) • nádorová transformace adultních SCs, resp. progenitorových buněk v příslušné tkáni • nádorová transformace diferencovaných buněk ve tkáni (mutace podmiňující dediferenciaci na fenotyp CSCs) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 SCs normální tkáně: • hematopoetické SCs • neurálníSCs • neuroektodermální SCs • epiteliální SCs prsní žlázy • epiteliální SCs renálních tubulů • SCs jaterní tkáně • ovariální epiteliální SCs • cervikální epiteliální SCs • epiteliální SCs sítnice 27 Odpovídající typ nádoru: • leukémie • nádory mozku • neuroblastom • nádor prsu • Wilmsův tumor ■ • hepatoblastom • karcinom vaječníku • karcinom děložního krčku • retinoblastom BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 27 Bipotential breast epithelial stem cell Basal-like breast cancer stem cell ? y i Luminal breast cancer stem cell Bipotential progenitor Basal-like breast cancer & Q Myoepithelia! Lumjna| progenitors progenitors Luminal breast cancer_ Differentiated myoepithelial cells CDIO-.SMA-.CKM1 Differentiated luminal epithelial cells Muc1',CD24', CK18* Vznik nádoru v důsledku transformace ASCs nebo progenitorů: karcinom prsu 28 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 28 29 Kategorie markerů CSCs u různých typů malignit: • membránové / povrchové proteiny: CD15, CD24, CD44, CD133, CXCR4, N CAM, ABC transportéry • cytoplazmatické proteiny: nestiň, Musashi-1, ALDH • jaderné proteiny (transkripční faktory): Sox2 , Oct3/4, Nanog BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 29 Markery CSCs u nádorů dětského věku: 30 Malignancy Cell Surface Proteins Nuclear Cytoplasmic Transcription Proteins Factors Functional/ Enzymes AT/RT CD133 Ependymoma CD133 CD15 Nestin|BLBP, RC2 Ewing's Sarcoma/PNET CD133 SP Glioma CD133 CD15 Musashi-1, bnii-1 Sox-2 Hepatoblastoma SP Malignant rhabdoid CD133 tumor of the kidney Medulloblastoma CD133 CD15 Nestin SP Melanoma, childhood CD133 Neuroblastoma CD133 Nestin SP Osteosarcoma CD133 Nestin Oct3/4, Nanog SP Retinoblastoma CD133 CD44 Nestin musashi-1, Oct3/4, Nanog, ALDH1, SP bmi-1 p ax-6. clixlO Rhabdomyosarcoma CD133 SP Wilms Tumor CD133 NCAM Friedman and Gillespie, Cancers 2011 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 31 Metodické možnosti detekce markerů CSCs: • transkript: RT-PCR / Real-time PCR • protein: imunodetekční metody (imunohistochemie, imunocytochemie, imunofluorescence, imunoznačení pro ELM, imunoblotting, flow cytometrie / FACS) Lh> detekce "side population" (SD) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 31 32 Detekce "side population" (= SPY • barvivo Hoechst 33342 • hodnocení při dvou emisních délkách: 450 nm (Hoechst blue) a 670 nm (Hoechst red) • aktivita transmembránových ABC-transportérů v CSCs Hoechst Red -► BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 _33 Marken/ CSCs u neuroqenních nádorů Multiforme glioblastom • nejčastější zhoubný nádor mozku u dospělých (30-40 případy na 1 milion obyvatel ročně) • CD133, CD15 (SSEAn, Sox-2, Musashi-1, nestiň Meduloblastom • nejčastější zhoubný nádor CNS u dětí (2-6 případů na 1 milion dětí do 15 let ročně) • CD133. CD15 fSSEAlV nestiň Neuroblastom • nejčastější extrakranial ní solidní nádor u dětí (6-8 případů na 1 milion dětí do 15 let ročně) • CD133, nestiň BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 33 34 CD133 ŕProminin-n • membránový glykoprotein (5-TM family) 865 AA, 97 kDa • apikální strana epitelií, membránové vezikly • SCs i CSCs: organizace membránových protruzí • účast v regulační dráze potlačující diferenciaci (?) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 34 35 CD133 fProminin-n • AC133 - glykosylovaná forma • epitop AC133: specifický pro CSCs přístupný v závislosti na glykosylaci Osteosarkomová buněčná linie OSA-02 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 35 Nestiň = Neuronal Stem Cell Protein • třída VI intermediárních filament (1621 aa, 177 kDa) • proliferující neuroepitelium během vývoje • v dospělosti exprese za patologických podmínek BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 36 Marken/ CSCs u sarkomů Osteosarkom • zhoubný nádor skeletu (4-5 případů na 1 milion obyvatel ročně) • CD133, nestin, Oct3/4, Nanoq, ALDH, ABCG2, CXCR4Í?) Rhabdomyosarkom • zhoubný nádor svalové tkáně, nejčastější u dětí (5-8 případů na 1 milion dětí do 15 let ročně) • CD133. nestin. ALDH. ABCG2, CXCPA(?) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 37 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 41 Buněčná linie Saos-2 (ATCC) - Osteosarkom f 4J CD 133 / DAPI Nestiň / DAPI BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 41 42 Identifikace markerů CSCs v sarkomových buněčných liniích CD133 Nestiň Rha bdomyosa rkom Osteosa rkom BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 42 CXCR4 (CD184. fusing • chemokinový receptor pro ligand SDF-1 (CXCL 12) 352 AA, 40 kDa • exprese za fyziologického stavu i v důsledku působení stresových faktorů • embryonální i adultní SCs, CSCs 43 2 CTCE-0214 CTCE-9908 .AMDJ100 J, Proliferation Adhesion • 23802 • 23804 I2G5 • CXCL 12 OAMD3100 Ohiv-1 -t; BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 43 44 Identifikace CXCR4/SDF-1 v sarkomech Rhabdomyosarkomová buněčná linie NSTS-11 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 44 Markery CSCs u karcinomu pankreatu 45 ■ • 110-150 případů na 1 milion obyvatel ročně • CD24, CD44, ESA, Ed-CAM ALDH1, CXCR4, CD133, nestiň BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 46 Detekce m a r ke r ů CSCs u adenokarci nomu pankreatu I I i Klik —5J i i i i i i Pankreatická buněčná linie P06 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie 7 09/20.4.2015 46 47 Funkční testy fenotypu CSCs • tvorba agregátů (aggregation assay) • tvorba kolonií (colony forming assay) • tvorba sfér (sphere formation assay) • testy klonogenity (clonogenicity assay) • testy tumorigenicity (tumorigenicity assay) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 47 Tvorba agregátů (aggregation assay) • kultivace buněčných suspenzí v nádobkách s neupraveným povrchem nebo metoda visících kapek (hanging drops) Linie OSA-02 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 48 Tvorba kolonií (colony-forming assay) • vysetí naředěné buněčné suspenze na kultivační misky -> vytváření kolonií 49 Collagen Solution Serum-free MegaCult*-C medium containing growth factors Mouse CFU-Mk Double chamber culture slide incubate 6 to 8 days Remove chamber Dehydrate, fix and stain megakaryocytes for acetylcholinesterase activity BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 Tvorba sfér (sphere-formation assay) • vysetí naředěné buněčné suspenze do měkkého agaru -> vytváření kolonií PDGFor KRAS-driven glioma in.....»1» «. « di,i Addition Of IIMII li Added C*n SutpvntKxv Agar fcUtn. r» Adc*d Formation of C»ll Cotoni** Racewry ef Trjn*fofm*d C#H» I> li.tli- rfi-Hl .1 *li.| Coforlrnítrlc . D*l«ctlon R» pl*t* IWWfd. IrjnifnnntdcHh 50 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 51 Testy klonogenity (clonogenicity assay) • inokulace izolovaných buněk do 96-jamkových destiček, proliferace a tvorba kolonií (>50 buněk) • holoklony, meroklony, paraklony BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 51 Testy tumorigenicity (tumorigenicity assay) • subkutánní injekce buněčné suspenze myším • monitorování růstu nádorů, histologická analýza BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 52 Rhabdomyosarkomová linie NSTS-11: test tumorigenicity v NOD/SCID myších BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 53 Rhabdomyosarkomová linie NSTS-11: IHC analýza xenograftů 54 M3A138 M3B138 M3C138 nestiň CD133 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 Rhabdomyosarkomen linie NSTS-11: IHC analýza xenograftů 55 "X S. ■ V' 15?» ■ x A 4; í ^4;?%^^ M3A138 t t x; v * V o2> o?> oSs 4> # # # Oct3/4 GNL3 CD133 IGAPDH BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 CD133- D 56 Příklad komplexní analýzy CSCs in vitro (Osteosarkom) (Tirino et a L, FASEB J, 2011) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 56 57 Příklad komplexní analýzy CSCs in vitro (Osteosarkom) I I I « • • I I 1 I < I I T 12)4117 Tlma (v*Mk) Tim« («mk) Time (wNk) (Tirino et alv FASEB J, 2011) BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 57 Důsledky "paradigmatu CSCs" pro léčbu nádorů: • selhání konvenční protinádorové léčby (chemorezistence a radiorezistence CSCs) 58 CSC-Targeted Cancer Therapy Drugs that kill tumor stem cells Tumor loses ability to ...and tumor generate new cells... degenerates Traditional Cancer Therapy Drugs that kill tumor cells... .but not cancer stem cells Tumor shrinks, but grows back BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 58 59 Konvenční vs. cílená protinádorová léčba: Initially no clinical Eventually cancer response is detected stops producing by traditional criteria new cells BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 60 Mechanismy chemorezistence CSCs: • účinná schopnost reparace DNA • variabilní exprese a fosforylace kináz • nízká proliferační aktivita (Ki67 index) • aktivní mechanismy "multidrug resistance" (exprese ABC transportérů) Mechanismy radiorezistence CSCs: • účinná schopnost reparace DNA • nízká proliferační aktivita (Ki67 index) • overexprese antiapoptotických genů BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 60 Možné strategie léčby cílené proti CSCs: • ovlivnění interakcí mezi CSCs a mikroprostředím • indukovaná diferenciace • ovlivnění signálních drah udržujících sebeobnovu Riziko: poškozeních adultních SCs v nenádorové tkáni 61 ^^^^rna^ce^^^^^^o^ge^^ce^ 9# normal cell tumorigenic cell self-renewal renewal of malignant potential self-renewal renewal of ion-selective m3f malignant 4 \>fi selective targeting shared renewal mechanisms different renewal mechanisms BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 61 62 Příklady konkrétních strategií léčby cílené proti CSCs: • onkolytická virová terapie s využitím modifikovaných adenovirových vektorů proti CD44+/CD24" buňkám - karcinom prsu • anti-EpCAM monoklonální protilátka - karcinom pankreatu • ATRA-indukovaná diferenciace - neuroblastom BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 62 Hypotéza: interakce CD133/HDAC6/ß-catenin • využití inhibitorů histonových deacetyláz - degradace ß-cateninu? A B Mak etaL, Cell Rep 2012 BÍ8120 Aplikovaná buněčná biologie / 09 / 20.4.2015 63 64 ? Gel Pharmacogenomics and cancer stem cells: a changing landscape? Francesco Crea1, Maria Ana Duhagon2, William L. Farrar3 and Romano Danesi1 Stem Cells* _ TrA,\-LAI lONAl AND CLINICAL RESEARCH Concise Review: Stem Cells As an Emerging Platform for Antibody Therapy of Cancer Richard T. Krank,"'1' Joskph Najbaiek," Kaken S. Amkidy** Nanomedicme April 2012, Vol. 7, No. 4, Pages 597-615 , DOI 10.2217/nnm.l2.22 (doi:10.2217/nnm.l2.22) Review Cancer stem cells and drug resistance: the potential of nanomedicine Serguei Vinogradov" & Xin Wei Bi8120 Aplikovanä bunecnä biologie / 09 / 20.4.2015