Transkripce přepis genetické informace z DNA do RNA, při které DNA slouží jako matrice pro syntézu RNA. Reakci katalyzuje RNA-polymeráza (transkriptáza) Zpětná transkripce (reverzní transkripce: RT) - přepis genetické informace z RNA do DNA. Reakci katalyzuje zpětná (reverzní) transkriptáza Transkripce sekvence DNA do sekvence RNA DNA 3- TACC AACGCGAATTC 5' • • • • AUGG 5 RNA 3'-T A C C C AACGCGAATTC-5' RNA ÁŮGGGŮLJG 5'-► 3' 2 Značení řetězců DNA podle jejích funkce dsDNA kódující (pozitivní) [nepřepisující se] 3 ' + 5 ........................... 3 ........................... antikódující (negativní) (-DNA) [přepisující se] 5' transkripce i m RNA 3 ' + 5' GATC 3' 3' CTAG 5' 5' GAUČ 3' Směr syntézy mRNA při transkripci, směr translace mRNA a směr syntézy polypeptidů Syntéza polypeptidů N-konec.....C-konec Transkripce u prokaryot je spřažena s translací, u eukaryot jsou tyto procesy odděleny Prokaryota Eukaryota 5 Srovnání prokaryotické a eukaryotícké mRNA Prokaryotní mRNA kódující sekvence \ PXPXP 1 protein a nekódující sekvence \ 1 I protein ß protein y 3' Polygen ní mRNA Eukaryotní mRNA ®f<£XE®! CH, i '_ 51 -čepička kódující sekvence \ I nekódující sekvence 3' "Iaaaaa Monogen ní mRNA (a) protein 6 Srovnání prokaryotických (jednoduchých) strukturních genů s eukaryotickými (složenými) geny kódující oblast bakteriální gen kódující oblasti nekódující oblasti (exony) {introny} eukaryontní gen Geny mohou být transkribovány z obou řetězců; jako templát je na daném úseku DNA využíván obvykle jen jeden z řetězců RNA-transkripty i_i 5000 nukleotidových párů 8 Typy RNA vznikající při transkripci u různých typů organismů Total RNA Coding RNA 4% of total Noncoding RNA 96% of total Pre-mRNA (hnRNA) Pre-rRNA Pre-tRNA snRNA snoRNA scRNA tmRNA and various other types mRNA rRNA tRNA KEY All organisms Eukaryotes only Bacteria only Molekulární druhy molekul RNA vytvářené transkripcí u eukaryot Transkripce a úpravy RNA probihaji u Jádře. Translace probihS v cytoptamí. Enzymy katalyzující transkripci A. DNA-dependentní RNA-polymeráza (RNA-polymeráza, transkriptáza) matricí je řetězec DNA (prokaryota, eukaryota, DNA-viry) B. RNA-dependentní DNA-polymeráza (zpětná/reverzní transkriptáza) matricí je řetězec RNA (retroviry, retrotranspozony, retroelementy) Primární transkripty tvořené na řetězci DNA přepisy strukturních genů (mRNA, pre-mRNA/hnRNA) O přepisy genů pro funkční typy RNA • pre-rRNA • pre-tRNA • malé RNA (snRNA, snoRNA, scRNA, miRNA, ...) 11 Funkce podjednotek RNA-polymerázy u E. coli podmiňuje vazbu ribonukleotidů na polymerázu udržuje stabilitu molekuly podmiňuje vazbu RNA-polymerázy k promotoru podmiňuje spojení RNA-polymerázy s matricovým řetězcem 12 Struktura RNA-polymerázy 13 Strukturní gen prokaryot s vyznačením signálů pro transkripci a translaci transkripčné regulačné signály translačné regulačné signály ■* oblasť -35 PRIBNOWOV BOX iniciácia SD -10 transkripcie iniciačný kodón rozpoznávacia sekvencia ' vazbové miesto pre RNA-polymerázu pre RNA-polymerázu + 1 väzbové miesto pre ribozóm TGTTGACA TATAATG DNA 12 13±2 7 TAAGGAG 4-9 3-9 2-1t 18-129 m RNA í tga ,_ oblasť kódujúca terminučný terminátor polypeptidový kodón reťazec transkripcie protein Sekvence po směru transkripce (downstream) a proti směru transkripce (upstream) Základní schéma typů transkripčních jednotek bakteriálního genomu Neoperonová transkripční jednotka a operony NEOPERONOVÁ TRANSKRIPČNÍ JEDNOTKA startovací nukleotid strukturní gen strukturní gen terrnmátor I t promotor operátor OPERONY rn strukturní gen strukturní gen +1 1 strukturní gen strukturní gen operátor překrývající se s promotorem Operátor: regulační sekvence, na kterou se váže regulační protein Transkripce strukturních genů u bakterií Schéma bakteriální mRNA a transkripční jednotky obsahující strukturní geny -transkripční jednotka (vyjádřená v negativním DNA-řetězci) startovací nukleotid ■r ^ promotor TCCT vedoucí^** sekvence 1M*" A1 ^ AGGA AUG UAG TAC ATC AUG UAG TAC ATC terminátor AUG UAG -Na ribozomu se překládá jen tento úsek- koncová sekvence 3' mRNA Úseky obsazené geny A, B, C jsou mnohonásobně delší než ostatní! Schéma upozorňuje jen na složení transkripční jednotky a mRNA. Neupozorňuje na délku jednotlivých úseků. Shineova-Dalgarnova sekvence mRNA je multigenní Slouží bezprostředně jako matrice pro syntézu proteinů velmi rychle se rozkládá ribonukleázou (1-2 min) 16 Funkční elementy bakteriálního promotoru -35 -10 + KA.G) I TTGACAT 16-18b promotor < silný slabý TATAAT P " i mRNÁ Pribnowův startovací box nukleotid box = krátká sekvence o stejné funkci sekvence -10 templätové vlákno sekvence -35 T T A -• A 5-9 A " transkripce - nebe 5' C AACTGT TŤGÄCÄ 16-19 bp netemplátové vlákno sekvence proti směru transkripce AAT A G -K- sekvence po směru transkripce lokální rozvíjení Sekvence přirozených a hybridních promotorů CONSENSUS lac trp XPL recA -35 Region -10 Region 123456789 1011121314151617 • ♦ • T TG A:C A • » • * * * • • • * • • * • ♦ * • TATA A T ♦ • G GCT TTACACTT TATGCTTCCGGCTCGTATATTGT C TGT TGACAAT T AA T C A T C G A A C TAGT TAACTAG G TG T TGACA TAAATACCA CTGGCGGTGAT AC TG A CACT TGATACTGTAT G A A GCA T A C A G T AT AAT TG tad tacU C TGT TGACAATTAATCAT CTGTTGACAATT AATCAT CGGC T CGTAT AATG T CGAACTAGTTTAATGT 15-18 bp 5-9 bp Hybridní promotory tac = lac x trp Transkripce bakteriálního genu RNA-polymerázou 1. iniciace 2. elongace 3. terminace 5'l 3'i terminace a uvolnění polymerázy a hotového řetězce RNA 3|] DNA J znovunavazaru sigma-faktoru 19 Vytváření molekul mRNA na prokaryotické transkripční jednotce a spřažení transkripce a translace u prokaryot transkripty (RNA) genů podléhají translaci na mnoha ribozomech současně směr transkripce 20 Výměna podjednotek vázajících se na RNA-polymerázu v průběhu transkripce sigma-faktor |L|RNA-DOlvmeráza a- faktor rozeznává sekvenci -35 na promotoruA Po skončení této funkce se z RNA-polymerázy I uvolňuje. RNA-polymeráza katalyzuje transkripci L bez sigma-faktoru, který je v průběhu elongace) nahrazen NúsA-proteinem Term i nace RNA-polymeráza se z terminátoru uvolní a NusA-protein je opět nahrazen sigma-faktorem. Obr. 148 Vzájemné výměny sigma-faktoru a NusA-proteinu na RNA-polymeráze Terminace transkripce nezávislá na Ró-faktoru Zastavení pohybu RNA-polymerázy Uvolnění hotové RNA Uvolnění RNA-polymerázy z DNA 21 Vazba prokaryotické RNA-polymerázy na promotor RNA-polymeráza (holoenzym) -50 -40 -30 + -20 RNA-polymeráza zrněni tvar i velikost po rozpoznání promotoru sigma-faktorem. uzavřený binární komplex Obr. 144a iniciace transkripce otevřený binární komplex Obr. 144b Iniciace transkripce +20 bp +20 bp a - stabilita holoenzym u P - vazba rNTP na polymerázu P'- spojení s matricovým řetězcem a - vazba k promotoru Denaturace v oblasti +1 oblast bohatá na páry A:T 22 Iniciace transkripce -40 ■30 -20 vazba sigma-faktoru na-35 +10 +20 +30 bp nascentní RNA Při zakončení fáze iniciace a vstupu do fáze elongace mění sigma-faktor i RNA-polymeráza svou konformaci, což se projevuje změnou v její velikosti i tvaru. Sgma-faktor se uvolňuje z RNA-polymerázy. Iniciační fáze transkripce u prokaryot Rozpoznání sekvence -10 a -35 sigma faktorem Core enzyme IfilMlIÍ....... +1 liiiis iiii Typy terminátorů transkripce u prokaryot sekvence terminátorů přepsané do mRNA a) Sekvence bohatá na GC 1 I I I I I I U A A C A vlásenka se smyčkou b) - J í i i I C A A U C A A U U U U U U U A C C A U Terminátory: a) nezávislý na rho faktoru b) závislý na rho Strukturní rozdíly mezí dvěma typy prokaryotíckých terminátorů (jejich transkriptů) 25 Struktura terminátorů nezávislých na ró-faktoru a jejich přepis do mRNA jedinečná 26 Struktura transkripčního terminátoru nezávislého na rho faktoru DNA 5'- CCCACAGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTAACTTTCTTTAATGA -3' 3'- GGGTGTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAATTGAAAGAAATTACT -5' 111111•11 1 1 1 1 *'111 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ■11111 1 1 1 11 1 1 1 111 ■ 1 1 templátovévlákno DNA transkripce RNA-transkript 5'- CCCACAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU OH-3" rychlé skládáni RNA 1' složená RNA /uTc\ U G G ••• C A ••- U C ... G C ... G G ... C C ... G C ... G G ..« C A A* 5'- C C C A C Složený řetězec RNA napomáha terminaci řetězce. ^^^^ U U U U OH-3' 27 Termínace transkripce mRNA mRNA ^..,.„.i^,::.^..;. DNA vlásenka párování A:U napomáhá uvolnění RNA 28 I. RECOGNITION Terminator DNA Pnniiolor Ccnc tt> be transcribed II. ELONGATION SIGMA IS RELEASED NusA - III. NusA IS PICKED UP NusA Výměna sigma faktoru a NusA proteinu na RNA-polymeráze - Sigma faktor: iniciace - NusA protein - terminace Terminace transkripce za účasti Rho faktoru RNA polymerase Elongační fáze transkripce Připojení Rho-faktoru a jeho pohyb po mRNA Připojení Rho-faktoru k sekvenci terminátoru Rho faktor rozmotává hybridní DNA-RNA Uvolnění Rho-faktoru, RNA-polymerázy a mRNA Terminace transkripce závislá na Rho-faktoru Elongační fáze I M I IIMUnTTTT Rho-faktor se pohybuje za RNA-polymerázou Rho-faktor je rozeznáván NusA-proteinem, který je přechodnou součástí RNA-polymerázy. Rho-faktor katalyzuje po vazbě na tento protein odvíjení mRNA z DNA-řetězce a uvolnění RNA-polymerázy. K tomu je zapotřebí ATP, který je hydrolyzován Rho-faktorem vyznačujícím se aktivitou ATPázy. .....I i Hl I I I I I I Jakmile se RNA-polymeráza zastaví na terminátorové vlásence, Rho-faktor ji dostihne a oddělí RNA od DNA (Rho = helikáza) Transkripce transkripční jednotky pro rRNA (rrn operony) DNA geny tRNA 16S-rRNA tRNA 23S-rRNA |5S-rRNA| | tRNA promotory pre-rRNA transkripce terminátory 1 posttranskripční úprava (vyštěpení funkčních produktů) 16S-rRNA tRNA 23S-rRNA 5S-rRNA tRNA 32 Transkripce transkripční jednotky pro tRNA promotor □j DNA pre-tRNA geny tRNA tRNA transkripce posttranskripční úprava (vyštěpení funkčních produktů) + 4° 4° 4° 5l tRNA tRNA tRNA tRNA ' 1 mRNA 3' 33 Transkripce a úprava genů pro rRNA u bakterií a savců Bakterie Savci gen pro rRNA dna AYAWAyAVAyAYA^W^^ transkripce prekruzor , rRNA30S | prekurzor 4S 16S rRNA tRNA i i I-1 (a) 16S 4S rRNA tRNA 1 štěpení endoribonukleázami prekurzor 23S rRNA prekurzor 5S rRNA 1 C druhotné štěpení endoribonukleázou a zkrácení exoribonukleázami □ 23S rRNA 5S rRNA gen rjro rRNA dna \YAWA/AYAyAVAVAWAWAYAYAm primární transkript - prekurzor rRNA45S transkripce 13 000 nukleotidů 5'ppp i -4 rozložené oblasti primárního transkriptu 1874 nukleotidů 5' 1 (b) 18S rRNA 160 nukleotidů 5' 3' 5 5,8S rRNA úpravy RNA 4718 nukleotidů 28S rRNA 10H 3' 34 Úprava pre-tRNA u E. coli * probíhá působením enzymů xonukleázi I I O —O 0 -0-3' > 150 nucleotides endonukleáza tRNA-nukleotidyltransferáza dodatečné připojení ACC 35 Transkripce u eukaryot cytoplasm a buněčné jádro introny exony gen primární RNA-transkript transkripce přidání 5' -Čepičky a poly(a)-konce ■zzhaaaa sestřih rna aaaa export aaaa Jtransuv l Eukaryotícké DNA-dependentní RNA-polymerázy Matricí pro syntézu RNA je u všech těchto polymeráz negativní DNA-řetězec. Existují tři druhy těchto RNA-polymeráz: • RNA-polymeráza I, která katalyzuje syntézu pre-rRNA. Nachází se v ja-dérku a není citlivá k a-amanitinu Geny I. třídy • RNA-polymeráza II, která katalyzuje syntézu hnRNA a některých malých rRNA. Je citlivá k a-amanitinu. Vyskytuje se v karyoplazmě. Sestává přibližně z 10 protomerů, z nichž tři největší jsou homoloqické s protomery a, 6 a Bprokaryotické RNA-polymerázy. Protomer 6 váže volné ribonukleotidy, 6' se váže k DNA a a spojuje protomery navzájem. Ostatní protomery se neliší od protomerů polymeráz I a III. Geny II. třídy • RNA-polymeráza III, která katalyzuje syntézu pre-tRNA, 5S-rRNA a některých malých RNA. Citlivost k a-amanitinu je druhově specifická. Vyskytuje se v karyoplazmě. Geny III. třídy Každá z uvedených tří RNA-polymeráz vyžaduje svůj specifický promotor, na který se váže. To je rozdíl proti prokaryotům, která mají jen jeden typ RNA-polymerázy a jeden typ promotoru Elementy eukaryotíckého promotoru (Pol II) +1 (startovací nukleotid + Inr-element) - iniciátor TATA-box (Hognessův b.) -34 až -26 - TATA-box CAAT-box -75 až -80 1 Elementy proti směru >- transkripce (upstream elements) GC-box -90 Oktamer ATTTGCAT oktamerový box počátek transkripce +1 ATTTGCAT konzervativní sekvence \ GGGCGG GGCCAATCT konzervativní konzervativní sekvence sekvence / \ / \ GGGCGG TATAAAA konzervativní konzervativní sekvence sekvence 38 Struktura promotoru RNA-polymerázy II obecné transkripční faktory SP1 TBP bazálni trans kripční startovací faktor nukleotid TFUD ATTTGCAT— GG G C G G—G GC C A ATCT—T AT A A A A PyAPyPyPyPyPy v. 100 -90 ■75 30 konvenční sekvence elementů eukaryotického promotoru Inr-element (iniciátor) Promotory různých genů se lišt počtem, umístěním a kombinací těchto elementů. Všechny promotory však musí obsahovat jeden nebo více elementů, aby mohly zahájit bazální transkripci. Provozní geny mají jen tnr-element bez TATA-boxu (Hognessův box). Poznámka Promotory RNA-polymerázy II u některých genů nemají ani TATA-box ani Inr-element Transkripce těchto genů může začít z různých míst seřazených za sebou. 39 Vazebná místa eukaryotického promotoru pro RNA-polymerázu II Promoter 0 Start of transcription Iniciace transkripce eukaryotních genů RNA-polymerázou II za účasti obecných transkripčních faktorů začátek transkripce TATA-box I HUTP, ATP CTP, GTP TRANSKRIPCE ZAČÍNÁ pro zahájení transkripce je nutné navázáni TF na TATA-box a na RNA-polymerázu RNA-polymeráza je fosforylována TFIIH (+ATP), mění konformaci a zahajuje transkripci 41 i-*- místopoiáthu A transkripce o Na TATA box se váže TF1ID. ......... K iniciačnímu kompletu se připojuje TF1IA. D ,_A_. Illlllllllllllllllllllllll .....Illllllllllllllllllll 1 1 11 1 1 ......1......1.....1....... Ke komplexu se připojuje TFIIF, který má rozplélad aktivitu; zároveň se pripojuje polymeraza II im. Q K iniciačnímu komplexu se váže TFIIE. Iniciace transkripce RNA-polymerázou II TFIID obsahuje TATA-vazebný protein (TBP), kterým se váže k TATA-boxu 42 RNA-polymeráza II Posttranskrípční úpravy hnRNA Úpravy konců • 5'-konec: připojení čepičky (angl. cap) • 3'-konec: polyadenylace Úpravy vnitřní sekvence • Metylace • Sestřih • Editace (redakční úprava) 43 Posttranskripční úprava transkriptů strukturních genů eukaryot intron transkripce pre-mRNA H. 0 0 C II II II ,CH -O-P-O-P-O-P-0 -CH OH H0\j 2 I I O" 0 O '2 /O 7-metylguanozin 0 O-CH, I s Q K S'-konci se pripojuje 7-MG čepička. 1. Připojení čepičky 5'-čepička 5'-čepička 5'-čepička mRNA 5'-čepičkai Pripojuje se úsek poly(A). 4Mŕ Q Inlron se vyštěpí. -AAAAA(A)~i90 AAAAOH úsek 3'-poly(A) ô úsek 3'-poly(A) úsek 3'-poly{A) 2. Připojení (poly)A konce 3. Sestřih 44 Struktura čepičky m H/1 OH OH niť a'/ri OH OH OH m7G5 ppp5 -mRNA BÁ2E mRNA°-CH3 Rané stadium transkripce genu RNA-polymerázou RNA-polymeráza II 5' 3 pre-mRNA 5' 7-MG (a) 5'-čepička Sv* ' CH3-GpppNpNp CH, t 2'-0-metyltransferáza 5'- konec primárního CH3-GpppNpNp i=i J guanin-7-metyltransferáza GpppNpNp =3 PP+P i i guanylyltransferáza GTP pppNpNp transkriptu (b) Biosyntetická dráha 7-MG čepičky. 45 Připojení sekvence poly (A) k 3'konci mRNA transkripční jednotka 5'- čepička Q Štěpení endonukleázou. 5'- čepička ^gžf Přidání úseku poly(A) " poly(A)-polymerázou. RNA-polymeráza aauaaa ^bohatá na GU endonukleoiytické štěpení AAUAAA 5'- čepička1 1 MAAA (A}19, AAUMA i V úsek poly(A) 46 Schéma polyadenylace 3'-konce hnRNA hnRNA Přepis polyadenylačního signálu část proti směru transkripce část po směru transkripce faktor rozpoznávací přepis polyadenylačního signály ostatní proteiny komplexu poly (A) • polymeráza štěp^ení^jgi I-1 Tato část se rozloží cxonukíeázou Iniciační fáze polyadenylace elongační fáze polyadenylace 1 I terminace 100 Proces vytváření poly A konce na mRNA RNA polymerase Signály na DNA pro uvolnění mRNA a připojení polyA konce Připojení dalších faktorů, uvolnění mRNA Připojení dalších proteinů vázajících se na polyA CstF - cleavage stimulation factor F CPSF - celavage and polyadenylation specificity factor Hotový 3' - konec mRNA 48 Transport hotové eukaryotické mRNA z jádra do cytoplazmy TRANSLATION Některé z proteinů zůstávají v jádře, jiné jsou transportovány spolu s mRNA do cytoplazmy a zajišťují její stabilitu a iniciaci translace 49 Sestřih (splicing) - proces, při němž jsou odstraňovány introny Intron: nekódující sekvence uvnitř genu Objev: 1977: v genu adenovirů 1978: P-globin, imunoglobulin, ovalbumin, tRNA and rRNA. Známé typy intronů Intron type Where found GU-AG introns AU-AC introns Group 1 Group II Group III Twintrons Pre-tRNA introns Archael introns Eukaryotic nuclear pre-mRNA Eukaryotic nuclear pre-mRNA Eukaryotic nuclear pre-rRNA, organelle RNAs, few bacterial RNAs Organelle RNAst some prokaryotic RNAs Organelle RNAs Organelle RNAs Eukaryotic nuclear pre-tRNA Various RNAs 50 Důkaz přítomnosti intronů v genu pro ovalbumin Splicing diversity (a) Electron micrograph of ovalbumin DNA-mRIMA heteroduplex. RNA Schéma intronu s vyznačením konzervativních sekvencí sekvence potřebné pro vyštěpení íntronu část primárního transkriptu exon 1 exon 2 53 Schéma struktury intronu v hnRNA «- 5' 3' 5' exon 1 AAG.GUAAGU t S'-místo sestřihu R = purinový nukleotid Y = pyrimidinový nukleotid N - jakýkoliv nukleotid A r* = A nebo C intron- y\ s1 31 •YNCURlC-(Y)nN>S CUAAC (Y)nNCAG4G místo větvení Nukleotid poskytující skupinu 2-OH. pyrimidinový úsek Oblast bohatá na pyrimidinové nukleotidy. t 3'-místo sestřihu Sekvence a nukleotidy zakreslené do šedého rámečku jsou vysoce konzervativní (četnost 100 %). Ostatní sekvence se vyskytují v četnosti 70 - 95 %. Sekvence uvedené pod schématem intronu a exonu jsou sekvence, které byly zjištěny u savců. 54 Schéma transesterifikace při sestřihu hnRNA lasovitá intronexonová rna 5' exon 1 —o lasovitá intronová rna První transesterifikace (první přenos OH-skupiny). Druhá transesterifikace (druhý přenos OH-skupiny). Transesterifikace = přeměna jednoho fosfátového esteru v jiný probíhající přenosem OH-skupiny bez hydrolýzy a za nepřítomnosti ATP n. GTP 5' exon 1 exon 2 3' 55 5' O. □ O OH I o= P —o I On vyštěpená intronová sekvence v lasovité formě 2,5- fosfodiesterová vazba - o 5' -konec intronové sekvence O 2' I O O—P —O—i o= P —o On C) o o 0 OH 1 O OH I o= P —o" o= P —o o—i o u On i 3' 3' -konec intronové sekvence O OH 0= P —O I L31___j Průběh sestřihu strukturního genu - účast U snRNP místo 5' -sestřihu axon 1 Ul snRNP U2 snRNP místo 3' -sestřihu / / exon 2 ., . . , j y cast primárního I M 3' transkriptu U4/U6 snRNP U5 snRNP U4/U6 snRNP,. ,---- ■ U5 snRNP Lvurba „lasa" a štěpení místa 5' -sestřihu štěpení místa 3' -sestřihu a spojení obou exonú exon 1 intrort a. exon 2 ll gu a i ag i i I I I 3 5P- / sestřihové místo místo vetvení \ 3'- sestřihové místo B. ■<ľ—r snRNP U1 se váže na 5'- seslňhové misto a snRNP U2 se váže na misto větvení. Částice snRNP Small nuclear ribonucleoproteins Proteiny snRNP + U snRNA + specifické proteiny □ 3' Q Sestavuje se úplný spliceozom a štěpi trarskriptv 5'- ssstřihovém miste. štěpené 5'- sestřihavě místo Q 5'- konec intronu se připojuje h A v miste větveni za vzniku lasovité struktury, uvolňují se U1 a J4. □ 3' vystepena intronova sekvence ve formě lasa bude degradována v jádře V Štěpí se 3'- sestřihové misto a S - konec exonu 2 s9 pripojuje k 3'- konci exonu 1. Intron se uvolňuje ve tvaru lasa spolu s snRNP U2, U5 a U6. exon 1 exoti 2 mPiNA 5' C □ 3' sestřižená mRNA Rozeznávání 5' -místa sestřihu a místa větvení malými jadernými U1-snRNA a U2-snRNA U1-snRNA 3' exon 1 5* Íguaagu 5' U2-snRNA O O ŕ U1-i U2-snRNA jsou komponenty částic U1- a U2-snRNP. Jsou tedy v komplexu s proteiny, které se uplatňují katalyticky při sestřihu a plní též štrukturálni funkci. • m'G UACUAC LEyjCAG místo větvení" V exon 2 pyrimi; -intron- drnový úsek (u savců) 3' Všechny uvedené sekvence nukleotidů jsou vysoce konzervativní u S. cerevisiae a vyskytují se též u jiných organizmů s výjimkou trypanozom, která nemají sekvenci GUGUA v U2-snRNA. S. cerevisiae nemá pyrimidinový úsek. 58 Průběh sestřihu ve spliceosomu během úpravy pre-mRNA A. Před první transesterifikací je U1 snRNP zaměněna za U6 snRNP exon 1 GUAUGU+ 3' rearrangement GUAUGUf 3' B. A je rozpoznán BBP a pak U2 BBP (branchpoint bridging protein) exon 2 5' + UACUA AC C. Změna tvaru U5 přiblíží konce exonů exon 1 UACUACA U G AUG U Účast PRP-proteinů (upravujících prekurzorovou RNA) m í* '■ í ' •' * ' * A . ■• ' , A U G A 'J C ... o Mill -i ; A C U A G U : UACUACA/, ■ ■■"■■■•■.::A :v,;.\: T...... A L G A J í, U ■ U2 rearrangement Účast SR proteinů při rozpoznání míst sestřihu („exon definition hypothesis") intron exon -200 intron 10-105 nucleotides nucleotides 10-105 nucleotides I ]l —----------ff — l SR hnRNP Proteiny SR (bohaté na serin a arginin) se během transkripce průběžně vážou na hranice exonů a pomáhají tak navádět částice snRNP do míst sestřihu Způsoby alternativního sestřihu hnRNA 1 s/y EiHft JHHÍ 5V3' Jeden potenciální exon sousedící se dvěma konstitutivními Jeden potenciální exon s více 5'-místy sestřihu a s jedním 3'-místem s/V s/Xr 4 BBI hrbí H •\/^ Jeďen potenciální exon s více y-místy sestřihu a s jedním 5'-místem Přeskakování jednoho potenciálního exonu = konstitutivní exon i potenciální exon I I = intron Přeskakování více potenciálních exonů Navzájem se vylučující potenciální exony 61 Příklady alternativního sestřihu sestřihu molekul hnRNA vzniklých transkripcí překrývajících se transkripčních jednotek Alternativní terminace transkripce Transkripční jednotky nesoucí gen pro kalcitonin +1 anskripiní jednotky nesoucí gen pro (X- amylázu u myší I hnRNA v bu ňkách slinných žláz HZ hnRNA štítné žlár V hnRNA v neuronech Y hnRNA v bu ňkách jater mRNA vzniklá naznačeným sestřihem se překládá do primární struktury alfa - amylázy. mRNA vzniklá naznačeným sestřihem se překládá do primární struktury kalcitoninu v buňkách štítné žlázy. mRNA vzniklá naznačeným sestřihem se v neuronech překládá do primární struktury CGRP (produkt podobný kalcitoninu). Alternativní začátek transkripce I i = potenciální exon, ^HH = konstitutivní exon, +1 = startovací nukleotid, T = poly(A). 62 Alternativní sestřih genu pro alfa-tropomyozin u krysy (regulace kontrakce svalových buněk) gen a-tropomyosinu 5' 3' i— - exony introny J|!]dna i i i Alternativní zakončení transkripce TRANSKRIPCE A SESTŘIH 3' m RNA z příčně pruhovaného svalu 3" mRNA z hladkého svalu 3' mRNA z fibroblastů 3' mRNA z fibroblastů mRNA z mozku Faktory sestřihu - specifické proteiny aktivní jen v daném typu buňky 63 Sestřih kombinačních exonů hnRNA obsahující přepis genu kódujícího troponin T hnRNA 1 23456789 1011 121314 15 1617 18 I I I HHHHH I I I I 11 I i-h- konstitutivní kombinační konstitutivní exony exony exony Vystepují S8 do mRNA v těchto kombinacích: vzájemně se vylučující exony Molekuly mRNA s kombinacemi kombinačních exonů: 1 2 3 4-5-6-7-8 5-6-7-8 4 6-7-8 6-7-8 4-5 7-8 4 7-8 5 7-8 7-8 4-5-6 8 4 6 8 5-6 8 6 8 4-5 5 5-6-7 4-5-6-7 4 6-7 6-7 4-5 7 4 7 5 7 7 4-5 8 4 8 5 8 8 4-5-6 4 6 5-6 4 0 6 9 1011 121314 15 1617 18 hH-M-H-HHH- Celkem se vytvoří 32 molekul mRNA, které se liší v části kódované kombinačními exony. Tyto kombinace jsou však ve vazbě vždy s jedním z dvojice vzájemně se vylučujících exonů. Proto celkově je možných 64 molekul mRNA lišících se v primární struktuře. Každá z nich se překládá do jedné izoformy troponinu T. Troponiny jsou strukturní bílkoviny buněk příčně pruhovaného svalstva, jejich odlišné izoformy jsou u fetálních buněk a v buňkách dospělců 64 Negativní a pozitivní regulace alternativního sestřihu (a) negative control primary transcript splicing mRNA ;sue,2 repressor no splicing mRr Represor se váže na RNA a brání v sestřihu (b) positive control primary transcript no splicing mRNA activator Z5) splicing mRNA Sestřih probíhá jen po vazbě aktivátoru na RNA 65 Samosestřih 1982: T. R. Cech (26S rRNA Tetrahymena, S. Altmann (tRNA E. coli)- 1989 Nobelova cena Autokatalytický proces sestřihu nevyžadující proteiny (in vitro) RNA schopná samosestřih u = ribozym • introny první skupiny v genech přepisovaných do mRNA, tRNA a rRNA (mitochodnrie, chloroplasty, nDNA eukaryot, bakteriofágy) vyžadují externí G, in vivo nutná účast proteinů (maturáza) • introny druhé skupiny v genech mitochondrií hub a v chloroplastech nevyžadují externí G (ale interní A), in vivo nutná účast proteinů, podobnost se sestřihem hnRNA Mechanismus samosestřihu prekurzoru rRNA externí G \ G-OH prekurzor rRNA 51 p exon 1 exon 2 %f Fosfoesterová vazba se přenese ze spojeni exon 1 - intron na G-OH, vazba mezi exonem 1 a intronem se rozštěpí. 0 Fosfoesterová vazba se přenese ze spojení intron-exon 2 na 3'-konec exonu 1, exony 1 a 2 se spojí sestřižená rRNA vyštěpený intron Intron se cirkularizuje přenosem vnitřní fosfoesterová vazby. 67 Průběh samosestřihu u intronů první skupiny linear minus 19 intervening sequence Reakce probíhající pří samosestříhu íntronů I a II Introny skupiny I Introny skupiny II 69 Srovnání samosestřihu intronů skupiny I a II Skupina I Skupina II Bimolekulární sestřih (trans-splicing) mRNA u trypanozom Primární transkript genu 1 Intron Exon Y Intron Exon Z způsob sestřihu Primární transkript genu 2 Exon X Intron Intron Exon Z TransJílicing U prvoků - změny antigenních determinant mRNA Exon X Exon Exon Z Další příklady: nematoda, chloroplasty 71 Twíntron = intron uvnitř jiného intronu • objeveny v chloroplastové DNA eugleny, později u kryptomonád, drosofily aj. • vystřihování probíhá sekvenčně (nejdřív vnitřní pak vnější intron) • v jednom intronu může být více twintronů 72 Původ intronů. „Exon theory of genes4' Short genes i i i i í Q Multisubunit protein Early genome Multidomain, single subunit protein Introns Single discontinuous gene 73 Biologický význam intronů 1. Regulace genové exprese (přítomnost dlouhých intronů zpomaluje transkripci a snižuje množství výsledného transkriptu). 2. Pozůstatek evoluce (různé exony v genu kódují různé funkční domény produktu - geny vznikaly fúzí exonů). 3. Zvýšení rychlosti rekombinace kódujících úseků různých genů -zrychlení procesu evoluce (proteiny / domény). 4. Alternativní sestřih: z jednoho genu více produktů. Některé eukaryotické geny neobsahují introny, tj. introny nejsou nezbytné pro normální genovou expresi (klonování cDNA) Editace RNA Editace RNA je jedna z posttranskripčních úprav, která byla zjištěna • V mitochondriích trypanozom, • V mitochondriích Physarum polycephalum • V mitochondriích strunatců, • V mitochondriích vyšších rostlin • U genu pro apolipoprotein u savců 75 Editace RNA u různých organizmů Organizmy Organely Způsob editace Typ RNA Trypanosoma Leischmania Crithidia mitochondrie inzerce U, delece U m RNA Rostliny mitochondrie chloroplasty substituce C za U, U za C substituce C za U m RNA, rRNA Savci jádro substituce C za U, A za G m RNA 76 Substituční způsob editace hnRNA genu pro apolipoprotein The sequence of the apo-B gene is the same in intestine and liver, but the sequence of the mRNA is modified by a base change that creates a termination cod on in intestine. Apolipoprotein B gene has 29 exons in Codon 2153 codes for glutamine C je deaminován na U změna funkce produktu ztrátou C-domény u kratšího proteinu cytidindeamináza Spliced mRNA in liver codes for protein of 4563 residues Uvolňování cholesterolu UAA STOP Intestine mRNA has UAA codon that terminates synthesis at 2153 77 Editace mRNA genu pro apolipoprotein B ve střevě savců dna needitovaná mRNA 5'<= CAA transkripce a vyštěpení intronových sekvencí editování mRNA 5 apolipoprotein dlouhý 4563 aminokyselin 5' střevo deamináza vázající se na RNA editováni RNA: oxidativni deaminacs cytozinu translace COOH I H2N-^^ COOH apolipoprotein dlouhý 2153 aminokyselin 78 Příklady editace (redakčních úprav) mRNA - adice U a delece T (přítomen v DNA) U4U4UQUUUU3UU6UUU^^ UUU AAUUUG UUGAUAAAUACA UUUUAU UUGUUUGUUM UUUUUUUGUUUUSUGUU UUUGGUU i m fjgji UAGGUUUUUUUGUUltíuGU^ U USUáÁÁACCAGUUAUGAGAGUyUGCÁUUSUU^. UUU* UUACAUUftAGUUG6tí<5UUUUUG6UUC Part of the mRNA sequence of T. brucei coxlll shows many uridines that are not coded in the DNA (shown in green) or that are removed from the RNA (shown as T). 79 Editace pre-mRNA genu cytochromu b u Leishmania DNA template strand 3' tttcgcctctcttttcttt t C C G AAATTGAAGTCCAACAAATAATGCTCATATACC Transcription Pre-mRNA 5' AAAGCGGAGAGAAAAGAAA A G G C UUUAACUUCAGGUUGUUUAUUACGAGUAUAUGG 31 Pre-mRNA 5' o VPairing with partially -complementary guide rna cTVif^ uuuaacuucagö^ G C Guide RNA 5' AMGCi ^gaaa a G iii i i i i i i ii 11 i i 11 UUUAAAUAUAAUAGAAAAUUGAAGU(/c^g^ M^1 'AUAq AC(JA o Insertion of uridine monophosphates GagMaag aaauuuauguugucuuuuaacuuca gg^gvivi 3 * Guide RNA 1111111111 it 111111111111 ^VJ UUUAAAUAUAAUAGAAAAUUGAAGU ÜQaq^ AcuA Release of guide RNA from mRNA 'AAUAA(J Edited rrRNA 5 AAAGCGGAGAGAAAAGAAAUUUAUGUUGUCUUUUAACUUCAGGUUGUUUUAUUACGAGUAUAUGG 3' 80 Vysvětlení editace na základě transesterifikačních reakcí Nukleofilní atak fosfodiesterové vazby 3' OH skupinou řídící RNA (guide) editační místo -A p Gr OČ9 ^ U mRNA gRNA první transesterifikace Editace inzerce nuákleotidů do hnRNA u trypanozom řízená gRNA - první transesterifikace hnRNA podléhající editaci (Tato hnRNA se vytvořila transkripcí genu pro ND7). Tato čísla znamenají počet nukleotidů (U), který může být vložen do míst vyznačených šipkami. Jsou to +7 editační místa. 3" - kotva poly(U)-konec ACACUUGUAUAGAU-—3' ********* **** llGUGAACAUUUUUA-5" A gRNA se váže ke kotvě, a tím také k určité hnRNA, v tomto případě k ND7 hnRNA. Prostřednictvím OH-skupiny napadá fosfodiesterovou vazbu mezi G a A a vkládá tam 7 koncových U. Nukleotidy uvedené v rámečcích se postupně navážou komplementárně směrem k 3'-konci hnRNA, Čísla znamenají jejich počty, které odpovídají číslům uvedeným nahoře. Hvězdičkami jsou vyjádřeny vodíkové vazby. Proč probíhá editace? - Editace RNA byla běžná u prapůvodních buněk, u nichž byla řada reakcí katalyzována molekulami RNA a ne proteiny - Primitivní mechanismus regulace genové exprese 83 Transkripce dvou genů pro rRNA u prokaryot pozorovaná EM _► DNA s navázanými směr transkripce molekulami RNA-polymerázy 84 Cis-splicing V U1 J ^U2^ exon b intron