Základy genetiky prokaryotické buňky DNA 1 Chromozomová (jaderná) DNA nU prokaryot (bakterie, archea) dvouřetězcová většinou kružnicová nU eukaryot dvouřetězcová lineární nU DNA-virů dvouřetězcová lineární, jednořetězcová lineární nebo jednořetězcová kružnicová nExtrachromozomální DNA - plazmidová, chloroplastová a mitochondriová DNA jsou většinou kružnicové Replikace nukleových kyselin nReplikace – tvorba kopií molekul nukleových kyselin zajišťujících přenos genetické informace z DNA do DNA nebo z RNA do RNA Semidiskontinuální syntéza DNA Semikonzervativní Replikace chromozómové DNA Replikace plazmidové DNA Repl replikace počátek replikace replikační vidlice rodičovský řetězec dceřinný řetězec replikační vidlice terminace replikace Základní schéma transkripce Transkripce heterogeneous nuclear RNA http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/d/df/Pre-mRNA_to_mRNA.svg/704px-Pre-mRNA_to_mRN A.svg.png Transkripční jednotka Transkripční jednotka Dědičnost, proměnlivost a přenos znaků u mikroorganizmů ndědičnost – souhrn znaků, které jsou v procesu reprodukce předávány na potomstvo n ndědičné znaky Genetická informace nGenetická informace je obsažena ve sledu (pořadí) nukleotidů – nukleotidových sekvencích funkčních typů nukleových kyselin Nukleotidové sekvence n n * v DNA nebo RNA sekvenci je obsažena informace o primární struktuře proteinu n * v DNA je informace o primární struktuře biologicky funkční RNA (tRNA, rRNA, …) n * RNA sekvence může obsahovat informaci o struktuře DNA n * DNA nebo RNA sekvence může obsahovat informace o vazbě ke specifickým proteinům (začátek nebo konec transkripce) Základní pojmy nGen – jednotka genetické informace n n Gen obsahuje genetickou informaci o primární struktuře buď n * funkční molekuly translačního produktu (polypeptidu, proteinu) n * funkční molekuly produktu transkripce (tRNA, rRNA atd.) nepodléhající translaci Genetický kód nSystém pravidel determinujících způsob přepisu pořadí nukleotidů do pořadí aminokyselin v peptidickém řetězci Genetický kód nZákladní jednotkou genetického kódu je n kodon n n tj. pořadí nukleotidů, kódující určitou aminokyselinu v peptidickém řetězci Genetický kód nGenetický kód je tripletový nJe sestaven ze 64 kodonů nJe degenerovaný (jedna aminokyselina je kódována několika kodony) nSchopnost kodonu kódovat aminokyselinu se označuje jako smysl kodonu nAminokyseliny kóduje pouze 61 kodonů n Genetický kód Kodony První nukleotid Druhý nukleotid Třetí nukleotid (5´konec) U C A G (3´konec) U Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys C Leu Ser N N n.Secys A Leu Ser N Trp G C Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G A Ile Thr Asn Ser U Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Met n.I Thr Lys Arg G G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G N – nesmyslný kodon I – iniciační kodon Val Val Genetický kód nNěkteré kodony jsou nesmyslné n * UAA - ochre n * UAG - amber n signalizují ukončení syntézy polypeptidu (terminační kodony) n * UGA - opal je bifunkční n - terminační kodon n - kodon pro selenocystein amber mutations (UAG) were the first set of nonsense mutations to be discovered, isolated by Richard Epstein and Charles Steinberg and named after their friend Harris Bernstein (whose last name means "amber" in German) Gen nv genu je kodována n n * primární struktura bílkovinného řetězce (strukturní geny) n * struktura tRNA n * struktura rRNA n * mají regulační funkci Gen nLokus - umístění genu kódujícího daný enzym metabolické dráhy na různých místech chromozomu (u eukaryot) n n nGenom – souhrn všech genů buňky nebo viru n nU eukaryot jsou geny lokalizovány v různých organelách → jádro,mitochondrie nebo chloroplasty (případně plazmidy) nU prokaryot jsou geny lokalizovány na chromozomové DNA a plazmidech Genotyp nSouhrn všech genů představujících genetickou informaci n * nesených na chromozomální i extrachromozomální DNA nProjev genotypu (potenciál pro projev v podobě znaků) je závislý na podmínkách vnějšího prostředí Fenotyp nProjev genotypu za daných vnějších podmínek n nZnamená to, že daný genotyp se může v různých podmínkách projevit různě Fenotyp nPokud je změna vnějších podmínek tak intenzivní, že vede k nápadné změně fenotypu, označuje se tato změna jako modifikace fenotypu nModifikace se projevuje u převážné části mikrobiální populace nModifikace je jev reverzibilní. Po odeznění podmínek vyvolávajících změnu, se vrací populace do “normálního“ stavu Plazmidy nSamostatný replikon tvořený dsDNA (cirkulární nebo lineární) nNěkteré plazmidy jsou epizomální (mohou se reverzibině zabudovat do chromozomu) nNenese informace o dělení buňky nNese informace o specifickém fenotypovém projevu plazmid Plazmidy nKaždý plazmid obsahuje n * lokus ori – počátek replikace n * lokus inc – místo pro připojení na biologickou membránu při replikaci Plazmidy nPlazmid je n * jednokopiový – pouze jedna kopie DNA v buňce n * vícekopiový – několik kopií téhož plazmidu v buňce Plazmidy nPlazmid je n * kompatibilní – dva různé plazmidy v jedné buňce mají odlišný lokus inc, mohou se replikovat současně n * inkompatibilní – mají stejný lokus inc Plazmidy nPlazmid může být v n * autonomním stavu - samostatný replikon lokalizovaný volně v základní cytoplazmě (replikuje se nezávisle na replikaci chromozomu) n * integrovaném stavu – navázaný mezi geny v chromozomální DNA (replikuje se současně s replikací chromozomu) Plazmidy nPlazmid je n * konjugativní – obsahuje geny tra (označované i jako fertilitní faktor) zodpovědné za syntézu sexuálních pilusů, a průběh konjugace n * nekonjugativní – neobsahují geny tra Plazmidy u bakterií nPlazmidy se u bakterií vyskytují velice často – málo druhů bez plazmidů n nPlazmidy F a F´ - konjugativní plazmidy u E.coli K12 n * F faktor (fertilitní faktor) n * Jsou zodpovědné za průběh konjugace n * Jsou zodpovědné za syntézu sexuálních pilusů R - plazmidy nR faktory jsou zodpovědné za rezistenci k * antibiotikům * těžkým kovům * buněčným toxinům nObjeveny byly v Japonsku v r. 1950 při epidemii dysenterie nJeden plazmid může nést informaci o rezistenci k několika látkám – vznik polyrezistentních kmenů n n n R - plazmidy R plazmid sejmout0012 R plazmid Bacteroides fragilis kodující rezistenci ke clindamycinu počátek replikace počátek přenosu Bakteriocinové faktory nBakteriocin – bílkovina usmrcující citlivé kmeny téhož druhu nebo jiných druhů nBakteriociny působí na cytoplazmatickou membránu nebo na syntézu bílkovin. Mohou také blokovat vazebná místa na buněčné stěně (receptory) nCol plazmidy (koliciny) Bakteriocin bakteriocin Pyocin R - Pseudomonas aeroginosa Plazmidy nKryptické n nPředstavují skupinu plazmidů, jejichž fenotypový projev není dosud znám nDegradativní n nNesou informaci o schopnosti využívat “neobvyklé“ látky (toluen, oktan, kafr, kys. salicylovou, …..) n Plazmidy kvasinek nDosud popsány u některých druhů rodu Saccharomyces, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Candida a Zygosaccharomyces nNejlépe prostudovaným je plazmid označený 2μm n Saccharomyces cerevisiae nVyskytuje se v nukleoplazmě v 60-100 kopiích na diploidní buňku nPlazmid 2μm se používá v genovém inženýrství jako vektor pro klonování n n Plazmid 2μm nThe 2 μm circle is a small double stranded DNA plasmid that occurs at about 60 copies per cell in the nuclei of virtually all strains of Saccharomyces cerevisiae. The plasmid has no apparent phenotypic effect on host cells, and is the basis of many useful vectors for the transformation of yeast. Under certain circumstances, the plasmid is apparently able to replicate more than once per cell cycle; this over-replication allows the maintenance of the plasmid at high copy number. The plasmid has two inverted repeat sequences, and encodes a product that catalyses intramolecular recombination between these two repeats. Models are proposed whereby recombination leads to copy number amplification. In particular, it is proposed that intra-molecular recombination during replication flips the orientation of one replication fork with respect to the other, so that both forks travel in the same direction around a circular monomer template, generating a large multimer from a monomer and a single initiation of replication. Změna genetické informace nMutace nPřenos znaků n * u prokaryot n * u eukaryot Přenos znaků u prokaryot nRekombinace n n * transformace – přenos izolované DNA do recipientní buňky n * transdukce – přenos DNA z donorové buňky do recipientní pomocí bakteriofága n * konjugace - přenos DNA z donorové buňky do recipientní konjugačním můstkem Transformace Mrtvá donorová buňka Recipientní buňka Kompetentní recipientní buňka (živá) Transformovaná rekombinovaná buňka Fragmenty DNA z donorové buňky degradace buňky volná DNA (chromozomální, plazmidová) Transformace – vstup DNA do buňky n n1. Dlouhé fragmenty chromozomální DNA nebo plazmidu se váží k vazebným bílkovinám na vnější straně buněčné stěny a je částečně štěpena nukleázami n2. Jeden řetězec DNA je degradován DNAázou n3. Nedegradovaný řetězec se napojuje na specifický kompetenční protein n4. Jednoduchý řetězec vstupuje do buňky a je integrován do chromozomu recipientní buňky výměnou homologní části chromozomu nukleotidy Transformace – vstup DNA do buňky Chromozom recipientní buňky transformační DNA DNA vážící protein nukleáza volné nukleotidy specifický protein vážící jednořetězcovou DNA homologní rekombinace transformovaná buňka RecA protein adorbující ssDNA Transformace – vznik rekombinantního transformanta fragmenty DNA chromozom recipientní buňky vazba a přenos chromozomální DNA degradace DNA integrace DNA stabilní transformant neúspěšná transformace nebo Transformace – vznik plazmidového transformanta plazmidová DNA chromozom recipietní buňky absorbce a přenos plazmidové DNA plazmidový transformant Transdukce přenos DNA donorové buňky do recipientní bakteriofágem fágová DNA nebo transdukující fágová částice plazmid donorové buňky fragment chromozomu donorové buňky “normální“, netransdukující, lyticky aktivní fágový virion Transdukce nPro transdukci je používán pouze temperovaný bakteriofág n nTransdukce nespecifická – je přenášen jakýkoliv úsek DNA hostitelské buňky (fragment chromozomu nebo plazmid) nTransdukce specifická – je přenášen určitý úsek DNA hostitelské buňky (fág λ E.coli přenáší pouze gen gal nebo bio – syntéza n biotinu) Transdukce -nespecifická stabilní tranduktant netransdukovaný recipient degradace DNA donora se neitegruje lyze buňky a přenos DNA do recipietní buňky syntéza fágové DNA a bílkovin kapsidu maturace fágové částice transdukující částice destrukce DNA hostitelské buňky integrace přenesené donorové DNA do chromozomu recipienta dělení buňky dědičnost v linii vznik rekombinantního transduktanta abortivní transdukce Transdukce - specifická profág lyzogenizovaná buňka s profágem indukce chybná excize (chromozom fága obsahuje bakteriální geny) replikace defektivní DNA fága a inkorporace do hostitelské buňky maturace a uvolnění transdukujících fágových částic infekce recipientní buňky integrace přenesených homologních genů chromozom recipienta obsahující přenesené geny integrace přenesených genů i fágové DNA integrace jako profág Transdukce - specifická nFág λ se začleňuje specificky mezi geny gal a bio nPři excisi je do genomu fága včleněn gen gal (nebo bio) – defektní bakteriofág nTransdukující fág přenese gen do recipientní buňky nHelper fág infekce hostitelské buňky E.coli K12 cirkulární chromozom fága λ bakteriální chromozom integrace profága chybná excize profága transdukující chromozom fág může infikovat a integrovat se do nové hostitelské buňky Transdukce - specifická gal+ chybná excize normální excize gal+ att polohy gal+ λdgal gal+ gal- gal+ gal+ integrace do chromozomu buňky λdgal gal+ λ gal+ gal- gal- gal+ gal+ stabilní transduktant nestabilní transduktant lyze buňky Konjugace n nTvorbu sexuálního pilusu koduje gen nesený na plazmidu F (buňky F+) – fertilitní faktor – gen tra - konjugativní plazmid nVýsledkem konjugace je n n * plazmidový transkonjugant n * rekombinantní transkonjugant Vznik plazmidového transkonjuganta bakteriální chromozom F plazmid pilus F+ buňka F- buňka zkrácení pilusu rozštěpení jednoho řetězce plazmidu přenos jednoho řetězce do recipientní buňky syntéza komplementárních řetězců v obou buňkách dokončení přenosu a syntézy - oddělení buněk F+ buňka F+ buňka Vznik plazmidového transkonjuganta nepřenášený řetězec DNA polymeráza rozmotávací protein (Tral) membránový protein vážící plazmid specifický membránový protein recipienta přenášený řetězec primer DNA polymeráza buněčné stěny primer recipient donor Detail replikace a přenosu plazmidu Vznik rekombinantního transkonjuganta 1. Vznik buněk Hfr (high-frequency recombination) Hfr buňky vznikají inzercí plazmidu F do chromozomu donorové buňky Hfr buňky F+ buňky integrovaný faktor F inzerce faktoru F Rekombinace mezi F faktorem a chromozomem buňky Vznik rekombinantního transkonjuganta 1.Vznik buněk Hfr – začlenění plazmidu F do chromozomu buňky F+ (high frequency recombination) la Vznik plazmidu F´ F´ Hfr chybná excize plazmidu F – obsahuje část chromozomu buňky Konjugace buňky F´ s buňkou F- F´ F- začátek replikace plazmidu F´a jeho přenos replikace plazmidu F´ a jeho přenos F´ F´ Vznik rekombinantního transkonjuganta 2. Přenos chromozomu Hfr do buněk F- Hfr buňky F- buňky Hfr buňky rekombinantní F- buňky replikace a přenos části chromozomu v recipientovi: rekombinace mezi přenesenou částí chromozomu Hfr a F- chromozomem Vznik rekombinantního transkonjuganta Přenos chromozomu Hfr do recipientní buňky inkorporovaný plazmid chromozom Detekce rekombinant Kultivace, konjugace, vysetí na selektivní medium selekce rekombinant Lac+ rekombinanty Thr+ Leu+ rekombinanty Minimální medium se streptomycinem a glukózou;selektivní pro markerThr+ a Leu+ ne pro Lac minimální medium se streptomycinem, laktózou, treoninem, leucinem; selektivní pro marker Leu+ ne pro Thr a Leu