Bezobratlí v neuroetologii Bezobratlí v neuroetologii A) Bezobratlí jako model neuroetologických experimentů B) Podmiňování jako klíč k funkcím NS a smyslů c) Magneto recepce hmyzu Neuroetologie (behaviorální neurobiologie): • Syntéza etologie a neurobiologie (60.1) • Neurální podstata chování • Nástroj řešení otázek neurofyziologie A) Bezobratlí v neuroetologii Jednoduchý, snadno přístupný nervový systém • Larva 10 tis neuronů * „Robustní" behaviorální projev Laboratorní podmínky \ Snadný, levný a rychlý chov Mutantní linie \ Bezobratlí v neuroetologii Jednoduchý, snadno přístupný nervový systém „Robustní" behaviorální projev -Laboratorní podmínky • k Snadný, levný a rychlý chov \^"^Y^^ Mutantní linie Mimořádný význam Bezobratlí v neuroetologii • Sensomotorické reflexy Bezobratlí v neuroetologii • Sensomotorické reflexy Bezobratlí v neuroetologii: Sensomotorické reflexy Motorické sekvence Depressor muscle Levator muscle IV i ng- h i nge prop rioceptor Depression proprioceptors —W«- 4- -Wh- Clione limacina (valovka plžovitá) „Sea angel" Bezobratlí v neuroetologii: • Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence • Orientace Training conditions 1 1 Testing conditions 1 Pine cones a nest in 1 1 Pine^^ApPwA^sand 1 1 moved 1 here 1 A nest in \ »>•> N. Tinbergen Nobelova cena 1973 Philanthus triangulum Bezobratlí v neuroetologii: Sensomotorické reflexy Motorické sekvence Orientace Komunikace Bezobratlí v neuroetologii: Sensomotorické reflexy Motorické sekvence Orientace--r=— Komunikace • ' | , IZ^J' Učení a paměť jJ-r^^T ^Bm& ......',> o > ^ > Bezobratlí v neuroetologii: Sensomotorické reflexy Motorické sekvence Orientace Komunikace Učení a paměť Circadiánní rýmy Bezobratlí v neuroetologii Sensomotorické reflexy Motorické sekvence Orientace - Komunikace Učení a paměť Circadiánní rýmy Smyslové schopnosti Bezobratlí v neuroetologii: • Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence • Orientace • Komunikace • Učení a paměť • Circadiánní rýmy • Smyslové schopnosti Bezobratlí v neuroetologii: Bezobratlí v neuroetologii: Bezobratlí v neuroetologii: Bezobratlí v neuroetologii Sensomotorické reflexy Motorické sekvence Orientace Komunikace Učení a paměť Circadiánní rýmy Smyslové schopnosti a dráhy Stárnutí Sexuální orientace Agresivita Působení drog a farmak micropipet injector cylindrical electrode wild type — baseline — cocaine Bezobratlí v neuroetologii: • Sensomotorické reflexy • Motorické sekvence • Orientace • Komunikace • Učení a paměť • Circadiánní rýmy • Smyslové schopnosti • Stárnutí • Sexuální orientace • Agresivita • Působení drog a farmak • Ochota riskovat, emoce atd... Souhrn současných témat řešených behaviorálními přístupy • Paměť a Alzeimerova choroba • Parkinsonismus a jeho léčba • Paměť a stárnutí • Léčba depresí • Účinky drog, závislost/léčba • Autimus a jeho léčba • Strach a jeho podstata/léčba • Výzkum agresivity • Účinky alkoholu a léčba závislosti na něm • Podstata učení - bezobratlí • Podstata učení - obratlovci • Orientace v prostoru • Čichové schopnosti - bezobratlí • Čichové schopnosti - obratlovci • Výzkum citlivost na dotek • Vnímání magnetického pole • Vnímání polarizovaného světla • Vnímání teploty Zrakové schopnosti Pohybové poruchy Léčba bolesti Denní rytmy a jejich poruchy Sociální vztahy a jejich poruchy Testování sedativ a analgetik Hyperkinetická porucha a její léčba Výzkum funkcí mozku a jeho oddílů Repelenty a boj proti přenašečům nemocí Boj proti hospodářským škůdcům Výzkum pozornosti a jejích poruch Welfare hospodářských zvířat Výzkum komunikace zvířat Výzkum sexuální orientace Výzkum ochoty riskovat Zvířata jako biosensory B) Podmiňování ja vivo re n i íněné asticitv NS a zá azem a uceni. (A) Podmiňování jako klíč k funkci NS a smyslů Vytvoření podmíněného spojení je důkazem plasticity NS a základem paměti a učení. Vytvoření podmíněného spojení může být: cílem výzkumu paměti a učení Vytvoření podmíněného spojení může být: cílem výzkumu paměti a učení Vytvoření podmíněného spojení může být: cílem výzkumu paměti a učení I Dotek na sifon... Siphon ...a žábra se stáhnou Habituace u Aplysia Plasticita nervového spojení i na izolovaných gangliích A) Buccal ganglion Cerebral ganglion Pleural ganglion Pedal ganglion Abdominal ganglion Siphon (A) Record/ stimulate — I mite red find stage (B) Cerebral ganglion Pleural ganglion Pedal ganglion fail SN I Tail SN2 Tall MN Siphon MN abdominal ganglion (c) Right connective Muli ir neuron Left connective Movement detector Men ľiiiľiil dctci tor Stimulus 10.8 Experimental preparations for cellular analysis The cellular basis Of gill and siphon withdrawal can be Studied at Several levels ol analysis. (A) In the most intact preparation the abdominal ganglion is externalized, and recordings froxrt neural elements are made during reflex actions (M) In what is known as the semi-intact preparation, the entire central nen OUfl system (CNS) is removed In some cases peripheral organs (SUCh as the gill, siphon, and tail) are left ait.n bed to the CNS by their peripheral nerves, (C) In a third preparation, single ganglia (or pairs pi ganglia) are removed, Recordings are made from identi tied neurons in the neural circuit lot siphon and !',ill Vytvoření podmíněného spojení může být: cílem výzkumu paměti a učení Vytvoření podmíněného spojení muže být: nástrojem výzkumu smyslových schopností Odměna nebo trest při tréninku Vytvoření podmíněného spojení může být: nástrojem výzkumu smyslových schopností Richard Axel Nobelova cena 2004 za objevy podstaty čichu Vytvoření podmíněného spojení může být: nástrojem výzkumu smyslových schopností Richard Axel Nobelova cena 2004 za objevy podstaty čichu Podmiňování jako klíč k funkci NS a smyslů Vytvoření podmíněného spojení může být: • cílem výzkumu paměti a učení Podmiňování jako klíč k funkci NS a smyslů Vytvoření podmíněného spojení může být: • nebo nástrojem výzkumu smyslových schopností C) Magneto recepce - výzva smyslové fyziologii Kompas: Všudypřítomné vod ítko Severo-jižní orientace pasoucích se krav Severo-jižní orientace pasoucích se krav Orientace hmyzu Migrující hmyz monarcha stěhovavý lonterey^ Los . Angeles Monarch's breeding range shown in orange HI Greatest concentration | Wintering areas KILOMETERS IOO0 1 I 1 I I I I 0 STATUTE MILES 600 NATIONAL GEOGRAPHIC ART DIVISION Neznáme: • Mechanismus recepce • Lokalizaci receptoru • Adaptivní význam Magnetit? iontové kanály B = 0 shluky nanokrystalú magnetitu Důkazy pro magnetitový kompas : Nezávislý na světle Rozeznává polaritu pole (S od J) Citlivý na silný magnetický pulz Necitlivý na slabé RF oscilace Modifikace zraku? Photochemický model: GMF vektor moduluje schopnost receptoru vnímat světlo a pole se tak stává viditelné Fotochemický model: Základní teze: Biochemická reakce může být ovlivněna GMF. Nepárové elektrony mají svůj magnetický moment, který interaguje s okolním polem Nepárové elektrony najdeme v radikálových párech. Ty vznikají např. po dopadu fotonu (chlorofyl, fotolyázy) Fotochemický model Fotosensitivní molekulou s kýženými vlastnostmi je nejspíše Kryptochrom Nalezené v rostlinách Příbuzné fotolyázám Řídící vnitřní hodiny Tvořící radikálové páry Schulten, K., & Windemuth, A. (1986). Model for a Physiological Magnetic Compass. In G. Maret, J. Kiepenhauer & N. Boccara (Eds.), Biophysical Effects of Steady Magnetic Fields (pp. 99-105). Berlin, Heidelberg, New York, London, Paris, Tokyo: Springer-Verlag. Fotochemický model: Citlivost Cry k GMP leží ve „hře" s elektrony mezi proteinem a kofaktorem FAD. Osud radikálového páru závisí na vzájemné konfiguraci elektronů D + A \h.v/\y\j( I fotoexcítace D* + A (*D+ + »A-)S (•D+ + WT) přechod mezi singletovým a trípletovým stavem „singletové produkty ,tripletové produkty 0° 90° 180° 270° 360° úhel k magnetickému vektoru Metody výzkumu Blacksburg VA Lund Neuroetologické metody smyslové fyziologie Podmiňování a spontánní reakce Neuroetologické metody smyslové fyziologie Podmiňování: Trénink a test Neuroetologické metody smyslové fyziologie Podmiňování: Trénink a test Trénink: Odměna nebo trest 1 Ugttt Sin ji .■ i- ~~T~ ii i i Trénink Drosophila Světlo jako atraktivní stimul Test Drosophila Test Drosophila Cirkulární diagramy orientace Tenebrio molitor Tribolium castaneum Trénink Problémy: • Je magnetorecepce závislá na světle? • Dokáže kompas rozlišit polaritu pole? Otázky: můžou zvířata magnetické pole vidět? A co přesně vidí? Ve tmě kompas potemníka nefunguje Rozlišení inklinační a polaritní reakce ukazuje na typ recepce d. Inklinační kompas ptáků. Normální orientace (a). Dtočíme-li experimentálně vertikální složku geomagnetického pole (b), má to stejný účinek jako otočení složky horizontální (c). Ptáci (ale také čolci a želvy) Ddvozují tedy polaritu pole ze znaménka sklonu pole (inklinace). (Podle: Wiltschko W., Wiltschko R.: J. Comp. Physiol. A 191, 675-693, 2005) Obrácení inklinace otočí orientaci potemníka - kompas není polaritní Změna barvy světla způsobí posun orientace UV/UV UV/Green Změna barvy světla způsobí posun orientace Kompas potemníka Tenebrio má znaky na světle závislého mechanismu. Nepodmíněná reakce? • Poziční chování Time schedule of the assay: 5min GMF 60°CW rotation Pulses 5min/5min 1 2 3 4 5 6 o Laboratory rig for cockroach magnetosensitivity testing Alignment behavior Alignment behavior Natural field Field rotated 60° CW Magnetic North Magnetic North Fig. 1 B) Body turns in rotating field • Laboratorní testy chování • Aktivity 24 A, ] 0 / Otevřil soubor po uložení Měření pohybů p- Považováno za pohyb Rozdíl úhlů Rozdíl pozic 15 ▼ 20 Tloušťka okraje Citlivost dotyků i— Orientace dat V Nezapočítávat dotyky .Na výšku « Na šířku Results: Results: - — 'S pq 81 7- 6- 5^ 4- 3- 2 I - 60°CW field shifts in Test 11111 ill 11 0 10.00 h A □ Tost □ Conlrol 18 16 ■ 14 ■ 12 ■ 10 8 ■ 6 4 h I 1.30 h 12.15 li 13.00 h 13.45 h 14. B C D E F 0 B P=0.00l 30 h □ ABF □ CDE P=n. Test Control 16 14 12 10 x 6 4 0 □ Test □ Control P=0.03 P=n.s. CDE ABF indidá Kandidát na receptor ? Periplaneta americana Amputace tykadel Rotace pole zvýší neklid - MIR (magnetically induced restlesness) Magnetically induced freezing (MIF) Aversively conditioned temporary immobility. Kindly see poster P21: Magnetically induced freezing in cockroach. Effect of interstimulus interval. Amputace tykadel: • Ztráta sensitivní reakce - receptor je v tykadlech nebo nespecifický vliv stresu • Zachování reakce - receptor není v tykadlech Rotace pole zvýší neklid Periplaneta americana i bez tykadel 3 02 OQ 1 60°QW field shifts in □DDDDDDDD TD □ Projekt kryptochrom Metody reverzní genetiky - i RNA Imunochistochemie Central brain Optic lobe ^^^^ Cryptochromes signaling roles Chaves I, Pokorny R, Byrdin M, Hoang N, Ritz T, Brettel K, Essen L-O, Horst GTJvd, Batschauer A, Ahmad M. 2011. The Cryptochromes: Blue Light Photoreceptors in Plants and Animals. Annu Rev Plant Biol 62:335-364. Cytochromes signaling roles Fogle KJ, Baik LS, Houl JH, Tran TT, Roberts L, Dahm NA, Cao Y, Zhou M, Holmes TC. 2015. CRYPTOCHROME-mediated phototransduction by modulation of the potassium ion channel p-subunit redox sensor. Cryptochromes signaling roles. Timekeeping Rapid changes in membrane potential Cell cycle control Eisele, Lewin, et al. "Combined PER2 and CRY1 expression predicts outcome in chronic lymphocytic leukemia." European journal of haematology 83.4 (2009): 320-327. Cryptochromes signaling roles Timekeeping Rapid changes in membrane potential Cell cycle control Magnetoreception irths Magnetic Field North M*gn«0c Pole* Gaographu NoMh Pole .1 .'South http://bioforces.blogspot.cz/2011/06/human-cryptochrome-exhibits-ligrit.ritml Behavioural and genetic evidences of link: Cryptochrome -magnetoreception 2008, 2010 Gegear et al. Drosophila assay Cry-deficient fruit flies lost ability to recognize the presence of magnetic field. A itypc Wild type Rescued by mammalian cry 2 BhM |M Magnetic field Blue light filtered out Blueifht Rouyer, F. 2008. Mutant flies lack magnetic sense. Nature Vol 454: 949-951. Gegear, R. J., A. Casselman, S. Waddell;, and S. M. Reppert. 2008. Cryptochrome mediates light-dependent magnetosensitivity in drosophila. Nature 454: 1014-1018. Magnetic field impacts clock. 2014 Fedele et al. Drosophila assay Fedele, G., Edwards, M. D., Bhutani, S., Hares, J. M., Murbach, M., Greenl, E. W., et al. (2014). Genetic Analysis of Circadian Responses to Low frequency Electromagnetic Fields in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics, 10(12), e1004804. Yoshii T, Ahmad M, Helfrich-Foerster C. 2009. Cryptochrome Mediates Light-Dependent Magnetosensitivity of Drosophila's Circadian Clock. PLoS BIOLOGY 7(AYmW-r\R1Q Magnetic field impacts geotaxis of fruit flies Negative geotaxis in flies is disrupted by a MF - cryl dependent Swinger mechanism Fedele G, Green EW, Rosato E, Kyriacou CP. 2014. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communication DOI 10.1038/ncomms5391. CS 635 nm cry02 450 nm CS 450 nm Exposed Metody: ■ Spontánní pohybová reakce Periplaneta americana na rotaci pole ■ Nepodmíněná reakce ■ Reverzní genetika - RNA interference Vacha, M. 2006. Laboratory behavioural assay of insect magnetoreception: Magnetosensitivity of Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 209: 3882-3886. Methods: Magnetically Induced Restlessness (MIR) 60° oscillations Period 5 min North 60* rotated Merritt coil 5min 5min r Magnetic pulse Control - no MGF rotation - no MIR reaction 270min CO o o >,2 Test-rotating MGF - MIR reaction "O o GÜ ! sf rf Wilcoxon pair test, N=119, P=n.s. Wilcoxon pair test, N=116, P=u.Üu017 270 min sf_rf 47 body turns actogram ■i.j . ■ i ■■ ■ I mil I ■■ .-imi-i—. ns P=0.808 n=170 ■ ■■■ ijIxMmJ I Jfcl i i ■■■-■J I ■ I Lm _F_i_uL-L 1 - - L — - — - - I -J. rhythmic 90% (n=20) In MIR safe from non-sense dsRNA? B O o 12 , 10 ■ 8 ■ 6 4 2 ■ 0 Jsf daily activity profile j * P=0.014 n=157 rf body turns A 25 20 15 10 5 J O O 0 P=0.001 n=216 300 200 100 0 daily activity profile I— *HJ. ■ ■ ill .J— - - .. llll^l ■ rhythmic 74% (n=27) actogram L D L ..IIJj.lL , i LLl.i-J.il ■ .Jlii, iUji jiiiJMU .dui, iUji ,.L.IUjiIIii1 . . ILjii... In „.j..L1jlII,iJ, i . Hubii... ■ Jjj.....L l , . LjJI 1 . . jj J.i— J... 1 . 1j J 1 Jl ii i jj J.i.....1. 1 . LjJlIl ii . LiLU, I..1I1 i . IiJlIlii . lxLUL.Jj l l-lb,J„,L 1 .UiJhu 1. tUn. 1 iL lljllliuj J ,|J.....LI IllLI j I . .iU...., J.I . _■ 1 iJ l 1 j ■ 1_|_u_ iiIli.i J..ll.l.l jjJu..i .L.liil.l. . j [ill .i.iU.I. , .1,1,1 J iiJlJl.il . JLJI.I i li.lllL.ll. . > .iikiL J ii.IijlIi. . > .IlLil 1 i ■iU.ui. i rhythmic 73% (n=22) U) Z 53 3 a "o o q* Q) q. o> řD Cry2 silenced - no MIR D CM >, O 12 , 10 . 8 \ 6 4 2 J 0 ns P=0.394 n=337 Jsf rf D ■ Ul-ü 1.1. L..i..............h,. . iJJJ llllLihlL. *l i> JiihMI i ■■■ J., mi Jj, t íl, |j,iL-l t -til. I. .1-1. iLll-L.-IJ 11- ■ 111- I L-iLnhJl Lih.- li j-i.jiL.i fci j-■■ " -fc Li j—j.lnh li JÍ l. j—I.i.-.. .11 rhythmic 16.7% (n=30) Cryl silenced and double-treatment D 25 20 15 10 b s en "O 0 E 2" 20 CM >> 15 O + 10 o 5 CO "O 0 L P=0.009 n=212 L ns P=0.480 n=194 300 200 100 0 L D 300 200 100 L llJjnLllLi JilijilLllL.l L.ll..diltl. I. I.,111.I...ill..U ,l.i,.iiiiL I, LiliLi.jiJij.il lilln,J,..I,l.i Ij iijVlltlul LI.ulIJjIIuIjIijIiLjiI Ll.nlililli iLli.iljl.iiJl j [lltJLlL.l.i.l ili.Jil.nJl ],lltilil.i..li.lliJ.iiii.JLNlil iJi.Il.i.i ILi>..jjLiIL I Ilililb.hUliliil I ll Lib.iJjjL.hll lllllllhll iklj.i.l.iLJI i..J-J,.; I ■ ..l.-lIjH . .. ■ Jj-L I II II III II i III I I 11 Li ■J.I.I 111 rhythmic 35% (n=23) ..I....I..IL l.lll .l.J. J.lll ill!,.!.] , j.I i ...... ,.jll....LJ J, .1 ..il..J.. I .1. ..i.-.L_il ,Llm. l.l. ■., k ■..t„iL— I, L Ljyi Ll.i.i., llL - Ji-i^i, Ji..1. .j j j UtLLiiiiJi.nl.,, [)].. .JlJ^.l.i. UlLI.lt i.lm-,. .. jLjjiLLl.JI l.llil.ii.lM......1jj.1L ..1 l ...LLL .,......J...i....i.L....J.HL.uii.. . i-i —l.. ..i l ..jJ,llLlJU....hlLiJjiiL. JjJ_i.lLilill... , JJjLI. i.IIlliIiJI.jj.i iJlL. ...... 1.. Ji ^ .i jJlL--------...L.j.1,1 ..J...J.. .. In, -i- LJ-L L.i . Li ,J..il., „ ii., i_,.^UJ... ..i J. rhythmic 56% (n=23) Where Cry2 is located? r Hemisperical layer of Cry rich cells underneath the retina 3 • A 1 What is spectral dependence of MIR? Quest to colour spectrum. LED spectra 365nm —388nm —408nm 448nm —466nm —505nm —528nm 350 405 459 512 564 MIR is colour dependent. ON [OPS A(nm) 365nm Light intensity (Photons s"1 m"2 ) 1.5x1015 - E to c o O 2.3x10" Vi c 0) 3.4x10'9 - —I-1— 350 365 388 408 448 466 505 528 550 wavelength |(nm) II 6xlOel.3 Sxl0el4 6xl0el5 tSxtOelG .0el4 _0el5 _0el6 .0el3 _0el4 _0el5 .0el6 .0el7 .0el5 _0el6 _0el5 .0el6 .0el4 .0el5 Sxl0el6 n and P n=60, P=0.329 n=43, P=0.001 n=98, P=0.001 n=60, P=0.002 n=115, P=0.113 n=116, P=0.006 n=84, P=0.003 n=58, P=0.218 n=60, P=0.299 n=135. P=0.002 n=8S, P=0.007 n=107, P=0.715 n=89, P=0.118 n=91, P=0.020 n=155, P=0.187 n=72, P=0.010 n=73, P=0.071 -), P=0.2O2 6xl0el7 J 6xl0et8 n=195, P=0.333 [1=145, P=0.571 n=78, P=0.G45 Absorption curves of Cry ON OFF Zhong, D. (2015). Electron Transfer Mechanisms of DNA Repair by Photolyase. Annu. Rev. Phys. Chem. 2015. 66:691-715. MIR is colour dependent Absorption curves of Cry. Zhong, D. (2015). Electron Transfer Mechanisms of DNA Repair by Photolyase. Annu. Rev. Phys. Chem. 2015. 66:691-715. Absorption curves of Cry Zhong, D. (2015). Electron Transfer Mechanisms of DNA Repair by Photolyase. Annu. Rev. Phys. Chem. 2015. 66:691-715. Possible antagonism and FADH* as a signaling state in Blattella ? Summary of results on Periplaneta and Blatella: Directional Earth-strength magnetoreception is dependent on functional Cry2 Spectral curve MIR reflects FADox and FAD redox forms of flavin Magnetoreception is linked to eye Cry2 is likely a true compass receptor signaling thru the photoreduction of FAD and located in the insect eyes Závěr a budoucnost hmyzího výzkumu? • Role uvažovaných mechanismů se během doby vyměnily a hypotéza fotochemického vnímání geomagnetického pole nabývá na síle • Živočichové dost možná pozorují magnetické okolí zrakem Nejen orientace. Magnetické pole ovlivňuje cirkadiální a možná i anuálni rytmy - sezónní diapauzu Závěr a budoucnost hmyzího výzkumu magnetorecepce živočichů? • Hmyz díky molekulárním technikám odpovídá na zásadní otázky o mechanismu • Odpověď na otázku po významu recepce (octomilka, rus) teprve Závěr a budoucnost hmyzího výzkumu? > Třeba ale právě to upozorňuje na to, že směr magnetického poleje pro živé systémy důležitější než kompas v ruce pro člověka fl^B Nejen laboratoř. Arthropoda, Malacostraca Amphipoda Blešivci Antarktidy ftlSSE r FABIENNE NYSSEN Pláž na Lachmanové mysu s osa azimut 50-90 Tomanova K, Vacha M. 2016. Magnetic orientation of Antarctic amphipod Gondogeneia antarctica is cancelled by very weak radiofrequency fields. J Exp Biol. Dosavadní granty: • Ověření magnetorecepce potemníka moučného. G AČ R 2001-2003 • Analýza magnetorecepčního chování laboratorních druhů hmyzu. GAČR 2005-2008 • Neurální podstata magnetorecepce hmyzu. GAČR 2007-2010 • Fyziologická a funkčně genetická analýza magnetorecepce na hmyzím modelu GACR 2013-2015. • Spolupráce Heslo „magnetoreception" na WOS Published Items in Each Year r-^co^O—<^-u"*^©r-^ooo^o-*«*gm^.u"*vo CTi o-Hr\ir^>^-u">kor-».ooCT>o~*rsim^u"*wo Ot O"* CT"1 O O O O O O O O O ■ ■ —' i «-4 —» -—' -—i -—i