Sekvenování třetí generace Petra Vídeňská, Ph.D. Sekvenování 3. generace •Nevyužívá amplifikace za účelem zvýšení signálu (měla by být vyšší přesnost –accurancy) •Produkuje dlouhá čtení •Dobrá prosekvenovanost GC bohatých oblastí •Epigenetika •Zatím dvě dostupné technologie – PacBio a Nanopore (MinION) •I Illumina chystá nový systém • Pacific Biosciences (Roche) Pacific Biosciences - AllSeq - Mozilla Firefox PacBio System.PacBio-RS-II-machine Sequel system PacBio RS II Workflow - Pacific Biosciences - Mozilla Firefox PacBio Day1-IntroductionNGS.pdf - Mozilla Firefox PacBio • CCS A B Schéma kruhového konsenzuálního sekvenování - ccs (upraveno podle Travers a kol., 2010) A) SMRT templát obsahuje dvouřetězcovou oblast (inzert) (žlutá a fialová) na obou koncích uzavřanou jednořetězcovými vlásenkovými smyčkami (zelená). Vlásenkové smyčky představují jednořetězcovou oblast, na kterou se může vázat sekvenační primer (oranžová). B) Polymeráza (šedá) prodlužující primer z jedné vlásenkové struktury využívá jedno vlákno DNA jako templát a druhé vytěsňuje. Když se polymeráza dostane zpět k 5´konci primeru, začne vytlačovat již nasyntetizovaný řetězec a pokračuje v syntéze DNA (pohybuje se ve směru modré šipky). Výsledná sekvence je odvozená z obou vláken, pozitivního i negativního. PacBio PacBio Workflow - PacBioWorkflow.pdf - Mozilla Firefox http://www.pacb.com/wp-content/uploads/2015/09/PacBioWorkflow.pdf PaBio Microsoft Word - 012115 Pacbio Guidelines - Project Submission - SMRT Sequencing (DNA) v2.0 FINAL.docx - Pacbio Guidelines - DNA v2_0.pdf - Mozilla Firefox http://mogene.com/userfiles/files/Pacbio%20Guidelines%20-%20DNA%20v2_0.pdf PacBio PacificBiosciencesPresentationNov112014.pdf - Mozilla Firefox PacBio – technologie SMRT PacBioRS_Overview - pacbiors_overview.pdf - Mozilla Firefox http://cgs.hku.hk/portal/files/GRC/Events/Seminars/2011/20110513/pacbiors_overview.pdf Video – SMRT technologie: http://www.pacb.com/smrt-science/smrt-sequencing/ PacBio 1st, 2nd, and 3rd Generation Genome Sequencing Technologies - YouTube - Mozilla Firefox https://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI PacBio PacificBiosciencesPresentationNov112014.pdf - Mozilla Firefox PacBio PacificBiosciencesPresentationNov112014.pdf - Mozilla Firefox PacBio a 16S rRNA Barcoding with SMRT Analysis 2.3 · PacificBiosciences/Bioinformatics-Training Wiki · GitHub - Mozilla Firefox https://peerj.com/preprints/778.pdf Sequencing 16S rRNA gene fragments using the PacBio SMRT DNA sequencing system - 778.pdf - Mozilla Firefox NanoPore Specifications - Community - Oxford Nanopore Technologies - Mozilla Firefox NanoPore Specifications - Community - Oxford Nanopore Technologies - Mozilla Firefox Sample preparation can quickly prepare linear reads (1D) by ligating on a single adaptor or generate 2D reads with a leader adaptor and Hairpin (joins both the template and complement strands together) giving the system two looks at each region of the DNA NanoPore Specifications - Community - Oxford Nanopore Technologies - Mozilla Firefox NanoPore Specifications - Community - Oxford Nanopore Technologies - Mozilla Firefox NanoPore Oxford Nanopore Technologies - Mozilla Firefox How it works - Science & Technology - Oxford Nanopore Technologies - Mozilla Firefox https://nanoporetech.com/applications/dna-nanopore-sequencing https://www.youtube.com/watch?v=AR6A-zZgX6E Příprava knihovny MinION KL14.pptx - Brown.pdf - Mozilla Firefox NanoPore KL14.pptx - Brown.pdf - Mozilla Firefox NanoPore KL14.pptx - Brown.pdf - Mozilla Firefox MinION a metagenomika Rapid metagenomic identification of viral pathogens in clinical samples by real-time nanopore sequencing analysis - art%3A10.1186%2Fs13073-015-0220-9.pdf - Mozilla Firefox https://genomemedicine.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13073-015-0220-9 Shrnutí rozdílů 1, 2 a 3 generace sekvenování • • • •https://www.youtube.com/watch?v=_ApDinCBt8g