V Uvod do studia biologie kmenovych bunek Jiri Pachernik e-mail: iipa(5)sei.muni.cz tel: 532 146 223 Co jsou kmenové buňky?' - buňky schopné vlastní obnovy (sebeobnova) - buňky schopné dávat vznik jiným typům buněk (schopnost diferenciace / rozrůzňování Functional cells Testis {Spermatogenesis, significant spontaneous Bone marrow Large intestine Small intestine (limited pluripotentialitly) Epidermis stem cell 8 10 12 12 3 4 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024 2048 4096 50 33 20 11 6 3 1.6 0.4 0.1 0.02 Cell divisions Amplification Number of stem cells as a % of total proliferative cells Kmenové buňky tvoří jen zlomek buněk dané tkáně/organismu ! Functional Cells Ir long-term short-term repopulting repopulting stem cella stem cella (LTHSC) fST-KSC] mulTipotent commited progenitor progenitor precursors mature cells cells cells (CPC) (MPC) Kmenové buňky v dospělém organismu r Proč nás kmenové buňky tak zajímají? ■w- i* □ „neomezený" zdroj nových buněk pro regeneraci tkání = > nezbytné pro zachování homeostázy = > zajímavé pro transplantace a buněčnou terapii TYT mocné" kmenové buňky -> vznik a relaps nádorových onemocnění poruchy ve schopnosti regenerace, růstu, Co nás na kmenových buňkách zajímá? Jejich původ během ontogeneze, jak vznikají? ectoderm mesoderm endoderm nervous tissue/NSCs skin/skin SCs bone marrow and blood/HSCs and MSCs muscle and bone/tissue SCs lung, liver, and pancreas/organ specific SCs esophagus, stomach, intestine/intestinal SCs primordial germ cells ectoderm mesoderm endoderm nervous tissue skin bone marrow, blood muscle, bone lung, liver, pancreas esophagus, stomach, intestine primordial germ cells multipotent stem cells -E NSCs/skin SCs HSCs/MSCs/tissue SCs organ SCs/intestinal SCs Neuroepithelium —> radial glia (RG) —> astrocyte-like NSC (c) Neonatal Brain (d) Adult Brain Intermediate progenitor (Merkle 2006) Původ hematopoetických/krvetvorných kmenových buněk Co nás na kmenových buňkách zajímá? Jaké vnější a jejich vnitřní faktory regulují jejich existenci. diferenciace p rol if e race ice Vnější faktory zodpovědné za zachování kmenových buněk diferenciace & roliferace Liver lineages FGF BMP Ventral endoderm Foxal Foxa2 Gata4 Gata6 vHnfl Dorsal endoderm RA (Wnt suppressed, Shh suppressed) Hepatoblast , Tbx3 /*" roxi S/OC-1 V J Hex, Proxl Hnf6/OC OC-2 Wnt notch \ Hnf& Hnf4/ \OC-1 Hepatocyte J Cholangiocyte (bile duct cell) Hex Hnf6/OC-1 Ptfla Activin Pancreatic lineages Foxal, Foxa2 Hnf6/OC-1 Hlxb9, Ptfla Ventral Dorsal Pancreatic progenitors ptfla, Rpbjl Pdx1, Ptfla Hes1, Rbpj Sox9, Cpa1 FGF10 Isl1, Ngn3 NeuroD, Insml Endocrine progenitors Hnf6/OC-1 Acinar cell Pancreatic duct Ghrelin Mafa, Pdx1, Hlxb9 Pax4, Pax6, Isl1 Nkx2.2, Nkx6.1 Beta (insulin) Foxa2 Nkx2.2 Pax6, Arx Alpha (glucagon) Pancreatic polypep. Somatostatin 3 Embryonální kmenové buňky (ES - embryonic stem cell) r Epibfast i Vnitřní buněčná masa ;ná j ^^^^^^^^^^^^^^^^ >- Hypoblast Embryonální tkáně Zárodečný ektoderm Zárodečný epiblast Primitivní proužek ^ Alantoícký ektoderm Zárodečný mezoderm Zárodečný entoderm Extraembryonální entoderm Žloutkový vak Extraembryonální tkáně Trofoblast ■V- Cytotrofoblast Syncytiotrofoblast Gilbert 1997 / Bílek 2004 Model pro studium vzniku a zachování somatických kmenových buněk v našich experimentech kultivace indukce progenito iferencované buňky ' ES buňky WJ s geneticky modifikovanými faktory podezřelýmy z regulace fenotypu somatických kmenových buněk četnost vzniklých somatických kmenových buněk jejich vlastnosti (fenotyp a potenciál pro další diferenciaci) Laboratoř Protilátky - Ab = antibody - produkt plasmatických buněk (zralé B-lymfocyty - bílkovina/protein, 4 proteinové řetězce, Z lehké a 2 těžké. - rozpoznání cizorodého materiál - antigénu = > regulace imunitních/obranných reakcí - detekce antigénu ve výzkumu I - antigén -Tatka na kterou je protilátka se L schopná specificky navázat I - imunogen - struktura schopná I vyvolat tvorbu protilátek^ř^ ^-1 )noklon< - monoklonální x polyklonální = > dle původu (jeden nebo více klonu produkujících buněk) - primární x sekundární x terciální = > dle použití Úloha protilátek v organismu Kde protilátky vznikají? Si Jsou produkovány plasmatickými B-lymfocyty! Pluripotent H em atopoi ehe Stem Cell Hematopoiesis from Pluripotent Stem Cell [CD4+CD25*FOXP3J- www.eBioscience.com © 2012 eBiosdence Monoklonalni protilátky - původem z jediného klonu!!! Schematický princip imunodetekce 1 Western btot Blotting tank Proteins transferred to nitrocellulose sheet (blot) Detection in Western Blots Detection Signal (colori metric or cherniluminescent) Enzyme Substrate Target Protein Membrane Containing Transferred Protein Diagram 2: itfustration of detection in Western Biots. r Účinek séra na RA indukovanou neurální diferenciaci Af initní chromatograf ie + imunoprecipitace - purif ikace a separace látek - hledání partneru v komplexech molekul - studium struktury molekul ^ * a komplexu molekul 9Mb ELISA techniky,