Metagenomika – příprava knihovny 16S rRNA Petra Vídeňská, Ph.D. Faktory ovlivňující výsledek sekvenace genu pro 16S rRNA •Sběr vzorků –Čas vystavení vzduchu –Teplota –Postup •Izolace DNA –Použitý kit a metoda disrupce bakteriálních buněk –Čas po který je vzorek rozmrazován před izolací •Příprava knihovny –Výběr primerů –Polymeráza –Počet cyklů PCR (vznik chimér) •Sekvenace –Výběr sekvenační platformy –Kvalita knihovny •Analýza –Použitý quality trimming –Použité algoritmy pro výběr OTU –Algoritmus výběru reprezentativních sekvencí –Výběr databáze 16S rDNA – – – Gen pro 16S rRNA •Gen pro 16S rRNA využil roku 1977 Carl Woese ke zjištění fylogenetických vztahů mezi bakteriemi. •Navrhl oddělit archea od prokaryot a navrhl rozdělení organizmů do tří domén: Archea, Bacteria a Eukaryota •Taxonomická klasifikace na základě 16S rRNA se využívá k vytvoření fylogenetických vztahů, odhadu diverzity, vyrovnanosti mikrobiálního společenství a struktury komunity •16S rRNA je nezbytnou součástí ribozomální podjednotky 30S, která je u prokaryot odpovědná za translaci RNA do proteinů. •3´ konec 16S ribozomální RNA obsahuje anti-Shine-Dalgarnovu sekvenci, která váže do vazebného místa ribozomu 5´ konec mRNA •16S rRNA napomáhá spojení obou ribozomálních podjednotek (30S a 50S) a utváří tak kompletní bakteriální ribozom. •Obsahuje jednak konzervativní oblasti, na které lze navrhovat primery a jednak hypervariabilní oblasti umožňující rozlišení bakterií a určení diverzity bakterií ve vzorku • 16S rRNA • FIG. 1. vyber primeru Sekundární struktura 16S rRNA Nevybarvené oblasti odpovídají hypervariabilním oblastem V1 – V9. Vytvoření primerů in silico Ukázka setu 6 primerů (A – F) pokrývající vždy dvě variabilní oblasti a jejich teoretické forward i reverse čtení. Schéma ukazuje relativní pozici jednotlivých amplikonových čtení i jejich směr, stejně jako které báze budou začleněny do sekvence. Jako ukázkový templát posloužil gen pro 16S rRNA E. coli s přibližným vyznačením variabilních oblastí. Fylogeneze •https://www.patricbrc.org/portal/portal/patric/Phylogeny?cType=taxon&cId=2 PATRIC::Bacteria::Phylogeny - Mozilla Firefox Příprava knihovny- kontrola vyizolované DNA •Klasický agarózový gel (TapeStation) •Měření koncentrace –Spektrofotometricky (Nanodrop) –Fluorometricky (Qubit, PicoGreen) – Výběr specifických primerů WJG-16-4135.pdf - Mozilla Firefox WJG-16-4135.pdf - Mozilla Firefox Výběr specifických primerů WJG-16-4135.pdf - Mozilla Firefox Výběr specifických primerů WJG-16-4135.pdf - Mozilla Firefox Výběr specifických primerů Kontrola vybraných primerů •https://rdp.cme.msu.edu/probematch/search.jsp •F 5’-GGAGGCAGCAGTRRGGAAT (347F) •R 5’-CTACCRGGGTATCTAATCC (803R) • Probe Match - Mozilla Firefox Probe Match - Mozilla Firefox Kontrola vybraných primerů Výběr primerů z publikací Název lenght Tm Sekvence Poznámka ozn 16S_V1/V3F_ERB 492 58 GAG TTT GAT CNT GGC TCA G Erb-Downward at al., 2011 16S na pyrosequencing pr1 16S_V1/V3R_ERB 58 GWN TTA CNG CGG CKG CTG Erb-Downward at al., 2011 16S na pyrosequencing 16S_V3/V4F_NOSS 456 60 GGA GGC AGC AGT RRG GAA T Nossa et al., 2010 16S na pyrosequencing pr2 16S_V3/V4R_NOSS 56 CTA CCR GGG TAT CTA ATC C Nossa et al., 2010 16S na pyrosequencing 16S_V3/V4F_CLAE 464 66 ACT CCT ACG GRA GGC AGC AG Claesson et al., 2010 16S na pyrosequencing pr3 16S_V3/V4R_CLAE 52 TAC NVG GGT ATC TAA TCC Claesson et al., 2010 16S na pyrosequencing 16S_V4/V5F_CLAE 363 53,3 AYT GGG YDT AAA GNG Claesson et al., 2010 16S na pyrosequencing pr4 16S_V4/V5R_CLAE 56 CCG TCA ATT YYT TTR AGT TT Claesson et al., 2010 16S na pyrosequencing 16S_V2/V3F_MCKE 345 50 CTG CTG CCT YCC GTA McKenna at al., 2008 16S na pyrosequencing pr5 16S_V2/V3R_MCKE 58 AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG McKenna at al., 2008 16S na pyrosequencing 16S_univ-2F - - GAG GAA GGI GIG GAI GAC GT Tseng et al., 2003 pro real-time PCR pr6 16S_univ-2R - AGI CCC GIG AAC GTA TTC AC Tseng et al., 2003 pro real-time PCR Real-time PCR s vybranými primery Strategie přípravy amplikonů 1. Dvoustupňová PCR - primery lze nasyntetizovat s extenzí, na kterou se pak pomocí PCR přidají komerční indexy (např. Nextera XT) •Výhody •Přesný protokol, není potřeba žádná optimalizace •Vysoká efektivita připojování adaptorů •Nevýhody •Vysoká cena •96 indexů (lze i více, ale prodražuje se to) •Hodně vzorků se pooluje najednou, velká nevyrovnanost (s 200 vzorky nikdo nebude dělat qPCR, pooluje se pouze na základě výsledků fluorometrického stanovení koncentrace) •Dvoustupňová PCR • Strategie přípravy amplikonů •2. Dvoustupňová PCR s vnitřními tagy – stejný postup jako předtím, ale před specifickým primerem je vložena značka • 16S Amplicon PCR Forward Primer = 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG- N az NNN- značka (min. 5 nukleotidu)-spacer (2 nukleotidy)-CCTACGGGNGGCWGCAG 16S Amplicon PCR Reverse Primer = 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG- N az NNN- značka (min. 5 nukleotidu)-spacer (2 nukleotidy)-GACTACHVGGGTATCTAATCC Extenze, oblast potřebnou pro pozdější přidání indexů N – nukleotidy které přidáváme aby byla vyšší diverzita během sekvenování (např. pět primerů bude mít 1 N, pět primerů 2N, pět primerů 3N…) značka – sekvence odlišující mezi sebou jednotlivé vzorky spacer – odděluje značku od oblasti komplementárni k oblasti zajmu vlastní primer, komplementární k oblasti zájmu •2. Dvoustupňová PCR s vnitřními tagy •Výhody –Po prvním poolovaní před indexací se pracuje již s méně vzorky – snadnost –Cena – ušetří se za indexy –Lépe vyrovnaná knihovna •Nevýhody – dvoustupňová PCR – • Strategie přípravy amplikonů •3. Sekvenace přímo produktů amplifikace •Amplikony 100 – 500 bp – primery s extenzí přímo na sekvenování, musí obsahovat extenzi a index (jen jeden z nich) •Caporaso a kol. (http://www.earthmicrobiome.org/emp-standard-protocols/16s/ ), pozor jiný sekvenační a indexační primer –Forward: AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC TATGGTAATT GT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA –Reverse: CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT Index AGTCAGTCAG CC GGACTACHVGGGTWTCTAAT •Pro sekvenační kit s TruSeq indexy, viz. Nelson a kol., 2014 (Analysis, Optimization and Verification of Illumina - Generated 16S rRNA Gene Amplicon Surveys) –Forward:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT- TruSeq indexy-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT –Reverse:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-NNNN •Podobně i Kozich a kol. (http://aem.asm.org/content/suppl/2013/08/06/AEM.01043-13.DCSupplemental/zam999104626so1.pdf) • • • Strategie přípravy amplikonů •3. Sekvenace přímo produktů amplifikace •Výhody –Rychlá příprava –Pouze jedna PCR reakce –Cena •Nevýhody –Hodně vzorků se pooluje najednou, velká nevyrovnanost (s 200 vzorky nikdo nebude dělat qPCR, pooluje se pouze na základě výsledků fluorometrického stanovení koncentrace) – – – – • • Strategie přípravy amplikonů •4. Za pomocí TruSeq PCR free (http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_dna_pcr_free_lt_sample_prep_kit.ilmn ) •Protokol stejný jako pro chromozomální DNA, jen se nepoužije Covaris •Výhody –oproti postupu 1. nemusí mít primer extenzi, lze ligovat na růzmé PCR amplikony –Není druhá PCR – méně chyb zanesených polymerázou •Nevýhody –Delší a složitější příprava –Knihovna se hůře kontroluje (nízká koncentrace, 1. řetězcová DNA) • Strategie přípravy amplikonů •5. Vytvoření vlastní dvoustupňové PCR – •první sada primerů obsahuje vlastní extenzi a oblast zájmu, druhý pár primerů obsahuje kompatibilní oblast k první extenzi, index a extenzi nutnou k sekvenaci •Výhody –Variabilita použití –Cena •Nevýhody –Optimalizace Strategie přípravy amplikonů •PCR reakce – s 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix, 3x 10 ml, následné smíchání •Kontrola produktu na gelu/Agilentu •Přečištění AMPure Beads •Změření koncentrace vzorků pomocí fluorometru (Qubit, PicoGreen) •Příp. kontrola některých vzorků na Agilentu (kontrola odmytí primerů, že je pouze jeden produkt) Postup při dvoustupňové PCR s vnitřními tagy •Poolování vzorků před indexací • • • • •Přidání indexů - 2. PCR – nutná kontrola indexů (vytvoření sample sheetu) !!! • Vzorek Primery s vnitřní značkou – 1.PCR Indexy - 2.PCR 1-20 1-20 1 21-40 1-20 2 41-60 1-20 3 … … … Agrigenomics - Microsoft PowerPoint Postup při dvoustupňové PCR s vnitřními tagy •Přečištění AMPure Beads •Změření koncentrace vzorků pomocí fluorometru a/nebo qPCR •Poolovaní vzorků před sekvenací •Kontrola knihovny (Agilent, qPCR) •Sekvenace na Illumina –Lépe mírně podklastrovat (hodně nízká diverzita knihovny) –Přidat PhiX (5-50%) pro zvýšení diverzity • • • Postup při dvoustupňové PCR s vnitřními tagy Tipy a triky •Vést si záznamy –Koncentrace vyizolované DNA –Gel s vyizolovanou DNA – ideálně nanášet stejně vyředěnou DNA –Gel s výsledky PCR, koncentrace po přečištění – Tipy a triky •AMPpure beads x SPRI Select beads? •AMPpure beads = SPRI Select beads •http://core-genomics.blogspot.cz/2012/04/how-do-spri-beads-work.html Size selection B24965AA_SPRIselect User Guide.book - techdocs - Mozilla Firefox B24965AA_SPRIselect User Guide.book - techdocs - Mozilla Firefox Size selection B24965AA_SPRIselect User Guide.book - techdocs - Mozilla Firefox Size selection