1 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně 2 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Na principu luminofory zesíleného chemiluminiscenčního stanovení reaktivních kyslíkových metabolitů (RKM) je založeno měření oxidativního vzplanutí fagocytů a antioxidační kapacity biologických tekutin. Další skupinu tvoří metody založené na reakci ATP s luciferinem katalyzované luciferázou. Mikroorganismy produkující světlo jako součást svého základního metabolismu jsou využívány v toxikologii. 3 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Aplikace CL metod  Hematologická a imunologická vyšetření – Fagocytóza (oxidativní vzplanutí, chemotaxe, exprese povrchových receptorů, opsonizace) – Antioxidační aktivita tělních tekutin – Blastická transformace lymfocytù – Imunodiagnostika - použití luminiscenčně značených protilátek  Hygienický monitoring (mikrobiologická kontaminace)  Toxikologické testy  Molekulární biologie (reporterové geny) 4 Luminometrické metody založené na stanovení RKM Luminofory jsou oxidovány RMK. Při návratu do základního energetického stavu emitují fotony. Jejich detekce je možná pomocí luminometrů nebo scintilačních spektrofotometrů. Nejčastěji používané luminofory: ● Luminol ● Lucigenin ● Izoluminol ● Pholasin Luminometrické aplikace v biologii a medicíně 5 6 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Luminometrické metody založené na stanovení RKM Princip metody luminol + oxidant   - aminoftalát + N2 + světlo (425 nm) Využití metody  studium fagocytózy  měření antioxidačních vlastností (tělních) tekutin 7 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Studium fagocytózy pomocí chemiluminiscence Chemiluminiscenční analýza je senzitivní technika, která měří produkci volných kyslíkových radikálů v malých objemech krve (mikrolitry). Použití různých luminoforů umožňuje odlišit jednotlivé radikály, jejich intracelulární a extracelulární tvorbu. Použitím různých aktivátorů a inhibitorů lze sledovat defekty procesu opsonizace a chemotaxe, funkčnost NADPH oxidázy a ostatních enzymů spojených s oxidativním vzplanutím, expresi a funkčnost různých buněčných receptorů. 8 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně 9 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Studium fagocytózy pomocí chemiluminiscence Materiál  plná krev  plasma obohacená o leukocyty (tzv. buffy coat)  izolované PMNL Indikace  imunologie (chronická granulomatóza, nedostatečnost komplementu, defekty chemotaxe)  hematologie a biochemie (neutropenie, aktivita myeloperoxidázy)  fyziologie (poruchy opsonizace)  mikrobiologie (vliv bakteriálních peptidů, buněčných stěn, endotoxinu)  farmakologie a toxikologie (účinek léčiv a toxickýxh látek) 10 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně NADPH oxidáza NADP+ (O2 -, H2O2, OH) O2 -  O2 NADPH + H+ luminol + oxidant -aminoftalát + N2 + světlo (425 nm) 11 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Rozlišení mezi RMK a RMD ● antioxidanty ● NO donory (sodium nitropruside, SIN-1) ● analogy L-argininu (L-NMMA, L-NAME, L-NNA) 12 Intra- a extracelulární tvorba RMKD ● SOD, kataláza, křenová peroxidáza, azid sodný ● luminol vs. isoluminol Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Luminometrické aplikace v biologii a medicíně 14 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně 15 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně plazmatická membrána cytosol luminol isoluminol 16 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně NH2 NH NH O O NH NH O O NH2 SOD/CAT 17 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně 18 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Systémy generující RMKD  xanthin/xanthin oxidáza O2 -•  peroxid vodíku + ionty přech.kovů •OH  peroxid vodíku H2O2  ABAP ROO•  SIN-1 ONOO buněčné systémy (fagocyty) 19 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Měření antioxidační kapacity biologických tekutin Reaktivní kyslíkové metabolity jsou tvořeny při tepelném rozkladu vybraných sloučenin. Po přidání vzorku obsahujícího antioxidanty CL signál vymizí, přičemž doba vymizení CL signálu je přímo úměrná antioxidační aktivitě vzorku. 20 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Metoda TRAP  Total (peroxyl) Radical-trapping Antioxidative Parameter  stanovení celkové antioxidační kapacity ve vodě rozpustných antioxidantů  referenční vzorek: trolox 21 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně  2,2‘-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride  2,2‘-azobis(2-methylpropionamide) dihydrochloride  2,2‘-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile) 22 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Měření antioxidační kapacity biologických tekutin Materiál  plasma  sérum  sliny  semenná tekutina Indikace  riziko oxidativního poškození tkání  riziko odvržení štěpu po transplantaci 23 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně 50% peak CL Čas Přidání vzorku 24 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Luminometrické metody založené na měření ATP Princip metody: luciferáza ATP + luciferin + O2  oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + světlo (562 nm) Touto metodou se stanovuje buď přímo množství ATP ve zkoumaném vzorku nebo aktivita enzymů nebo substrátů, které jsou spřaženy s tvorbou nebo spotřebou ATP (např. stanovení β-podjednotky kreatin kinázy používané v diagnostice akutního infarktu myokardu) 25 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Luminometrické metody založené na měření ATP Využití metody:  stanovení buněčné proliferace a cytotoxicity (např. sledování sensitivity bakterií k antibiotikům, sledování cytotoxicity protinádorových léčiv apod.)  monitorování hygieny pracovního prostředí (např. potravinářství)  měření biomasy mikroorganismů ve vodných roztocích a fermentorech  měření ATP v bakteriálních, rostlinných a živočišných buňkách  reporter gene assay (např. luciferáza) 26 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Monitorování hygieny pracovního prostředí a účinnosti čistících postupů pomocí bioluminiscence ATP Výhody oproti konvenčním mikrobiologickým postupům: rychlost a jednoduchost, vysoká sensitivita a přesnost, stanovení celkové biologické kontaminace (ta může pocházet z reziduí výrobků, z kontaktu s lidskou pokožkou nebo z mikroorganismů). 27 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Monitorování hygieny pracovního prostředí a účinnosti čistících postupů pomocí bioluminiscence ATP Materiál  stěr ze zkoumané plochy Indikace  mikrobiální znečištění pracovního prostředí 28 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Monitorování hygieny pracovního prostředí a účinnosti čistících postupů pomocí bioluminiscence ATP 29 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Měření biomasy mikroorganismů ve vodných roztocích Pomocí CL metody za využití luciferázy se stanovuje ATP, které je obsažené ve všech živých buňkách. Materiál  vodné roztoky Indikace  mikrobiální znečištění pitných a užitkových vod  mikrobiální znečištění potravinářských výrobků 30 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Měření biomasy mikroorganismů ve vodných roztocích 31 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Stanovení blastické transformace lymfocytů a buněčné proliferace Stanovení na základě měření obsahu ATP ve vzorku. Rychlá a sensitivní alternativa k metodám využívajícím radioktivně značené prekursory tvorby DNA (např. 3H-tymidin). Materiál extrakty lymfocytárních kultur Indikace poruchy specifické buněčné imunity 32 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Reporter gene assay Tato metoda představuje vysoce účinný nástroj v molekulární biologii. Její princip spočívá ve využití kódující sekvence luciferázy jako reporterového genu pro monitorování aktivity promotorů v kontrole genové exprese. Konstrukt DNA obsahující kódovací oblast pro luciferázu kombinovanou se sekvencí s testovanou schopností genové regulace se vnese do studovaných buněk. Po inkubaci se měří výsledek exprese daného reporterového genu jako ukazatel účinnosti testovaného promotoru. 33 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Reporter gene assay 34 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Reporter gene assay Materiál  buněčné extrakty Indikace  účinnost promotorů v genové regulaci 35 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Luminiscenční metody založené na přirozené bioluminiscenci organismů Stanovení toxicity Materiál sladké vody (povrchové i podzemní) slané a brakické vody vodovodní vody odpadní vody vodné roztoky a výluhy Indikace monitorování environmentálních toxinů 36 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně 37 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně 38 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně 39 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně 40 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně Imunodiagnostika Využití chemiluminiscenčních značek (např. acridinium ester), schopných spontánně se vázat na bílkoviny, k přípravě CL značených protilátek.