11 Regulace (kontrola) genové exprese Mechanismy, zajišťující expresi genů ve správnou dobu a na správném místě (časoprostorová regulace). Odpovědi na signály z prostředí nebo signály z jiných buněk, tkání a orgánů 22 Roviny kontroly genové exprese 1. Kde a jak často je daný gen transkribován (transkripční kontrola) 2. Jak je primární transkript sestřižen (kontrola posttranskripční – sestřihová) 3. Výběr RNA, které budou transportovány z jádra do cytoplazmy (kontrola transportu RNA) 4. Výběr mRNA, které budou překládány na ribozomech (translační kontrola) 5. Selektivní destabilizace určitých mRNA v cytoplazmě (degradace mRNA) 6. Selektivní aktivace, inaktivace a kompartmentizace specifických proteinů poté, co byly nasyntetizovány (kontrola proteinové aktivity – posttranslační kontrola, transport) 33 Úrovně kontroly exprese genů u eukaryot 44 Regulace je zprostředkována interakcemi regulačních proteinů s regulačními sekvencemi na DNA Regulace genové exprese na úrovni transkripce Regulační oblasti na DNA Regulační protein Molekulární efektor Strukturní gen mRNA (na DNA-vázající se protein) 55 Vazba regulačního proteinu na DNA Interakce proteinu s DNA probíhá prostřednictvím 10-20 kontaktů mezi různými aminokyselinami a funkčními skupinami bází vnější mez cukr-fosfátové kostry na vnější straně dvojšroubovice 66 DNA-vazebné motivy proteinů (DBD domény) Homeodoména - tři spojené α-šroubovice Zinkový prst α-šroubovice + β-struktura Leucinový zip dvě α-šroubovice Vazba proteinu do velkého žlábku DNA Zn 77 Motivy regulačních proteinů Helix-otáčka-helix (HTH) Helix-smyčka-helix (HLH) 88 Proteiny s motivem zinkových prstů antiparalelní β-struktura His Cys α-helix vazba na DNA trojrozměrná struktura vazba proteinu na DNA 99 DNA Vazebný motiv HTH regulačního proteinu Signální molekula Regulační protein Vazba aktivovaného regulačního proteinu na DNA 1010 Vazba regulačního proteinu na DNA Struktura dimerního proteinu s motivy HTH Ohyb DNA způsobený vazbou proteinu 1111 Vazba regulačních proteinů na obrácená opakování (repetice) na DNA Regulační oblast DNA obsahující obrácená opakování Po vazbě signální molekuly se regulační protein váže na regulační oblast Vytvoření DNAsmyčky mezi dvěma podjednotkami operátoru Vazba dimeru represoru laktózového operonu na palindromatickou sekvenci operátorové podjednotky O1 Příklad vazby regulačního proteinu na regulační oblast DNA RNA-polymeráza 1313 Vazba represoru LacI na sekvence operátorů lac operonu Represor ve formě tetrameru se váže k operátorům O1 a O3 (nebo O2 a O3), tím navodí ohyb DNA a znepřístupní promotor RNA-polymeráze 1414 Konverze aporepresoru (neaktivního represoru) na represor po vazbě korepresoru (tryptofan) Konformační změna vyvolaná vazbou tryptofanu (korepresoru) umožní vazbu represoru na DNAAktivní forma Neaktivní forma tryptofan 1515 Promotor/operátor Regulace genové exprese na úrovni transkripce u prokaryot mRNA Regulační protein Molekulární efektor Strukturní genP/O 1616 Oblast promotoru a operátoru laktózového operonu aktivační protein represor vazba po směru transkripcevazba proti směru transkripce represor 1717 Klasifikace regulátorů regulátory pozitivní negativní Navozují transkripci Zastavují transkripci regulační proteiny alosterické efektory Vážou se na regulační oblast Vážou se na regulační proteiny pozitivní negativní pozitivní negativní Navozují transkripci Zastavují transkripci Umožňují vazbu regulačního proteinu s regulační oblastí Zabraňují vazbě regulačního proteinu s regulační oblastí 1818 Negativní a pozitivní kontrola transkripce Negativní kontrola Aktivní regulační protein vypíná transkripci Regulační protein = transkripční represor Pozitivní kontrola Aktivní regulační protein zapíná transkripci Regulační protein = aktivátor transkripce aktivní represor váže se na promotor inaktivní represor neváže se na promotor funkční aktivátor váže se na regulační oblast nefunkční aktivátor neváže se na regulační oblast inhibitor induktor induktor korepresor Promotor je funkční po odstranění represoru Promotor je funkční pouze po aktivaci, která umožní zahájit transkripci regulace 1919 Princip pozitivní a negativní regulace transkripce Protein aktivující transkripci Protein zabraňující transkripci Molekulární efektor Molekulární efektor 2020 Příklad regulovatelného operonu Laktozový operon Escherichia coli z y a terminátoroperátori promotor Represor β-galaktozidáza permeáza acetyláza Všechny enzymy jsou indukovatelné laktózou (alolaktózou) lacZ lacY lacAlacI 2121 geny terminátoroperátorpromotor Negativní regulace laktózového operonu v rámci enzymové indukce represor (aktivní)RNA- polymeráza Transkripce neprobíhá, neboť represor je překážkou pro pohyb RNA- polymerázy geny terminátoroperátorpromotor represor induktor (inaktivuje represor) RNA- polymeráza Transkripce probíhá, neboť represor se uvolnil z operátoru a umožnil pohyb RNA-polymerázy přes operátor Netvoří se indukovatelné enzymy Tvoří se indukovatelné enzymy 2222 Negativní regulace operonu (např. tryptofanového) v rámci enzymové represe geny terminátoroperátorpromotor represor korepresor (aktivuje represor k vazbě na operátor) RNA- polymeráza Transkripce neprobíhá, neboť represor je překážkou pro pohyb RNA-polymerázy Zastaví se syntéza korepresoru jako výsledného produktu dané biosyntetické dráhy Koncentrace korepresoru v buňce je vysoká – tryptofanu je dostatek geny terminátoroperátorpromotor represor Koncentrace korepresoru v buňce je tak nízká, že nedochází k jeho vazbě na represor Transkripce probíhá, neboť represor se uvolnil z operátoru a umožnil pohyb RNA-polymerázy přes operátor Obnoví se syntéza korepresoru (tryptofan) (inaktivní) 2323 Pozitivní regulace operonu geny terminátoroperátorpromotor represor induktor (inaktivuje represor) Transkripce neprobíhá, neboť promotor je nepřístupný RNA-polymeráze Netvoří se indukovatelné enzymy, ačkoli induktor je přítomenCAP Za přítomnosti glukózy se netvoří cAMP geny terminátoroperátorpromotor represor induktor (inaktivuje represor) Transkripce probíhá, neboť komplex cAMP.CAP umožnil vstup RNA-polymerázy na promotor Tvoří se indukovatelné enzymy cAMP.CAP Za nepřítomnosti glukózy se tvoří cAMP a vytvoří se komplex cAMP.CAP cAMP 2424 Globální regulátor = regulační protein, který reguluje větší počet genů po aktivaci signálem (např. Crp (n. CAP), cAMP-receptorový protein) Specifický regulátor = reguluje expresi jednoho nebo mála genů (např. laktózový represor) Nedostatek glukózy aktivace Crp Aktivace různých operonů (laktóza, maltóza, fruktóza) REGULON = skupina genů nebo operonů regulovaná stejným regulačním proteinem Klasifikace regulátorů zvýšení hladiny cAMP 2525 Aktivace globálního regulátoru Crp cyklickým AMP Vytvoření aktivního místa pro vazbu na DNA Vazba na DNA Crp = Cyclic AMP Receptor Protein (CAP) 2626 Regulace laktózového operonu Přehled vazebných míst pro regulační proteiny a pro RNA-polymerázu G- L+ G+ L+ G- LG+ L- 2727 Vztahy mezi induktorem, korepresorem, represorem a cAMP.CAP Induktor = negativní alosterický efektor = pozitivní regulátor Korepresor = pozitivní alosterický efektor = negativní regulátor Represor = negativní regulační protein = negativní regulátor CAP = pozitivní regulační protein = pozitivní regulátor cAMP = pozitivní alosterický efektor = pozitivní regulátor 2828 Mutace represoru nebo operátoru navozují změny exprese operonu Aktivita laktózového operonu ovlivněná mutacemi z y a terminátoroperátori promotor Represor β-galaktozidáza permeáza acetyláza Všechny enzymy jsou indukovatelné laktózou (alolaktózou) 2929 Působení regulačního proteinu AraC jako represoru nebo aktivátoru Bez přítomnosti arabinózy se AraC váže na DNA v místech 2 a 3 a brání transkripci operonu araBAD V přítomnosti arabinózy se AraC váže na DNA v místech 1 a 2 a umožní vazbu RNA-polymerázy na promotor 3030 Dvoukomponentní regulační systém Senzor (kináza) Regulátor odpovědi SIGNÁL Změna prostředí: chlad, kyslík, živiny atd. autofosforylace Odpověď (aktivace nebo inaktivace genů) fosforylovaná forma regulátoru se váže na DNA 3131 Fungování dvoukomponentního regulačního systému ArcAB Systém ArcAB rozpoznává anaerobní nebo aerobní podmínky v prostředí buněk 1. Fosforylace senzoru za anaerobních podmínek 2. Přenos fosfátu ze senzoru na regulátor a jeho aktivace 3. Represe asi 20 genů vyžadovaných pro aerobní metabolismus, zapnutí asi 6 genů vyžadovaných pro anaerobní metabolismus vazba na DNA 3232 Dvoukomponentní regulační systémy u E. coli Stimul/funkce Nedostatek kyslíku Osmolarita/obalové proteiny Osmolarita, transport K Nedostatek fosforu Metabolismus dusíku Respirace nitrátů Respirace nitrátů a nitritů 3333 Tryptofanový operon E. coli Ukončení transkripce Pozastavení transkripce Začátek transkripce atenuátor Strukturní geny Kontrolní oblast 3434 Atenuace – umístění atenuátorové sekvence v tryptofanovém operonu oblast vedoucí sekvence OBLASTI SCHOPNÉ SE VZÁJEMNĚ PÁROVAT Polohy sekvencí v atenuátoru 3535 4 2 3 1 Sekundární struktura přepisu (RNA) vedoucí oblasti tryptofanového operonu Kodony pro Trp Vytvoření terminátorové vlásenky párováním sekvencí 3 a 4. Možnosti alternativního párování sekvencí 1, 2, 3 a 4 za vzniku vlásenek Alternativní možnosti párování sekvencí 1, 2. 3 a 4 Sekvence 2 se může párovat se sekvencí 1 nebo 3, sekvence 3 se může párovat se sekvencí 2 nebo 4 Párují se sekvence 2 a 3, terminátorová vlásenka nevzniká 3737 Mechanismus atenuace Kodony pro AA Aminokyselina chybí Aminokyselina je přítomná 3838 Kodony pro tryptofan Průběh atenuace tryptofanového operonu a. Vysoká koncentrace tryptofanu b. Nízká koncentrace tryptofanu 3939 4040 Regulace na úrovni RNA – translační kontrola Kontrola rychlosti degradace mRNA vazbou proteinů Úprava mRNA do translatovatelné podoby Kontrola translace mRNA regulačními proteiny pozitivní nebo negativní působení Regulace translace prostřednictvím antisense RNA RNA interference mikroRNA (miRNA) Regulační protein DNA - - - regulace transkripce Regulační protein RNA - - - regulace translace 4141 Působení regulačních proteinů na stabilitu molekul mRNA (ovlivnění rychlosti degradace mRNA ribonukleázami) Snížení degradace mRNA Zvýšení degradace mRNA Principy ovlivnění stability mRNA po vazbě regulačního proteinu: 1. Protein po vazbě na mRNA přímo ovlivňuje citlivost k ribonukleázám 2. Protein po vazbě na mRNA zesiluje nebo zeslabuje její vazbu na ribozom, což ovlivňuje rychlost její translace a nepřímo poločas její degradace (vazba mRNA na ribozom ji chrání před degradací) Vazba proteinu na mRNA Poločas rozpadu molekul mRNA u E. coli = 2-3 min 4242 Některé molekuly mRNA musí být před translací nejdříve upraveny Původní molekula mRNA („pre-mRNA“) genu adhE (kóduje alkoholdehydrogenázu u E. coli) má sekundární strukturu, v níž jsou RBS a AUG nepřístupny Štěpení mRNA RNázouIII před RBS zpřístupní obě místa, takže jsou na ribozomu rozpoznána U mutant postrádajících RNázuIII není adhE mRNA translatována a buňky nejsou schopny růst anaerobně (fermentovat) RNáza III provádí posttranskripční úpravy tRNA a rRNA 5´UTR, 3´UTR SD 43 Mechanismus působení sekvence riboswitch na mRNA a) Terminace transkripce. Vazba malé molekuly na riboswitch ve vedoucí sekvenci mRNA navodí vytvoření vlásenkové smyčky, která ukončí transkripci. a) Iniciace translace. Vazba malé molekuly na riboswitch navodí vytvoření vlásenkové smyčky, v níž se nachází RBS. Ribozom se nenaváže a translace nezačne. Riboswitch = regulační sekvence na mRNA schopná vázat malé molekuly 4444 Lyzinový riboswitch Lyzin není přítomen, gen lysC je přepisován Lyzin je přítomen, transkripce je ukončena Aptamerová doména Expresní doména 4545 Aktivace translace chloroplastové mRNA – geny fotosyntézy Translační aktivátor – protein cPABP – existuje ve dvou konformacích, z nichž ta, která vzniká po aktivaci světlem, se váže na mRNA, kde mění její strukturu a umožní její vazbu na ribozom TMA SVĚTLO Translační aktivita je nízká Translační aktivita je vysoká Světlo aktivuje mRNA vazebný protein cPABP Smyčka zabraňuje interakci s ribozomem Vazebný protein změnil strukturu mRNA, která se může vázat na ribozom 4646 Regulace syntézy ribozomálních proteinů u bakterií (translační úroveň) RBS je dostupné nedostupné RBS Preferenční vazba Při nedostatku rRNA se protein váže na mRNA (autoregulace) ribozom Ribozomální proteiny se netvoří Dostatek molekul rRNA 4747 Regulace transkripční jednotky S10 obsahující 11 genů kódujících ribozomové proteiny u E. coli Za přítomnosti rRNA se k ní všechny proteiny vážou a vytváří ribozom Za nepřítomnosti rRNA se protein L4 váže na mRNA a zabraňuje její translaci protein s regulační funkcí 4848 Regulace translace zprostředkovaná protismyslnou mRNA (antisense RNA) mRNA = sense RNA mRNA komplementárně vázaná antisense RNA se nemůže překládat Vazba bývá ovlivňována regulačními proteiny antisense RNA = Regulační RNA 4949 Zásobárna železa Antisense mRNA reguluje syntézu bakterioferitinu – antisense mRNA je přepisována ze samostatného genu Antisense sense Represorový protein Fur (Ferric Uptake Regulator) při dostatku železa brání transkripci anti-bfr RNA a feritin se tak může tvořit bfr je transkribován stále 5050 RNA interference (RNAi) = mechanismus umlčování genů, které je indukováno přítomností dvouřetězcové RNA (dsRNA) Mechanismy podobné RNAi umlčují transkripci cílových genů změnou struktury chromatinu a navozením metylace DNA je sekvenčně specifická, dochází k degradaci jak dsRNA tak ssRNA (především mRNA), které jsou homologické s dsRNA, která odpověď vyvolala mechanismus patrně vznikl jako obrana proti virům (ssRNA a dsRNA virům) a transpozonům – v průběhu pomnožování virů vznikají replikativní intermediáty (dsRNA), které jsou signálem pro antivirovou odpověď buňky RNAi je vyvolána plně komplementární dsRNA o délce alespoň 21-23 bp, delší dsRNA jsou nejdříve štěpeny na fragmenty o délce 21-28 bp nukleázou „Dicer“ – tyto fragmenty RNA se označují jako siRNA (short interfering RNA, silencing RNA) a jsou vázány proteiny komplexu RISC (RNA-induced silencing complex) RISC komplex rozmotá a separuje řetězce siRNA, následně se páruje s cílovou RNA a degraduje ssRNA (mRNA), jejichž sekvence je stejná jako u siRNA. nukleázová aktivita RISC komplexu (označovaná jako „Slicer“) - degraduje cílovou RNA. 5151 Průběh RNA interference 5252 Mechanismus RNA interference RISC se váže na cílovou RNA a štěpí ji Slicer = nukleázová aktivita RISC komplexu Rozpoznání dsRNA specifickými proteiny Dicer rozštěpí dsRNA na siRNA o délce 21- 23 bp s jedno- až dvoubázovými přesahy na siRNA se váže další protein, který umožní vazbu a aktivaci RISC komplexu RISC komplex odděluje řetězce siRNA siRNA = short interfering RNA RISC = RNA-induced silencing complex 5353 Amplifikace RNA interference a její šíření RdRP = RNA-dependentní RNA-polymeráza Slicer štěpí cílovou mRNA CAP polyA Vznik abnormálních RNA Abnormální RNA slouží jako templát pro RdRP, která pak vytváří mnoho molekul dsRNA, které jsou pak konvertovány dicerem na velký počet molekul siRNA siRNA Vazba RISC-k. Štěpení dalších RNA Přenos z mateřské buňky do dceřiné 54 RNA interference řízená molekulami siRNA RITS = RNA-induced transcriptional silencing) Komplex se váže na právě syntetizovanou komplementární mRNA a přitahuje proteiny, které kovalentně modifikují histony a mohou navodit vytvoření heterochromatinu, který brání iniciaci další transkripce 55 RNA interference u eukaryot Štěpení cílové RNA Potlačení translace, případně destrukce cílové RNA Vytvoření heterochromatinu v úseku DNA, který je přepisován do cílové RNA 56 Experimentální navození RNA interference (vytvoření dsRNA) Vytvoření sense/antisense vlásenky Použití konstruktu se dvěma promotory dsRNA navodí RNA interferenci 5757 Dva postupy pro vyvolání RNAi pomocí dsRNA Reverzní genetika: -Antisense RNA -- inzerční inaktivace genů -RNAi 5858 • microRNA (miRNA) – krátké jednořetězcové molekuly RNA o délce 21-23 nt, které regulují expresi genů blokováním translace mRNA (příp. indukují její degradací podobně jako u siRNA)) – vážou se především na 3´-nepřekládanou oblast (u rostlin na kódující oblasti mRNA nebo 5´nepřekládané oblasti) • Jsou vytvářeny geny mir, které jsou transkribovány, ale nepřekládají se. Geny bývají v intronech nebo exonech nebo polycistronických jednotkách, z nichž jsou upravovány jednotlivé miRNA. Byla zjištěna u červů, hmyzu, savců a rostlin, objevena poprvé u Caenorhabditis elegans v r. 1990 (small temporal RNA, stRNA), kde řídila časovou posloupnost vývoje během přeměny larvy v imago. • Řada miRNA se účastní regulace vývoje, cílem působení jsou mRNA kódující transkripční faktory regulující expresi dalších genů, některé miRNA mají vztah k buněčnému dělení a rakovině. U člověka až 1000 genů. microRNA (miRNA) 5959 Micro RNA (miRNA) Separace řetězců a vznik miRISC Prekurzor miRNA (pri-miRNA, ~ 70 nt) vytvořený transkripcí chromozomových genů v jádře (možný přepis obou řetězců) Vytvoření neúplné vlásenky se smyčkou Štěpení vlásenky dicerem (v cytoplazmě) Vazba specifického proteinu Jeden z řetězců miRNA se váže na cílovou (komplementární – i jen částečně) mRNA a tím blokuje její translaci nebo navodí její rozklad pri-miRNA : pre-miRNA nukleáza Drosha + protein Pasha váže dsRNA („microprocessor complex“) cap polyA Argonaute protein – součást RISC - RNáza degradující druhý řetězec Guide strand Anti-guide strand 6060 Průběh vzniku a působení miRNA - animace Může obsahovat více prekurzorů miRNA Pre-miRNA (asi 16%) mohou být upravovány editací RNA (A Inosin) Dicer- endonukleáza RNAIII miRISC = RISC komplex s navázanou miRNA) 61 Lidský protein Argonaut nesoucí miRNA Nukleotidy vyhledávající cílovou RNA Aktivní místo se dvěma atomy Mg2+ vyžadovanými ke štěpení 6262 Úloha miRNA v medicíně V lidském genomu je zhruba 1 000 genů pro miRNA, které ovlivňují až 60% genů - Jedna miRNA se může vázat na stovky sekvencí v mRNA, - Určitá mRNA může být regulována mnoha různými miRNA - V různých buněčných typech a tkáních jsou různé sady miRNA Poruchy ve fungování miRNA vedou k vážným chorobám - rakovina (možnosti diagnostiky různých forem) – diagnostika a prognostika (např. kolorektální karcinom) na základě profilování miRNA (miRNA jako biomarkery) - kardiovaskulární a nervové choroby - miRNA jsou testovány jako léky (vztah k různým chorobám: alkoholismus, obezita, diabetes aj). 6363 RNA interference – možné zdroje siRNA 64 piRNA - piwi-interacting RNAs (piRNAs) piRNA se tvoří specificky v zárodečných buňkách, kde blokují pohyb transpozonů. Geny kódující piRNA jsou fragmenty transponovatelných elementů. Molekuly piRNA jsou o něco delší než miRNA nebo siRNA a vytvářejí komplexy s PIWI proteiny, nikoliv Argonautovými proteiny. Vyhledávají cílové RNA na základě komplementarity bází (zejména RNA vytvářené transkripcí sekvencí transpozonů). V genomech mnoha savců včetně člověka je více než milion druhů piRNA, jsou exprimovány v testes, ale jen malá část z nich je cílena na transpozony. Jsou pozůstatkem prastarých vetřelců (virů, transpozonů)? Jak jsou schopny rozlišit mezi vlastní a cizí RNA? Jsou namířeny proti jakékoliv cizí DNA? 65 Vytváření a působení molekul piRNA Sada genů piRNA 66 Imunita bakterií a archeí vůči fágové infekci zprostředkovaná CRISPRy 6767 Charakteristika genomu a proteomu eukaryot Počet genů u savců = 20 000 – 25 000 Všechny buňky mají stejnou genetickou výbavu 200-250 typů buněk, obsahujících 20 000 různých proteinů, z nichž okolo 6 000 je tkáňově specifických 2 000 běžných proteinů vyskytujících se ve všech buňkách (produkty asi 3000- 6000 provozních genů) jednotlivé buněčné typy vytvářejí okolo 100 pro něj charakteristických bílkovin, které se nenacházejí v jiných buněčných typech Diferenciace = výsledek zapínání a vypínání různých genů 6868 Kombinace regulačních proteinů při diferenciaci buněk 3 regulační proteiny 8 buněčných typů 6969 1. Bazální transkripce - za účasti bazálních TF, minimální úroveň transkripce 2. Konstitutivní transkripce - za účasti bazálních a konstitutivních TF, umožňujících odlišnou rychlost transkripce různých genů Obecné TF = bazální + konstitutivní provozní geny 3. Indukovaná transkripce - transkripce regulovaná indukovatelnými specifickými TF, jejichž aktivita je ovlivněna podněty z vnějšího prostředí. Specifické TF = buněčně a časově specifické regulační proteiny Transkripční aktivita eukaryotické buňky 7070 Podmínky pro zahájení transkripce u eukaryot Uvedení RNA-polymerázy do aktivního stavu vazba TF na promotor (za účasti aktivátorů a koaktivátorů, nezbytných pro vytvoření přediniciačního komplexu) vazba specifických (indukovatelných) TF na zesilovače transkripce (více TF na více RE) vzájemná interakce TF umožňující interakci promotoru a zesilovače transkripce aktivní stav RNA polymerázy 7171 Složky eukaryotického promotoru pro RNA-polymerázu II TBP - TATA binding protein TFIID 7272 Trojrozměrná struktura TBP navázaného na TATA-box 7373 Iniciační fáze transkripce u eukaryot - navázání RNA-polymerázy na promotor RNA-polymeráza je schopná zahájit syntézu RNA +TBP (TATA vazebný protein) 7474 Zahájení transkripce RNA-polymerázou Fosforylace C-konce (CTD – C terminální domény) RNApolymerázy transkripčním faktorem TFIIH Uvolnění všech TFII vyjma TFIIH, zahájení transkripce Vytvoření iniciačního komplexu obsahujícího přes 20 polypeptidů 7575 Nastává ohyb DNA Vznik transkripčního iniciačního komplexu Fosforylace polymerázy, její uvolnění z komplexu a zahájení transkripce Iniciace transkripce RNA-polymerázou II TBP 7676 E P Vlastnosti zesilovače transkripce E P E E P Sekvenční motivy (RE), na něž se vážou regulační proteiny (transkripční faktory) E Lokalizace v různých pozicích vůči genu, i na velké vzdálenosti Nezávislost na orientaci Přítomnost repeticí 7777 Struktura zesilovače transkripce viru SV40 Využití zesilovačů v expresních vektorech sekvence zesilovače – vazba TF 7878 Působení zesilovačů transkripce na velké vzdálenosti Na zesilovač se navážou transkripční faktory, dojde k ohybu DNA a kontaktu transkripčních faktorů s transkripčním aparátem 7979 Vzájemné interakce transkripčních faktorů Aktivační doména DNA-vazebná doména Hybridní proteiny: aktivační doména + DNA-vazebná doména 8080 1. Zajišťují odpověď na podněty signalizující nezbytnost zapnutí jednoho nebo několika genů 2. Na rozdíl od většiny proteinů jsou schopné vstoupit do jádra 3. Rozpoznávají specifické sekvence na DNA a vážou se na ně 4. Vytvářejí kontakt s transkripčním aparátem, buď přímo nebo zprostředkovaně Základní rysy specifických transkripčních faktorů 8181 Schéma navození fyzikálního kontaktu promotoru se zesilovačem transkripce A1 A2 B DNA DNA zesilovačpromotor transkripční faktor transkripční faktor faktor indukující ohyb v DNA transkripce 8282 Vazebná místa transkripčních faktorů a jejich interakce promotor zesilovač transkripční faktor rozpoznávající (vazebné) místo pro jiný transkripční faktor rozpoznávající (vazebné) místo pro promotor rozpoznávající (vazebné) místo pro RE 8383 mění konformaci TFIID vázaného na promotor nebo Schéma přímé a nepřímé interakce aktivátoru transkripce s RNA-polymerázou II Přímá interakce aktivátoru transkripce s RNA-polymerázou II. aktivátor A TFIID TATA RNA- polymeráza II aktiační doména transkripce DNA Aktivátor zvyšuje stabilitu aktivačního komplexu Interakce aktivátoru transkripce s TFIID, který pak reaguje s RNA-polymerázou II. A TFIID TATA RNA- polymeráza II transkripce DNA 8484 Specifický TF Model aktivace genů na dálku Promotorová oblast 8585 Jeden z regulačních proteinů má rozhodující vliv na zapnutí genu nebo jeho vypnutí (např. receptor pro hormon) Interakce TF a vliv jejich kombinace na zahájení transkripce Silencer – váže inhibující faktory 8686 Působení aktivačních proteinů a mediátorového komplexu Mediátor = proteinový komplex (~20 podjednotek) lokalizovaný na povrchu RNA polymerázy, kde zprostředkuje kontakt s regulačními proteiny (TF – aktivátory, represory) – tj. kombinuje signály Transkripce neprobíhá Transkripce probíhá 8787 Způsoby aktivace transkripčních faktorů fosforylace TF specifickými proteinkinázami vazba ligandu (signálu, např. hormonu) odstranění inhibitoru vazba TF na DNA, interakce TF s dalším TF indukce transkripce Specifická aktivace genů aktivace specifického TF v buňkách určité tkáně po působení signálu indukce tvorby specifického TF v určité tkáni po aktivaci jeho genu působením signálu 8888 Aktivní stav Enzymová katalýza fosforylace a defosforylace Neaktivní stav protein protein proteinkinázafosfoproteinfosfatáza ATP ADP OH HO OP Pan 8989 Způsoby aktivace transkripčních faktorů navozené indukčním agens 1, 2) 9090 Způsoby aktivace transkripčních faktorů navozené indukčním agens (3, 4) 9191 Modifikace lyzinu nebo serinu N-terminálních úseků histonů P = fosforylace Ac = acetylace Me = metylace acetylace vede k rozvolnění komplexu DNA-histon S = serin K = lyzin 9292 Histony těsně vázané prostřednictvím svých N-konců Rozvolnění nukleozomů po acetylaci konce histonu H4 Acetylace konců histonů vede k rozvolnění nukleozomů = remodelace chromatinu Agregovaná forma Disagregovaná forma nukleozomů Heterochromatin Euchromatin 9393 Enzymy podílející se na acetylaci a deacetylaci histonů HAT = histone acetyl transferases = navozují acetylaci HDAC = histon deacetylases = navozují deacetylaci HAT působí jako koaktivátor transkripce korepresor navozující deacetylaci Koaktivátory a korepresory se na DNA nevážou přímo, ale prostřednictvím transkripčních faktorů vázaných na DNA 9494 Působení komplexů remodelujících chromatin: dva způsoby remodelování nukleozómů 1. Posunování („sliding“) nukleozomů - nukleozomy jsou posunuty, promotory se zpřístupní 2-6 proteinů 2. „Remodeling“ - nukleozomy jsou posunuty (dva se spojují), DNA je zpřístupněna transkripci 8-12 proteinů Navázání komplexu na TF na DNA 9595 Přechod aktivního chromatinu na neaktivní HMT = histonmetyltransferázy 96 Lokální změny ve struktuře chromatinu navozené eukaryotickými transkripčními aktivátory 9797 1. TF se váže na DNA 2. Na TF se váže histon-acetyltransferáza (HAT) 3. HAT acetyluje histony v blízkosti místa svého navázání a dochází k rozvolnění nukleozomové struktury 4. Komplexy remodelující chromatin posunují nebo remodelují nukleozomy a zpřístupňují sekvence DNA 5. Na DNA se vážou další TF 6. Na DNA se váže RNA-polymeráza 7. K iniciaci transkripce je nutný pozitivní signál: specifické TF vázající se na mediátorový komplex na promotoru Sled událostí vedoucích k aktivaci eukaryotického genu 9898 Regulace genové exprese peptidovými hormony 9999 100100 101101 ORF nedostatek Fe, IRP se váže dostatek Fe, IRP se neváže Vazba regulačního proteinu IRP na IRE, zabránění vazby malé ribozomové podjednotky na 5´konec mRNA a tím zabránění iniciace translace IRE je neobsazena IRP, 5´konec mRNA je přístupný, iniciace translace probíhá a tvoří se feritin IRP = iron regulatory protein – monitoruje koncentraci Fe IRE = iron-responsive element Regulace translace feritinové mRNA prostřednictvím IRE (u živočichů) Fe Změna konformace IRP5´netranslatovaná oblast mRNA 102102 Ovlivnění rychlosti degradace mRNA regulačními proteiny Regulační systém CsrAB u E. coli (carbohydrate storage regulator) Nekódující molekula RNA (CsrB), na niž se vážou regulační proteiny (CsrA) – „dok“ („zásobárna“) Vazba CsrA urychluje rozklad glg mRNA, a tím brání její translaci (buď glg mRNA zpřístupní ribonukleázám, nebo zabrání její vazbě na ribozom, což má stejný efekt) Obsahuje geny pro syntézu glykogenu monitorování rovnováhy mezi hromaděním glykogenu a glykolýzou 103103 104104 105105 106106 107107