CG030 – Struktura (architektura) a
funkce proteinových komplexů
doc. Jan Paleček
jpalecek@sci.muni.cz
(garant)
Osnova kurzu
• úvod – metody analýzy proteinových
komplexů
• Struktura a funkce proteinů (chaperony,
PTM, PPI, signální dráhy …) a komplexů
(proteasom, GPCR …)
největší proteinový komplex = chromosom
• DNA-vazebné komplexy
• Komplexy iniciace transkripce
• Komplexy chromatinu
• Evoluce proteinů a komplexů
obecnéchromatin
Program přednášek 2015
19.2.2014 10-11.50hod A2-2.11 doc. Paleček Uvod, analyza komplexů o
26.2.2014 10-11.50hod A2-2.11 Dr. Kolesár ubiquitinace, ligasy (cullin, APC), proteasom b
5.3.2014 10-11.50hod A2-2.11 doc. Marek úvod do strukturní biologie e
12.3.2015 10-11.50hod A2-2.11 Dr. Muller Chaperony c
19.3.2014 10-11.50hod A2-2.11 doc. Marek signální dráhy, GPCR n
26.3.2014 10-11.50hod A2-2.11 doc. Paleček protein-proteinové interakce, komplexy e
2.4.2014 10-11.50hod A2-2.11 doc. Paleček DNA-proteinové interakce, vazebné motivy ch
9.4.2014 10-11.50hod A2-2.11 doc. Paleček DNA-proteinové interakce, transkripční komplexy r
16.4.2014 10-11.50hod A2-2.11 Dr. Blažek cyclin/CDK komplexy v buněčném cyklu a transkripci o
23.4.2014 11-12.50hod A2-2.11 Dr. Kolesar Oprava DNA, homologní rekombinace m
30.4.2014 10-11.50hod A2-2.11 prof. Lehmann a
7.5.2014 SMC konference???? t
14.5.2013 10-11.50hod A2-2.11 doc. Paleček chromatinové komplexy i
21.5.2013 10-11.50hod A2-2.11 doc. Paleček Evoluce komplexů n
28.5.2013 10-11.50hod A2-2.11 doc. Paleček Zkouška - test
- Pohled na vybrané procesy probírané v biochemii a molekulární biologii z
hlediska proteomiky a především z hlediska proteinových komplexů
- výběr komplexů majících vztah k tématům studovaným v laboratořích
„chromatinových molekulárních komplexů“, NCBR a dalších skupin z MU
- kdo na čem pracuje (zapsat) – přednášky o komplexech, na kterých
pracují studenti – prohloubení znalostí s novým úhlem pohledu
Zkouška: - test + přednáška
• Úvod - Analýza proteinu
– Domény
• fold-struktura (ss, PDB)
• v PyMolu připravit 3D strukturu
• Interakce (IntAct)
– Komplexy
• Funkce
• Lokalizace
– evoluce
• Konkrétní nová data – článek (< 5 let)
Ujasnit si souvislosti, rozšířit si znalosti, aplikovat
poznatky z přednášek …
- doporučení přednášek: Struktura a funkce eukaryotických
chromozomů (C9041), Proteomické metody (CG080)
Informační zdroje
Alberts a spol: Molecular biology of the Cell (2008)
Liljas a spol: Structural biology (2009) …
… nejnovější články z časopisů Cell, Nature, Science, PLoS …
Databáze proteinových struktur: http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do,
http://www.ebi.ac.uk/pdbsum/
Database protein-proteinových interakcí: http://string-db.org/newstring_cgi ...
http://www.ebi.ac.uk/intact/?conversationContext=1
Science or fiction: way to imagine
life processes – komplexy a
„molekulární stroje“
Molecular machinery of life:
http://multimedia.mcb.harvard.edu/
http://www.youtube.com/watch?v=ztXiU3c3poM
https://www.youtube.com/watch?v=rohJjghQCmw
http://multimedia.mcb.harvard.edu/anim_proteinpacking.html
Jak vědci došli k takovýmto představám?
Studiem různých proteinových komplexů – 1. krokem je izolace a
charakterizace takovýchto komplexů
http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=FJ4N0iSeR8U
Metody analýzy proteinových komplexů
- ultracentrifugace, gelová filtrace,
- TAP-tag (a jiné tagy) purifikace a MS analýza
- ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace …
- cross-linking MS, (cryo) elektronová mikroskopie …
Metody analýzy protein-proteinových interakcí
- pull-down (in vitro)
- (kvasinkový) dvou-hybridní systém
- BiFC, FRET, ko-lokalizace, ko-exprese
- Flourescenční anisotropie, SPR, ITC …
- ko-krystalizace
- genetické metody (syntetická letalita, suprese)
- databáze (interactom a komplexy …)
Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005
OdkomplexůkinterakcímAMK
Metody izolace a analýzy PKxů
ultracentrifugace
Cukerný/hustotní gradient
Je třeba přesně vyvážit!
Cukerný/hustotní gradient
A. Hrubší pouze rozdělí na
kompartmenty/organely
B. Jemný - cukerný gradient
Lee et al, Plant Cell Phys, 2004
Metody izolace a analýzy PKxů
ultracentrifugace
T – total
S – soluble
M – membranové
frakce (… jaderná
…)
- Gelová filtrace (size exclusion chromatography)
- Za nativních podmínek (komplexy zůstávají pohromadě)
Lze poznat zda proteiny tvoří oligomery, agregáty
Metody izolace a analýzy PKxů
Tayloretal,MCB,2008
GF frakce lyzátu
lidských buněk –
podjednotky SMC5-6
komplexu identifikovány
pomocí protilátek
Příklad: SMC5/6 komplex
- TAP-tag (tagy a protilátky) purifikace a
MS identifikace
MS analýza SDSPAGE
nebo roztoku
Tandem-affinity purification
(vícestupňové – vyšší čistota)
1. calmodulin-binding
(CBP)
2. TEV-proteasové místo
(tobacco etch virus)
3. Protein A (váže IgG)
Tagy (myc, HaloTag …)
Zaintegrované v genomu
(přirozená hladina proteinu,
přirozený výskyt
partnerů/komplexu …)
Protein CBP A
Puig et al, Methods, 2001
Pozor na kontaminace
(např. chaperony)
SDS-PAGE
protilátky
Sergeantetal,MCB,2005
I jiné kombinace
(HBH – His-biotin-His)
Metody izolace a analýzy PKxů
Tagy (a protilátky):
Myc, FLAG, V5, S-tag, GFP (vazba přes protilátky)
GST, Streptactin (biotin-streptavidin), MBP … (vazba přes ligandy)
Kovalentně vázaný ligand
Ko-purifikace
Silné interakce/komplexy – proteiny lze ko-exprimovat (může
pomoci s jejich rozpustností) a následně ko-purifikovat (více
Dr. R. Dopitová)
Totalextract
FT
Solublefraction
25
35
40
55
70
1.
Input
15
10
25
35
40
55
70
15
10
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.
FT
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.
Elution fractions – 10ml Elution fractions – 1,5ml
Nse3
Nse1
Nse4
1. His-tag purification 2. Strep-tag purification
Strep
Strep
6xHis
Nse4Nse3Nse1
Nse4 protein se samostatně exprimuje málo a je málo rozpustný
Ko-purifikace
Silné interakce/komplexy – proteiny lze ko-exprimovat (může
pomoci s jejich rozpustností) a následně ko-purifikovat
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
AU
0.0
10.0
20.0
30.0
40.0
50.0
60.0
70.0
80.0
90.0
100.0% Buffer B
60.00 120.00
Rack Pos.:
Tube #:2
A
4 6 8 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 1
B
3 5 7 9 11 14 17 20 23 26 29 32 35 38 41
15
25
35
40
55
70
input
29A
30A
31A
32A
33A
34A
35A
36A
37A
38A
39A
40A
41A
42A
1B
2B
3B
4B
5B
6B
7B
8B
9B
10B
11B
12B
Nse1-3-4 Nse1-3 Nse1
Nse1,-3,-4
Nse1,-3
Nse1
3. Gelová filtrace
Nse3
Nse1
Nse4
agregáty
- estery reagují s Lys (ε-amin) a amino-koncem
- homofunkční spojí proteiny dohromady v
jednom kroku (velmi komplexní vzorky pro MS)
- intra- (struktura) nebo intermolekulární (PPI)
Crosslinking
A.
ester
Sinz, MS Reviews, 2006
B.
Sinz, MS Reviews, 2006
- u heterofunkčních postupná
aktivace
- možnost přečistit
crosslinkované peptidy (vzorek
není tak komplexní)
- estery reagují s Lys (ε-amin) a amino-koncem
- imidy reagují s Cys (SH-), azidy (fotoaktivace)
- homofunkční spojí proteiny dohromady v
jednom kroku (velmi komplexní vzorky)
Crosslinking
azid
ester
heterofunkční
Mapování interakcí mezi podjednotkami
pomocí crosslinking
Veld et al., Science, 2014
Nguyen et al., Cell, 2013
Mapování interakcí v
komplexech
- (ko-)purifikovaný komplex
crosslinkovali disuccinimid
suberátem (D10/D12) –
gelová filtrace (oddělili
necrosslinkované komplexy)
– LC-MS/MS analýza
Analýza architektury komplexů (SWR = remodelovací)
- (ko-)purifikované komplexy lze dále analyzovat pomocí elektronové
mikroskopie (cryoEM)
- srovnat tvar různých komplexů (bez spec. podjednotky nebo s protilátkou
proti specifické podjednotce) Nguyen et al., Cell, 2013
Analýza architektury
proteinových komplexů
- krystalové (a NMR) struktury lze
následně „dokovat“ do tvarů z EM
Nguyen et al., Cell, 2013
Bai et al., eLS, 2013
http://elifesciences.org/content/2/e00461/media-2
Studium virových částic
- živý organismus nebo velký
proteinový komplex?
Lengyel et al, JSFG, 2014
• DNA-vazebné komplexy
• Komplexy iniciace transkripce
• Komplexy chromatinu
Metody analýzy proteinových komplexů
(od izolace po detailní analýzu podjednotek)