logo-IBA-prezentace-pruhledny Proteomické dáta 2D gélová elektroforéza Výuka IBA logo-IBA-transparent Princíp §Proteíny sú separované na géle v dvoch dimenziách – na základe hmotnosti a na základe pH logo-IBA-transparent Princíp 1.Proteíny sú extrahované zo vzorky 2. 2.Vzorka sa umiestni na gél a proteíny migrujú až kým dosiahnú izoelektronický bod (kedy ich náboj je nula) §Dôležitý je výber gélu, ktorý musí byť dostatočné pórovitý, aby umožnil proteínom pohyb (agaróza alebo polyacrylamidový gél) § 3.Takto sa proteíny oddelia vzhľadom k svojej hmotnosti a náboju. 4. 4.Následne proteíny necháme pohybovať sa na základe pH v druhej dimenzii 5. 5.Nakoniec je gél zafarbený aby sa detekoval jednotlivé spoty 6. 6.Keď sú spoty zafarbené, gél sa môže odfotiť 7. 7.Intenzita pixelov koreluje s množstvom proteínu, používa sa špeciálny SW pre analýzu spotov logo-IBA-transparent Ako vyzerá obrázok logo-IBA-transparent 2-D gelová elektroforéza § logo-IBA-transparent Ako vyzerajú dáta SSP wt_A wt_A wt_A wt_S 101 2338.84 2078.42 2625.1 2550.54 102 118.92 68.65 125.8 109.66 103 221.89 55.32 NA NA 104 215.3 189.02 220.28 NA 105 106.56 NA 238.36 NA 202 328.32 226.46 522.52 1281.75 203 259.8 228.13 340.37 NA 205 1439.72 1213.28 1187.43 1353.14 206 1094.33 754.83 1291.89 1240.82 208 97.78 41.51 164.49 33.25 209 NA NA NA 22.42 301 212.63 92.12 307.19 317.67 302 1491.34 1703.79 1830.19 1976.66 304 71.25 72.72 127.87 199.31 Vzorky Peptidy logo-IBA-transparent DIGE §Špeciálny typ 2-DE je 2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis (DIGE). § •Proteíny sa najprv zafarbia fluorescenčným farbivom • •Každé farbivo sa skenuje pod iným filtrom •Takto sa môže porovnávať viac vzoriek logo-IBA-transparent Nutnosť úpravy dát §Tak ako mikročipový experiment i 2-DE je vystavená experimentálnym chybám ktoré sú zdrojom šumu § §Je nutná úprava a normalizácia dát § §Neexistuje tu ale taká automatická kvantifikácia spotov tak ako u microarrays, pretože spoty nie sú fixne dané predom! §tá čo existuje, vyžaduje manuálnu úpravu §premenné kvality spotov § §Dáta z 2DE nie sú normálne rozložené – je nutná transformácia (log) § logo-IBA-transparent Normalizácia §Dôležitým krokom v úprave dát je kalibrácia všetkých expresných hodnôt a gélov navzájom §V tomto procese sa odstraňuje priestorový efekt, aj efekt farbiva §Na každom géle sú kontrolné proteíny, podľa ktorých gél kalibruje § § logo-IBA-transparent Kontrola kvality spotov § logo-IBA-transparent Kontrola kvality spotov 2. § logo-IBA-prezentace-pruhledny Kapitola IX Hmotnostná spektrometria Výuka IBA logo-IBA-transparent Hmotnostná spektrometria 1. Ionizace molekul pomocí laseru 3. Pohyb iontů nulovým elektrickým polem dolů po délce MS přístroje k detektoru, který měří TOF §Technika používaná pro charakterizaci proteomu v biologickém vzorku (plasma, sérum, . . .) §Založena na rozdílné hmotnosti peptidů a proteinů §hmotnostní spektrometr je separuje na základě poměru hmotnosti k náboji (anglicky mass to charge ratio – m/z, jednotka Dalton), který je specifický pro každou molekulu. §Najčastejšie používaný - TOF 2. Urychlení iontů pomocí akceleračního potenciálu m/z Sample chip put into vacuum chamber and hit with laser Proteins desorb and ionize when the matrix absorbs the energy Ionized protein molecules go into gas phase; detector records time of flight Electric field applied to accelerate ions down flight tube logo-IBA-transparent Hmotnostný spektrometer TOF - princíp §TOF (time-of-flight) závisí na hmotnosti proteinů nebo přesněji na jejich m/z a představuje sumu těchto časů: je čas letu v akcelerační oblasti, je čas přeletu v oblasti s nulovým elektrickým polem je čas detekce §TOF lze aproximovat pouze pomocí mass-to-charge ratio je vypočteno podle: § § §A a B jsou stanoveny pomocí kalibrace , Sample chip put into vacuum chamber and hit with laser Proteins desorb and ionize when the matrix absorbs the energy Ionized protein molecules go into gas phase; detector records time of flight Electric field applied to accelerate ions down flight tube logo-IBA-transparent Hmotnostný spektrometer TOF - druhy §Najpoužívanejšie: §Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionisation (MALDI)-TOF §Surface-Enhanced Laser Desorption-Ionisation (SELDI)-TOF § §Způsob uchycení proteinů a ionizace §Proteiny vzorku jsou před samotnou analýzou upevněny na podklad, který se v závislosti od typu hmotnostní spektrometrie liší. §Jeho úkolem je také absorbovat energii v ionizátoru a předat ji vzorku a tak usnadnit jeho ionizaci. §u MALDI see jedná o energii-absorbující matrici (matrix), co je nejčastěji organická kyselina s aromatickým jádrem §SELDI využívá proteinový čip (s několika - obvykle osmi - spoty), opatřen speciálním chromatografickým povrchem, takže se na povrch váží různé proteiny v závislosti na svých chemických vlastnostech a vlastnostech čipu. A až potom dojde k nanesení matrice, která se vzorkem vytvoří krystaly. § , Sample chip put into vacuum chamber and hit with laser Proteins desorb and ionize when the matrix absorbs the energy Ionized protein molecules go into gas phase; detector records time of flight Electric field applied to accelerate ions down flight tube logo-IBA-transparent rawvalues Ako vyzerá TOF MS profil logo-IBA-transparent spectrum spectrumrepeat Dve spektrá z jednej vzorky logo-IBA-transparent spectrum spectrum2 Spektrá z rôznych vzoriek logo-IBA-transparent MALDI-TOF §Matrix-Assisted Laser Desorption-Ionisation - TOF Sample chip put into vacuum chamber and hit with laser Proteins desorb and ionize when the matrix absorbs the energy Ionized protein molecules go into gas phase; detector records time of flight Electric field applied to accelerate ions down flight tube logo-IBA-transparent SELDI-TOF §Surface-Enhanced Laser Desorption-Ionisation – TOF §Existuje několik druhů čipů (IMAC30, H50, NP20...), které se liší svým aktivním povrchem (anionický, kationický, kovový, normální fáze, hydrofobický, …) a proto také přednostně vážou jiné molekuly. Výhoda SELDI: Možnost odmýt látky, které by jinak ovlivňovali spektrum vzorku (např. močovina používaná k přípravě vzorku, nebo Na+ ionty přítomné fyziologicky ve vzorcích). Sample chip put into vacuum chamber and hit with laser Proteins desorb and ionize when the matrix absorbs the energy Ionized protein molecules go into gas phase; detector records time of flight Electric field applied to accelerate ions down flight tube logo-IBA-transparent Čipy pre SELDI hmotnostnú spektrometriu §Kvantitatívne hodnoty proteómu sú takisto ovplyvnené rôznymi zdrojmi variability (experimentálne aj biologické) §Veľmi veľké rozdiely medzi typmi použitého čipu! H50 IMAC30 NP20acid NP20alkaline N % N % N % N % H50 75 100.0 19 47.5 24 52.2 56 59.6 IMAC30 19 25.3 40 100.0 19 41.3 21 22.3 NP20acid 24 32.0 19 47.5 46 100.0 30 31.9 NP20alkaline 56 74.7 21 52.5 30 65.2 94 100.0 separate M/Z 15 20.0% 15 37.5% 12 30.0% 28 29.8% Many published studies do not match for age or do not mention such factors (Zhang et al 2004??) Example from the clinical study later illustrates point about age. logo-IBA-transparent 2500 5000 7500 10000 2500 5000 7500 10000 0 25 50 75 100 2500 5000 7500 10000 0 25 50 75 100 2500 5000 7500 10000 0 25 50 75 100 2500 5000 7500 10000 0 25 50 75 100 2500 5000 7500 10000 2500 5000 7500 10000 2500 5000 7500 10000 0 25 50 75 100 2500 5000 7500 10000 0 25 50 75 100 2500 5000 7500 10000 0 25 50 75 100 2500 5000 7500 10000 0 25 50 75 100 2500 5000 7500 10000 2500 5000 7500 10000 2500 5000 7500 10000 0 25 50 75 100 2500 5000 7500 10000 0 25 50 75 100 2500 5000 7500 10000 0 25 50 75 100 2500 5000 7500 10000 0 25 50 75 100 2500 5000 7500 10000 Citrate EDTA Heparin Serum CM10 IMAC-Cu - H50 m/z m/z m/z Peaky profilov 3 odlišných SELDI čipov Vzorky spracované 4 rôznymi spôsobmi Banks et al, Clinical Chemistry 2005 logo-IBA-transparent Príklad §Zhlukovanie profilov tých istých vzoriek zo 4 typov SELDI sklíčok: §IMAC30, H50, NP20zas, NP20kys logo-IBA-transparent Úpravy dát §Kalibrácia §TOF premenený na škálu m/z pomocou množstva kalibračných proteínov so známou m/z hodnotou. Toto sa deje ešte v laboratóriu § §Základné dáta § §Baseline subtraction §Odstránie baseline šumu z profilu, napríklad pomocou loess §Normalizácia §Aby sme mohli porovnať spektrá medzi vzorkami logo-IBA-transparent rawvalues logo-IBA-transparent rawplusbaselineDNP Baseline subtraction logo-IBA-transparent correctedDNP Upravené dáta logo-IBA-transparent Normalizácia §Odstraňujeme technickú variabilitu (prístrojové chyby, odlišné množstvo vzorky) § §Koncentrácia proteínu sa odhaduje ako plocha pod píkom (Area Under Curve – AUC) § § §Normalizácia pomocou priemernej AUC (TIC – total ion current) §AUC celého spektra / priemerná AUC všetkých spektier § logo-IBA-transparent Detekcia píkov a ich zarovnanie §Pík ~ peptid/proteín, definuje sa ako lokálne maximum na základe porovnania variability v okolí § §Existujú nepresnosti na x (m/z) a y (množstvo) osiach § §Píky ktoréhokoľvek spektra môžu byť definované ako body ktoré sú maximálne +/- N bodov v okolí m/z §first, second, estimated.. § §Dôležité je brať do úvahy signal-to-noise ratio - peaky musia prekročiť nejakú bežnú hranicu šumu, aby boli označené za píky § On x-axis shift of 0.1% to 0.2% often quoted Results sensitive to window size chosen logo-IBA-transparent Ako vyzerajú dáta po zarovnaní a detekcii píkov §SELDI-TOF Cluster Group Norm. Log Intensity M/Z Intensity Norm. Linear Intensity Type Mass Dev. 1 chemoresistentni 0.581550 2392.84 3.058176 30.578211 estimated 0.000007 1 chemoresistentni -0.072123 2392.84 1.943959 12.984676 estimated 0.000007 1 chemoresistentni 0.023116 2392.84 2.076621 15.079403 estimated 0.000007 1 chemoresistentni 0.160910 2392.84 2.284742 18.365652 estimated 0.000007 1 chemoresistentni 0.199591 2392.84 2.346828 19.345988 estimated 0.000007 1 chemoresistentni 0.161331 2392.82 2.285410 18.376190 first -0.000004 logo-IBA-transparent Aplikácie I – identifikácia baktérii § Acinetobacter johnsonii Escherichia coli Ecoli Pseudomonas aeruginosa Kingella kingae 5050 2524 4426 3154 3592 2212 4120 5968 4704 7184 2746 5320 0 2000 4000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 11000 logo-IBA-transparent Aplikácie I – identifikácia baktérii § Acinetobacter bouvetii Acinetobacter haemolyticus Acinetobacter johnsonii NIPH 2122 Acinetobacter johnsonii NIPH 2124 logo-IBA-transparent § 33 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Duskova KAS 151 Duskova KAS 152 Duskova KAS 153 Duskova KAS 115 Duskova KAS 110 Duskova KAS 113 Duskova KAS 137 Duskova KAS 175 Duskova KAS 155 Duskova KAS 106 Duskova KAS 102 Duskova KAS 140 Duskova KAS 105 Duskova KAS 139 Duskova KAS 112 Duskova KAS 111 Duskova KAS 114 Duskova KAS 180 Duskova KAS 187 Duskova KAS 184 Duskova KAS 190 Duskova KAS 191 Duskova KAS 192 Duskova KAS 185 Duskova KAS 186 Duskova KAS 169 Duskova KAS 188 Duskova KAS 168 Duskova KAS 170 Duskova KAS 171 Duskova KAS 121 Duskova KAS 104 Duskova KAS 183 Duskova KAS 193 Duskova KAS 223 Duskova KAS 224 Duskova KAS 88 Duskova KAS 119 Duskova KAS 125 Duskova KAS 149 Duskova KAS 89 Duskova KAS 94 Duskova KAS 91 Duskova KAS 120 Duskova KAS 148 Duskova KAS 126 Duskova KAS 99 Duskova KAS 117 Duskova KAS 118 Duskova KAS 92 Duskova KAS 236 Duskova KAS 238 Duskova KAS 242 Duskova KAS 243 Duskova KAS 237 Duskova KAS 229 Duskova KAS 231 Duskova KAS 230 Duskova KAS 239 Duskova KAS 258 Duskova KAS 209 Duskova KAS 210 Duskova KAS 226 Duskova KAS 206 Duskova KAS 205 Duskova KAS 215 Duskova KAS 124 Duskova VI Duskova XIII Duskova VII Duskova XIV Duskova KAS 240 Duskova KAS 241 Duskova KAS 244 Duskova KAS 259 Duskova KAS 212 Duskova KAS 207 Duskova KAS 208 Duskova KAS 211 Duskova KAS 213 Duskova KAS 227 Duskova KAS 228 Duskova KAS 216 Duskova KAS 167 Duskova KAS 136 Duskova KAS 165 Duskova KAS 133 Duskova KAS 247 Duskova KAS 268 Duskova KAS 225 Duskova V Duskova KAS 252 Duskova KAS 256 Duskova KAS 232 Duskova IV Duskova XV Duskova KAS 267 Duskova XI Duskova XVII Duskova XVI Duskova KAS 264 Duskova KAS 266 Duskova KAS 265 Duskova KAS 253 Duskova KAS 255 Duskova I Duskova II Duskova III Duskova KAS 248 Duskova KAS 158 Duskova KAS 203 Duskova XX Duskova XII Duskova KAS 202 Duskova KAS 142 Duskova XXI Duskova KAS 245 Duskova KAS 263 Duskova KAS 257 Duskova KAS 246 Duskova KAS 234 Duskova KAS 249 Duskova KAS 260 Duskova KAS 270 Duskova KAS 254 Duskova KAS 262 Duskova KAS 261 Duskova KAS 199 Duskova KAS 196 Duskova KAS 200 Duskova KAS 194 Duskova KAS 195 Duskova KAS 201 Duskova KAS 189 Duskova KAS 197 Duskova KAS 198 Duskova KAS 204 Duskova KAS 178 Duskova KAS 172 Duskova KAS 132 Duskova KAS 129 Duskova KAS 181 Duskova KAS 173 Duskova KAS 134 Duskova KAS 128 Duskova KAS 182 Duskova KAS 162 Duskova KAS 163 Duskova KAS 130 Duskova KAS 135 Duskova KAS 84 Duskova KAS 83 Duskova KAS 85 Duskova IX Duskova XVIII Duskova X Duskova VIII Duskova XIX Duskova KAS 251 Duskova KAS 164 Duskova KAS 141 Duskova KAS 86 Duskova KAS 96 Duskova KAS 101 Duskova KAS 95 Duskova KAS 97 Duskova KAS 176 Duskova KAS 160 Duskova KAS 179 Duskova KAS 122 Duskova KAS 123 Duskova KAS 147 Duskova KAS 90 Duskova KAS 144 Duskova KAS 145 Duskova KAS 127 Duskova KAS 116 Duskova KAS 138 Duskova KAS 100 Duskova KAS 98 Duskova KAS 93 Duskova KAS 108 Duskova KAS 107 Duskova KAS 217 Duskova KAS 221 Duskova KAS 177 Duskova KAS 222 Duskova KAS 174 Duskova KAS 154 Duskova KAS 166 Duskova KAS 156 Duskova KAS 143 Duskova KAS 146 Duskova KAS 218 Duskova KAS 219 Duskova KAS 220 Duskova KAS 150 Duskova KAS 109 Duskova KAS 161 Duskova KAS 131 Duskova KAS 103 Duskova KAS 87 Distance Level Lactococcus lactis Lactococcus garvieae Lactobacillus brevis Lactobacillus sakei Lactobacillus curvatus Enterococcus faecalis Enterococcus thailandicus Enterococcus faecium Enterococcus spp. Enterococcus hermanniensis Enterococcus devriesei Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum/paraplantarum Pseudomonas spp. Weissella viridescens Corynebacterium variabile Corynebacterium spp. Streptococcus parauberis Streptococcus salivarius Streptococcus spp. Vagococcus fluvialis Leuconostoc citreum Bacillus spp. Bacillus subtilis Staphylococcus carnosus Staphylococcus spp. Staphylococcus hominis Bacillus cereus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus spp. Staphylococcus aureus Pediococcus pentosaceus Pediococcus spp. Pediococcus acidilactici salami logo-IBA-transparent Aplikácia II * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * MALDI-TOF MS fingerprint containing proteins 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 4 x10 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 MALDI-TOF MS fingerprint containing maltooligosaccharides 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 4 x10 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 m/z Šedo et al., 2012 logo-IBA-transparent Aplikácia II § 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Brewery 1 bottle 3 Brewery 1 bottle 4 Brewery 1 bottle 5 Brewery 1 bottle 1 Brewery 1 bottle 2 Brewery 2 bottle 3 Brewery 2 bottle 4 Brewery 2 bottle 5 Brewery 2 bottle 1 Brewery 2 bottle 2 Brewery 3 bottle 1 Brewery 3 bottle 2 Brewery 3 bottle 3 Brewery 3 bottle 4 Brewery 3 bottle 5 Distance Level logo-IBA-transparent Aplikácia II § 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Pilsner Urquell bottle 3 analysis I Pilsner Urquell bottle 3 analysis II Pilsner Urquell bottle 1 analysis I Pilsner Urquell bottle 1 analysis II Pilsner Urquell bottle 2 analysis I Pilsner Urquell bottle 2 analysis II Branik bottle 1 analysis I Branik bottle 1 analysis II Branik bottle 3 analysis I Branik bottle 3 analysis II Starobrno bottle 1 analysis II Starobrno bottle 2 analysis I Starobrno bottle 3 analysis I Starobrno bottle 3 analysis II Starobrno bottle 2 analysis II Budweiser Budvar bottle 1 analysis I Budweiser Budvar bottle 1 analysis II Budweiser Budvar bottle 2 analysis I Budweiser Budvar bottle 3 analysis I Primator bottle 1 analysis I Primator bottle 1 analysis II Cerna Hora bottle 2 analysis I Rychtar bottle 2 analysis II Rychtar bottle 3 analysis I Rychtar bottle 1 analysis I Rychtar bottle 2 analysis I Rychtar bottle 3 analysis II Rychtar bottle 1 analysis II Budweiser Budvar bottle 2 analysis II Budweiser Budvar bottle 3 analysis II Cerna Hora bottle 1 analysis I Cerna Hora bottle 1 analysis II Cerna Hora bottle 3 analysis I Cerna Hora bottle 3 analysis II Cerna hora bottle 2 analysis II Primator bottle 2 analysis I Primator bottle 2 analysis II Primator bottle 3 analysis I Primator bottle 3 analysis II Krusovice bottle 3 analysis I Staropramen bottle 3 analysis I Branik bottle 2 analysis I Branik bottle 2 analysis II Staropramen bottle 2 analysis II Staropramen bottle 2 analysis I Gambrinus bottle 1 analysis I Gambrinus bottle 1 analysis II Gambrinus bottle 3 analysis I Gambrinus bottle 3 analysis II Gambrinus bottle 2 analysis I Gambrinus bottle 2 analysis II Krusovice bottle 1 analysis II Krusovice bottle 2 analysis I Krusovice bottle 3 analysis II Starobrno bottle 1 analysis I Krusovice bottle 2 analysis II Zlaty Bazant bottle 3 analysis I Zlaty Bazant bottle 3 analysis II Zlaty Bazant bottle 2 analysis I Zlaty Bazant bottle 2 analysis II Staropramen bottle 1 analysis I Staropramen bottle 3 analysis II Staropramen bottle 1 analysis II Velkopopovicky Kozel bottle 1 analysis I Velkopopovicky Kozel bottle 2 analysis I Velkopopovicky Kozel bottle 1 analysis II Velkopopovicky Kozel bottle 3 analysis I Velkopopovicky Kozel bottle 3 analysis II Velkopopovicky Kozel bottle 2 analysis II Krusovice bottle 1 analysis I Heineken bottle 1 analysis I Zlaty Bazant bottle 1 analysis I Heineken bottle 2 analysis I Zlaty Bazant bottle 1 analysis II Heineken bottle 1 analysis II Heineken bottle 3 analysis I Heineken bottle 2 analysis II Heineken bottle 3 analysis II Bernard bottle 1 analysis I Bernard bottle 1 analysis II Bernard bottle 2 analysis I Bernard bottle 2 analysis II Bernard bottle 3 analysis II Bernard bottle 3 analysis I Carlsberg bottle 1 analysis I Carlsberg bottle 1 analysis II Carlsberg bottle 2 analysis II Carlsberg bottle 2 analysis I Carlsberg bottle 3 analysis I Carlsberg bottle 3 analysis II Stella Artois bottle 1 analysis I Stella Artois bottle 1 analysis II Stella Artois bottle 2 analysis II Stella Artois bottle 2 analysis I Stella Artois bottle 3 analysis I Stella Artois bottle 3 analysis II Corona bottle 1 analysis I Corona bottle 1 analysis II Corona bottle 3 analysis I Corona bottle 2 analysis I Corona bottle 2 analysis II Corona bottle 3 analysis II logo-IBA-prezentace-pruhledny Liquid Chromatography MS/MS Výuka IBA Z pohľadu centrálneho laboratória logo-IBA-transparent Dva hlavné prístupy §Bottom-up proteomika •protein → peptidy •analýza peptidov pomocou MS •fragmentácia peptidov v MS • • §Top-down proteomika •analýza intaktných proteinov v MS •fragmentácia proteinu v MS • § Zhang, H.; Ge, Y. Circ Cardiovasc Genet, 2011, 4, 711–711. logo-IBA-transparent Experiment Štatistická a bioinformatická analýza Biologický materiál Izolácia, štiepenie LC MS/MS systém Spracovanie dát Identifikácie proteínov logo-IBA-transparent Typy experimentov I §Podľa komplexity vzorky (počtu očakávaných proteínov): §Identifikácia proteinu(ov) z gelu 2D-SDS-PAGE (jednotky proteínov, desiatky vzoriek) § Heineken – gel repl. 1 # 47 # 39 # 50 # 19 logo-IBA-transparent Typy experimentov I §Podľa komplexity vzorky (počtu očakávaných proteínov): §Identifikácia proteinu(ov) z gelu 2D-SDS-PAGE (jednotky proteínov, desiatky vzoriek) §Identifikácia proteínov v prúžkoch z gelu 1D-SDS-PAGE (jednotky až stovky proteínov, jednotky vzoriek) § logo-IBA-transparent Typy experimentov I §Podľa komplexity vzorky (počtu očakávaných proteínov): §Identifikácia proteínu(ov) na gele 2D-SDS-PAGE (jednotky proteínov, desiatky vzoriek) §Identifikácia proteínov v prúžkoch z gelu 1D-SDS-PAGE (jednotky až stovky proteínov, jednotky vzoriek) §Relatívne porovnanie dvou bun. linií – wild-type vs. mutant (tisíce proteínov, jednotky vzoriek) § logo-IBA-transparent Typy experimentov II §Podľa použitého značenia: §label-free – bez značenia §SILAC – stabilné izotopové značenie aminokyselín v bunkových kultúrach (2-3 vzorky) §iTRAQ – izobarické značky pre relatívnu a absolútnu kvantifikáciu (4 alebo 8 vzoriek) § logo-IBA-transparent Získané informácie §Kvalitatívne – primárny cieľ §Aké proteíny sa vo vzorke vyskytujú? §Kvantitatívne §Hodnotenie koncentrácie proteinov (PSMs, AUC) §Modifikácie §Výskyt posttranslačných modifikácii (fosforylácie) logo-IBA-transparent Experiment Štatistická a bioinformatická analýza Biologický materiál Izolácia, štiepenie LC MS/MS systém Spracovanie dát Identifikácie proteinov logo-IBA-transparent Spracovanie dát 1.úprava hrubých dát (MS/MS i MS) 2.príprava dát pre databázové vyhľadávanie 3.príprava proteínovej databázy, databázové vyhľadávanie 4.spracovanie výsledkov z pohľadu FDR 5.výber peptidových identifikácií (PSMs) 6.rekonštrukcia zoznamu „identifikovaných“ proteinov 7.interpretácia proteinového zoznamu(ov) § logo-IBA-transparent Úprava hrubých dat §Profilové spektrum §Získané z experimentu Čiarové spektrum §Vypočítané z profilového 612.5 613.0 613.5 614.0 614.5 615.0 615.5 616.0 616.5 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 614.34 615.34 612.5 613.0 613.5 614.0 614.5 615.0 615.5 616.0 616.5 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 614.37 615.32 logo-IBA-transparent Rekalibrácia §Interná rekalibrácia – rovnaká na celý záznam §lockmass – každé spektrum podľa opakujúcej sa kontaminanty §Podľa identifikovaných peptidov – odhad závislosti z identifikovaných peptidov (polynóm) § retenční čas (min) logo-IBA-transparent Databázove vyhľadávanie 1.Príprava dat §Výber „reprezentatívnych“ signálov MS/MS §Odstránenie „menej kvalitných“ spektier MS/MS §Top N (z okna), dekonvolúcia signálu a šumu § §Získame tabuľku m/z hodnôt a intenzít 2.Príprava databázy §in silico štiepenie sekvencií z databázy §Priradenie jedného alebo viacerých peptidov k jednému spektru (decoy databáza, FDR, Percolator) 3.Výber peptidových identifikácii logo-IBA-transparent 1 2 3 1. prehľadánie dát MS/MS 2. výpočet „vlastností“ peptidov 3. prepočítanie skór peptidov Prepočítanie skór peptidov •Použitie support vector machines (SVM) •sady identifikací •falošne pozitivné – decoy databáza •pozitivné – pôvodná dabáza (skóre) •priradenie váh vlastnostiam v SVM •např. skóre; chyba hmotnosti intenzita, modifikácie, ... Þviac identifikovaných peptidov http://per-colator.com/images/percolator.png Percolator logo-IBA-transparent Rekonštrukcia sady proteínov Analógia puzzle, ALE: •Tisíce kúskov: •Rovnaké •Poškodené •Chýbajúce •Z iných skladačiek •Pasujú na rovnaké miesta Korf, Nat Methods, 2013 logo-IBA-transparent Vybrané prístupy §N – peptidové pravidlo §Proteíny, u ktorých pozorujeme aspoň N peptidov §Vysoká falošná pozitivita §Používané na sekvenčne homologické proteiny § §Pravdepodobnostné prístupy §ProteinProphet, Nested mixtures, Fido § § § logo-IBA-transparent Princíp parsimónie a Occamovej britvy A.Vytvorenie biparitného grafu: peptidy - možné proteíny B. B.Zlúčenie proteínov a peptidov do skupín (napr. pep 3,7,9; pro 4,9) C. C. C. C.Rozdelenie skupín D. D.Výber minimálnej sady proteínov § § Zhang, B. et al. J. Proteome Res., 2007, 6, 3549–3557. Dôsledok: falošná negativita výsledkov logo-IBA-transparent Experiment Štatistická a bioinformatická analýza Biologický materiál Izolácia, štiepenie LC MS/MS systém Spracovanie dát Identifikácie proteínov logo-IBA-transparent Čo s identifikovanými proteinmi? §Závisí od pôvodného experimentu § §Typicky, doplnenie anotácie proteínov z databázy (GO, KEGG, TAIR) a použitie metód analýzy génových sad § § § logo-IBA-prezentace-pruhledny Kapitola X Databázy dát Výuka IBA logo-IBA-transparent Verejne prístupné databázy §Veľké experimenty majú až stovky,alebo tisíce vzoriek, v každej sa študujú desaťtisíce, až stotisíce génov § §Pre publikáciu výsledkov je vyžadované vložiť dáta v štandardizovanom formáte (MIAME - Minimal Information About a Microarray Experiment) do jednej z verejne prístupných databáz,tak aby ktokoľvek bol schopný výsledky zreprodukovať § §Toto prináša veľkú výhodu: § môžeme dáta podrobovať meta-analýze (simultánne porovnávať dáta z rôznych experimentov) §vďaka štandardnému formátu môžeme vyhľadávať súbory s parametrami, ktoré potrebujeme §dáta môžeme automaticky sťahovať logo-IBA-transparent GEO na NCBI logo-IBA-transparent Array Express na EBI http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/ logo-IBA-transparent §E-learningové skriptá analýzy dát IBA §http://portal.matematickabiologie.cz/index.php?pg=analyza-genomickych-a-proteomickych-dat--analyza -genomickych-a-proteomickych-dat