ÚVOD DO KVANTITATIVNÍ
REAL-TIME PCR
III. Instrumentace
Instrumentace
PCR – termocykler
qRT-PCR – termocykler kombinovaný s fluorimetrem
Excitačnífiltr
Emisní filtr
Detektor
Halogenová lampa
- Všechny vlnové délky viditelného světla (320nm – 2600nm)
- Uniformní excitace
- př. ABI 7300, 7500, Stratagene Mx4000/Mx3000p, BioRad iCycler
- Normalizace fluorescence (Rox)
Laser
- Specifická vlnová délka
- Není nutný excitační filtr
- Omezený výběr fluoroforů
- př. ABI PRISM 7700/7900
LED
- Úzké pásmo vlnové délky (30-40nm)
- Běžné LED emitují na 430, 450, 505, 592, 612 a 637 nm
- nově i modrá a UV část spektra
- př. Corbett Rotor-Gene, Roche Light Cycler
Instrumentace
Zdroje excitačního záření
Filtry
Instrumentace
Excitační/emisní – selekce excitační/emisní vlnové délky
Optická kvalita filtru často určuje výkonnost přístroje
Bandpass a Long Pass Filtry
Volba fluoroforu
http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/imagingsystems.
Monochromátor
Volba libovolné vlnové délky
Difrakční mřížka
Instrumentace
Fotodetektory
Snímací zařízení (CCD )
Instrumentace
wincobiz.com/qpcr.htm.
Teplotní uniformita
Instrumentace
Parametry RT cykleru
Citlivost – minimální kvantifikovatelné množství templátu – fluorescence, kterou
je přístroj schopný odlišit od úrovně pozadí (šum)
Dynamický rozsah – rozsah koncentrací – rozsah intenzity fluorescence
Linearita – intenzita fluorescence je ideálně lineární
ale:
- koncentrace:
- vysoká koncentrace vzorku – nemusí dojít k excitaci
- i u „normálních“ koncentrací, může dojít k preferenčnímu absorbování
světla povrchovými vrstvami vzorku, vzdálenější část vzorku už není
excitována světlem o stejné intenzitě
- optická dráha
- laboratorní plastik
- homogenita vzorku
Fluorescenční standardy – kalibrace přístroje
Instrumentace
Kalibrace
Instrumentace
Tvorba „droplets“
1 droplet = 1 PCR
Fluorescenční analýza
Andrew deMello
http://www3.imperial.ac.uk/people/a.demello/research
High-throughput droplet PCR