KURZ ZÁKLADŮ PROTEOMIKY
ČASOVÝ ROZVRH:
PONDĚLÍ 7:50- 7:55 Zahájení praktika (UKB, A2, 1.NP, místnost č. 1.21, Dr. Hejátko)
8:00 – 9:00 2-D elektroforéza – rehydratace proužků
9:00 – 9:30 Exprese rekombinantních proteinů – zaočkování expresní kultury
9:30 – 10:00 Úvod do experimentální části (přednáška)
9:30-9:40 2D elektroforéza (Dr. Konečná)
9:40-9:50 MS analýza (Dr. Zdráhal)
9:50-10:00 Rekombinantní proteiny (Dr. Pekárová, MSc. Szmitkowska)
10:00 – 13:00 Struktura proteinů, proteomické databáze (Dr. Klumpler, Dr.
Jackson)
13:00 – 13:45 OBĚD
Budova A2
13:45 – 14:30 Exprese rekombinantních proteinů – indukce
Příprava 1-DE gelů (pro SDS-PAGE a nativní PAGE)
14:30 – 15:00 In-solution proteolytické štěpení směsi proteinů pro LC-MSMS
analýzu
15:00 – 15.30 Příprava 1-DE gelů (pro SDS-PAGE a nativní PAGE)
15:30 – 16:00 Exprese rekombinantních proteinů – sklizeň kultury
Příprava noční kultury pro izolaci plazmidové DNA
Přesun do budovy A26
16.05 - 16.30 Příprava gelů pro 2-DE
16.30 – 17:00 1. rozměr 2-D elektroforézy: izoelektrická fokusace (IEF)
ÚTERÝ Budova A2
7:45 – 9:15 Izolace plazmidové DNA
9:15– 10:00 Sekvenování – PCR
Přesun do budovy A26
10:00 – 11.00 2. rozměr 2-D elektroforézy: SDS-PAGE
11,00 – 12.00 OBĚD
Budova A26
12.00 – 14.00 Barvení 2-DE gelů, densitometrie
14.00 – 14.30 Ukončení in-solution proteolytického štěpení proteinů pro LC-MS/MS
analýzu
Nasazení vzorků do autosampleru a začátek LC-MS/MS analýzy
Přesun do budovy A2
14.35 – 17.35 Software pro vyhodnocování 2-D gelů, databáze 2-D gelů
Sekvenace DNA –čištění vzorku (prostřídání skupin), nasazení vzorku
STŘEDA Budova A26
7:30 – 8:30 In-gel proteolytické štěpení proteinů separovaných 2-D
Elektroforézou
Přesun do budovy A2
8:30-13:00 Purifikace rekombinantních proteinů pomocí metalochelatační
afinitní chromatografie
Demonstrační chromatografie – FPLC
PAGE analýza rekombinantních proteinů – příprava vzorků
- SDS-PAGE analýza
Stanovení koncentrace proteinů metodou dle Bradfordové
ČTVRTEK Budova A2
8:30 – 9:00 Nativní PAGE analýza – nanesení vzorků na gel
Přesun do budovy A26
9:00 – 11:00 Analýza proteomu – identifikace proteinů metodou MALDI-TOF
MS (ukončení in-gel proteolytického štěpení proteinů separovaných
2-D elektroforézou a analýza vzorků MALDI-TOF hmotnostní
spektrometrií)
Přesun do budovy A2
11:00 – 12:30 Ukončení nativní PAGE – aktivitní barvení (MUG)
- Western blotting
12:30 – 13:30 OBĚD
Budova A2
13:30 – 16:30 Western blotting
Analýza obrazu – densitometrie. software pro vyhodnocování 1D gelů
Dle dohody (vyhodnocení čistoty purifikovaných proteinů)
Vyhodnocení sekvencování DNA, čtecí rámec (Work Bench)
PÁTEK Budova A2
8:00 – 10:00 Vyhodnocení výsledků LC-MSMS a MALDI-TOF MS analýz
10:00 – 11:00 “dodělávky“, konzultace, vypracování a odevzdání protokolů
11:00 Kolokvium
Cvičící (legenda):
2-DE a příprava pro MS RNDr. Hana Konečná, Danuše Fridrichová
Analýza obrazu Mgr. Gábina Lochmanová, Ph.D.
MS analýza doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.
Struktura proteinů Mgr. Tomáš Klumpler, Ph.D., Phil Jackson, Ph.D.
Exprese a purifikace rekombinantních proteinů Ing. Blanka Pekárová, Ph.D., MSc. Agnieszka
Szmitkowska
Izolace a purifikace DNA, práce s WorkBench Bc. Martina Válková,
Sekvencování DNA Bc. Martina Válková
Dohled nad laboratoří a přípravou materiálu ing. Šárka Skoupá