Zajištění exprese klonovaných genů a její optimalizace i Faktory ovlivňující expresi klonovaných genů A. Regulační sekvence pro genovou expresi 1. Transkripční úroveň • Síla promotoru a jeho charakter • Terminátor transkripce • Stabilita mRNA, její posttranskripční úpravy 2. Translační úroveň • Účinnost vazby mRNA na ribozom • využívání kodonů • stabilita proteinu, posttranslační úpravy 3. Transport proteinu • charakter signální sekvence B. Vlastnosti vektorů • Počet kopií vektoru (počet kopií inzertu) • Stabilita vektoru C. Fyziologie hostitelské buňky • růstové podmínky • enzymový aparát hostitelské buňky Signály ovlivňující transkripci a translaci strukturního genu (bakterie E. co li) Regulační signály pro transkripci Regulační signály pro iniciaci translace TGTTGACA +1 -35 ■10 Vedoucí sekvence m RNA Signální peptid TATAATG TAAGGAG ATG Klonovaný gen protein STOP T _ 3 Faktory ovlivňující expresi klonované DNA Regulační sekvence vektoru Vlastnosti inzertu QI Promotor i +1 i Klonovaný strukturní gen, cDNA p l / vedoucí Terminátor / oblast transkripce síla promotoru Využívání kodonů 1. signály pro iniciaci translace 2. signály pro transport 1. sekundární struktura mRNA 2. signály pro sestřih (3' a 5' místa intronu) 4 Sekvence bakteriálních přirozených a hybridních promotorů -35 Region _|l7bp |_ -10 Region 12 3 4 5 8 7 8 9 1011121314151617 ÉOÉŠBřiSUi • • * T TG A C A ••••••• *.........T A T A AT ♦ • lac GGCTTT ACACTTTATGCTTCCGGCTCGT AT AT..TGT trp CTGTTGACAATTAATCAT CGAACTAGTTAACTAG XPL GTGTTGACATAAATACCA CTGGCGGTGATACTGA recA CACTTGAT ACTGT ATGAA GCATACAGTATAATTG tací CT G T T G A C A A TTAATCAT CGGCTCGTAT AATGT řacll CTGTTGACAATTAATCAT CGAACTAGTTTAATGT Hybridní promotory 15-18 bp 5-9 bp 5 Sekvence lac, trp a tac promotoru -35 consensus 5'-TTGACA-3' 1«C: S'- . . .TTTACACTTTATGCTTCCť -10 consensus 5'-TATAAT-31 CGTATATTGTGTGGAATTGTGAGCGGÄTAÄC .---;-----' % * „-—---------- VCACAGGAAACAGC r ATG... - 3 -35 10 RBS Protein trp : S * -...TTGACAATTAATCATCGpUCTAGTTAACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGACA ATG. -35 -10 RBS Protein TTGAOUkTTAATCATČ^ČTCQTATA^ ATG... - 3 -35 -10 RBS Protein Hybridní promotor 6 Regulovatelné promotory používané v expresních vektorech Promotor Zdroj Způsob regulace £ coli lac-UV5 nezávislost na katabolické represi Využití u eukaryot XpL, XpR lac trp tac phoA recA tet Leftward and rightward early promoters of X £ coli lac Operon E. coli trp Operon trp-35 region /sc-10 region hybrid E. co//alkaline phosphatase Operon E. colirecA gene Tn/0 tetracycline-resistance gene Off 30'C Tryptophan in medium Excess phosphate in medium On >37*C (in cl857 host) IPTG in medium Indoleacetic acid in medium IPTG .in medium Phosphäte-limited medium Mitomycin C in medium Tetracyclines in medium Promotory fága lambda vykazují velmi striktní kontrolu transkripce s krátkým lagem mezi neindukovaným a indukovaným stavem. V neindukovaném stavu nedochází vůbec k transkripci, na od promotorů „metabolických" operonů, kdy částečná transkripce probíhá pořád. Promotor Zdroj Způsob regulace Off Ä subtilis bla cat Streptomyces gyl S. cerevisiae ADH GAL1 GPD-PH05 Bacillus licheniformis ^-lactamase gene Bacillus pumilis chloramphenicol acetyl transferase Streptomyces coellcolor glycerol operon Yeast repressible alcohol dehydrogenase [ADR) gene Yeast galactose utilisation operon Hybrid between yeast glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase and alkaline phosphatase gene promoters Glucose in medium High glucose in medium Glucose in medium Excess phosphate in medium On (Mactams in medium Chloramphenicol in medium Glycerol in medium Low glucose in medium Galactose in medium Phosphate-limited medium 8 Vliv vzdálenosti mezi promotorem a startem translace na množství vytvářeného proteinu cro změny vzdálenosti Transcription from íac promoter -> Recognition sequence for endonuclease Bam HI Translational start signal for cro gene SD iac r SD cro AATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGGATCCGGGACTATTTTACCTATGGCGGTGATAATGGTTGCATGTACTAAGGAGGTTGTATG TTAACACTCGCC TAT TGT T AAAGTGTGTCC T T TGT CC T AGGCCC TGAT A AA A TGG AT ACCGCC ACT A T T ACC A ACGT AC A TG ATTCCT.CGA AC AT AC Delece různého rozsahu < ŕ pTR213 pTR199 pTR214 pTR188 pTR194 PTR210 pTR182 ^ pTR190 1.63 0.085 1.00 0.65 0.51 0.85 0.0012 -co.oooe 1 Relativní množství produkovaného proteinu cro 9 Sekundární struktura cro-mRNA Iniciační kodon AUG je součástí smyčky - protein cro se tvoří v malém množství 10 Vliv regulačních sekvencí na výtěžek t-antigenu SV40 z různých plazmidových konstruktů % celkového proteinu Vzdálenost SD-ATG Sekvence oblasti pro iniciaci translace vektor 0.068 9 AGGAAACAGAAAGATGGAT pTR436 1.0 9 AGGAAACAGCCAGATGGAT HP1 0.01 5 GTCGAGGAATTCCATGGAT pPLcSVt5-372 0.1 5 ATTGGAATTCCATGGAT pPLcSVt5-37 2.5 8 TTGGAATTATTCCATGGAT pPLcSVt5-379 1.0 9 TTGGAATTAATTCCATGGAT pPLcSVt5-374 0.01 9 AGGAATTCCAAAGATGGAT a ▲ pPLcSVt5-72 SD Inic.kodon ii Sekundární struktura mRNA (pro t-antigen) v oblasti iniciačního kodonu v různých plazmidových konstruktech Množství proteinu^ AUG Ul-a a a|-u g-c a-u a-U .a-G-C^ Wg".u-.£' ______ a 1 .u. ,uLU "a UCacacaggaa CCliU l aggc , ÁÍÓtfyj ů c t! c č ij u auaa ggggguc cg q u g a c C G u g , u-a g-C u-a u-a a-u a-u SD 1,0 ,a-u-u c c|X| u,c,u ú ,-A X-G- c-g ,-fiA-U tíS-u e-A-a.. A-U a U 55 g>^ A-U u-g-g U-A u-a c-u u-a a-u a-u g-C g-c a-u G-C . g,a-u g U-A- u-a" a-u c-g a-g-c-a., 0 U U U A A A AAÁÁÁÁÚuÚ A a-u a-u a-u ,g"c. 1,0 U i a ac0gaAa xacagag * A G G u a ug.cua A-U A-U A-U £A-U-C-G.c.A_ t J Ba-Iu-aja-u^ c_g'a. .U. .U.u UC ACACAGGAŽk CCUUCAGGC Á5j frjj ÚČÚČCÚÚA U A AGGGGGÚČČa g a ucaa ugaG° ■3' .C-G. u a 'C-GI C-G u-a u-a a-u a-u G-C G-C u-a u-a a- ,.:-1g 0,01 'C-C-G-' auaaaguuuuaaa .G. ÁÁÁÁirÚÚ g A / A A' ■c-cu- u-^u u A 'c-g' c-g ■vtA-U u:g.-c v^ArU a-u-g-a-a u g g:c°cu-g-a-g c-g-g. g g u-g-g' u-a u-a c-u u-a a-u a-u g-c g-c a-u g-c ; a-u C □ Q A 12 Mechanismus působení sekvence riboswitch na mRNA a) Terminace transkripce. Vazba malé a) Iniciace translace. Vazba malé molekuly molekuly na riboswitch ve vedoucí sekvenci na riboswitch navodí vytvoření vlásenkové mRNA navodí vytvoření vlásenkové smyčky, smyčky, v níž se nachází RBS. Ribozom se která ukončí transkripci. _ nenaváže a translace nezačne. (U 2012 Pearsori Edueation. inc_ 13 Posun vzdálenosti mezi promotorem a klonovaným genem BamH\ EcoR\ BamH\ BamH\ Štěpení EcoRI I kohezní EcoRIkonce / X klonovaný gen T4-ligáza EcoRI klonovaný gen EcoRI Štěpení i BamH\ ▼ Štěpení Exolll a S1 nukleázami klonovaný gen EcoRI různý rozsah odbourání DNA u jednotlivých molekul /\ EcoRI klonovaný gen /ac-Promotor-fragment (95 bp) posun vzdálenosti klonovaný gen EcoRI 14 Použití teplotně senzitivního represoru cl857pro regulaci promotoru Pi_ fága X Promotory fága lambda vykazují striktní regulaci transkripce s krátkým lagem mezi neindukovaným a indukovaným stavem. V neindukovaném stavu k transkripci vůbec nedochází, na rozdíl od promotorů "metabolických" operonů, kdy částečná transkripce probíhá stále. Problém s termoindukcí u ts promotorů je ve velkokapacitních nádobách, kde je obtížné zvýšit rychle teplotu z 30 na 41CC. chromozom E. coli ,n„ cl857 ----1-—I----Lambda cl857-lysogen Při 32 3 73 69 22 345 294 lle'l Met 67 156 262 118 -*■ 2 140 27 130 Val 192 108 41 66 119 .48 83 123 silně/slabě Ser 93 36 87 49 6 37 12 62 Pro 21 2 29 46 26 45 162 101 Thr 103 46 137 119 15 32 as 76 Ala 173 87 48 178 119 107 129 149 silně/slabě Tyr < 34 98 96 65 ochre amber His { Gin 19 75 3S 95 59 90 169 1G6 AsnJ Lys 13 101 159 98 259 163 106 44 Asp Glu 116 183 204 ,106 333 210 106 98 silně/slabě Cys opal Trp 13 23 25 34 39 Arg 223 §9 ioi 133 -»• 3 1 27 42 Ser Arg 10 56 49 61 3 28 -V 1 17 Gly 226 124 174 140 -> 4 -+14 42 66 u c A G U C A G U C A G U c A G Silně exprimované geny představuje 24 druhů mRNA s celkovým počtem 5253 kodonů. Mezi tyto geny patří gen pro RNA-polymerázu, geny pro dvanáct ribozomových proteinů, několik proteinů vnější membrány a geny pro elongační translační faktory. Slabě exprimované geny představuje 18 druhů mRNA s 5231 kodony. Patří sem několik represorových genů, gen pro transponázu a p-laktamázu. Kodony, které jsou čteny jen jedinou tRNA a jejichž výběr je závislý na povaze a síle interakcí mezi kodonem a antikodonem, jsou v rámečku. Šipkami jsou označeny kodony, které jsou používány jen zřídka a mohou se podílet na regulaci genové exprese. « Řešení problému rozdílného využívání kodonů 1. Koexprese genů pro tRNA pro alternativní kodony příprava kmenů s klonovanými geny pro tRNA na samostatných vektorech kmen E. coli Rosetta má geny pro tyto tRNA na plazmidu, který je kompatibilní s expresním vektorem. 2. Změna méně často používaných kodonů mutagenezí in vitro za kodony používané častěji (pracnější postup) 29 Dosažení vysoké exprese cizorodého genu v kmenech E. coli obsahujících geny pro vzácné tRNA Standardní kmen E. coli host cell Plazmid s cizorodým genem 1 1 Low level of foreign gene expression Upravený kmen Plazmid s cizorodým genem E. coli host cell í Ii 11 i High level of foreign gene expression Overproduced tRNA 30 Zvýšení stability cizích proteinů v E. coli Změna lokalizace (poločas krysího proinzulinu v E. coli\e v cytoplazmě 2 min, v periplazmě 10 x vyšší) Tvorba fúzních proteinů (bakteriální + eukaryotická část = (3-galaktozidáza + somatostatin, pak štěpení fúzního proteinu) Exprese v mutantách E. coli s nižší aktivitou intracelulárních proteáz (lon-proteáza - zabraňuje akumulaci denaturovaných nebo jinak pozměněných polypeptidů). Snížení degradace proteinů produktem genu pin fága T4 (protease inhibition) - stabilizace eukaryotických proteinů (interferon) 31 Zvýšení stability proteinů změnou sekvence jeho aminokyselin Stabilita (3-galaktozidázy po přidání aminokyselin k jejímu N-konci Přidané minokyseliny Poločas Met, Ser, Ala >20h Thr, Val, Gly >20h Ne, Glu >30 min Tyr, Gin -10 min Pro ~7 min Phe, Leu, Asp, Lys ~3 min Arg ~2 min PEST = aminokyseliny (prolin P, glutamová kys. E, serin S. treonin T), jejichž přítomnost v určitých vnitřních oblastech proteinu zvyšuje jeho citlivost k proteolytické degradaci Vytváření fúzních proteinů Fúzní protein: produkt vytvořený po spojení dvou nebo více genů/sekvencí: 1. Přirozený gen hostitelského organismu = stabilizující partner (cizí proteiny jsou v heterologních systémech často nestabilní) 2. Cizorodý gen (gen zájmu ) 3. +/- spojující sekvence (oligonukleotidový linker), kódující krátké úseky aminokyselin rozpoznávané nebakteriálními proteázami umožňují dodatečné odštěpení cílového produktu z fúzního proteinu používají se k purif ikaci rekombinantních proteinů 33 Klonovací vektor pro přípravu fúzních proteinů Selekční marker Zkrácený gen pro (3-galaktozidázu, vložený mimo čtecí rámec genu ompF N-terminální část genu ompF Abel lacZ Ĺ Klonovací místo Signály pro transkripci, translaci a sekreci fúzního proteinu AbcJ—t Cut with Abel Gene Abel Cizorodý gen lacZ Abel Gene Ábel a ■ ■ • • • Tribridní protein ♦ ♦ Např. antigen pro přípravu protilátek Některé fúzní systémy používané k purifikaci cizorodých proteinů vytvářených v E. coli Fuzni partner Velikost Ligand Podminky eluce ZZ 14 kDa igG Low pH His tail (tag) 6-10 aa Ni2+ Imidazole Strep-tag 10 aa Streptavidin Iminobiotin PinPoint 13 kDa Streptavidin Biotin MBP 40 kDa Amylose Maltose (3-Lactamase 27 kDa Phenyl-boronate Borate GST 25 kDa Glutathione Reducing agent Flag 8 aa Specific MAb Low calcium ZZ = fragment proteinu A (S. aureus); His = histidin; Strep-tag = peptid s afinitou ke streptavidinu; PinPoint = fragment proteinu biotinylovaný in vivo v E. coir, MBP = protein vázající maltózu; GST = glutation S-transferáza; Flag = peptid rozpoznávaný enterokinázou; Mab = monoklonální protilátka. Purifikace fúzních proteinu imunoafinitní chromatografií interleukin-2 markerový peptid O ' 8 další proteiny. Výchozí koncentrovaná směs sekretovaných proteinů >-| Polypropylenová podložka Protilátka proti markerovému peptidu i ŕ 1 Markerový peptid se váže k protilátce q 4> Další proteiny procházejí ^ ^ kolonou Fuzni protein je eluován 36 Fágový displej Vystavení proteinů/peptidů na povrchu bakteriofága antibody fragments (scFv) oene 3 protein (minor coat protein) gene 6 protein [minor coat protein) gene 6 protein [major coat protein) antibody genes (for Vh and V|_) gene 3 Phage Library ^^-4-various peptides gene 7 and 9 proteins (minor coat proteins) Proteolytické štěpení fúzního proteinu krevním koagulačním faktorem Xa Rozpoznávací linkerová Místo štěpení sekvence štěpená Xa ... Thr-Ala-Glu-Gly-Gly-Ser-lle-Glu-Gly-Arg-Val-His-Leu ... —Y— 1 í -Y- Část prvního proteinu Funkční protein klonovaného genu Linkerová sekvence není štěpena bakteriálními proteázami Fig. 7-79. Thin sections of E. coli bacteria showing granules of ß-galactosidase/proinsulin fusion peptides (fixed in formaldehyde/glutaraldehyde according to Karnofsky; embedded in Epon; stained with uranylacetate/lead hydroxide; 38 000:1; Courtesy of Dr. W. Wetekam, Hoechst AG). Tři možné způsoby transportu sekretovaných proteinů Vyžadovány 2 ú \ < >> Vliv struktury C-konce Outer membrane Periplasmic space 1 1 Inner membrane Signal Pullulanase Signal peptidase complex peptidase _______ Cytoplasm A. obecná exportní dráha (generál export pathway, GEP) - SP + Sec proteiny (chaperony) B. dráha IgA-proteázy (SP + C-konec proteinu) C. dráha nezávislá na SP - vyžaduje ABC-transportery (ATP-dependentní transportní proteiny) Příklady signálních sekvencí různých proteinů Konec ss -3* -3ij -j> -31 -30 -29 -28 -21 -26 -2S -2'. -23 -2? -?1 - -19 -17 -16 -li -U -13 -'.2 -11 -10 -9 -8 -7 , -6 -5 -t, -3 -2 -V 1*1 Í, 19 -11 "16 -1S "i1* _ld -11 -10 -» _B ~6 -1" -J -f -i |*i 1 et phe leu pre leu leu ala leu leu val leu trp glu pro lys pro ala glu ala Preproinsulin (RatHS) met ala leu trp arg^Iet phe leu pro leu leu ala leu leu val leu Irp glu pro lys pro ala glu ala ^he Pre-lmmunoglobulin-K-light chain (Mousel(S) ^ru^^s^Hne^^^^^^^^n^ln^le^^he^iy^he^e'u^U^Te'u^e'u^he^r^^ly 1 Pre-Lysozyme (ChickenHS) met arg ser leu leu ile leu val leu cys phe leu pro leu ala ala leu gly lys ' i Pre-Grovvth hormone IRafMS) met ala ala asp ser gin fhr pro trp leu leu thr phe ser leu leu cys leu leu trp pro gin glu ala gly ala leu 1 I Pre-Glycoprotein (Vesicular Stomatitis Virus) (M) met lys cys leu leu tyr leu ala phe leu phe ile his val" asn cys lys; 1 Pre-p-Lactamase IpBR 322) (S) met ser ile gin his phe arg val ala leu ile pro phe phe ala ala phe cys leu pro val phe ala his i Pre-Malfose-Binding protein IE. coliJ(S) met lys ile lys thr gly ala arg ile leu ala leu ser ala leu thr thr met met phe ser ala ser ala leu ala lys I Pre-OmpA-Protein IE.col:) (M) met iys lys thr ala ile ala ile ala val ala leu ala gly phe ala thr val ala gin 3la ala 1 Pre-Coat protein (Phage fd}(M) met lys lys ser leu val leu lys ala ser val ala val ala thr leu val pro met leu ser phe ala ala Pre-p-Lactamase met leu lys lys phe ser thr leu lys leu lys lys ala ala ala vat leu leu phe ser cys val ala leu ala gly cys ala asn asn gin thr asn ala ser (Bacillus licheniformis) IS) Fig. 7-78. Amino acid sequences of N-terminal signal sequences of various precursors for membrane proteins (M), and a variety of secretory proteins (S). The vertical line indicates the transition from hydrophilic to hydrophobic regions within the signal sequences, the arrow the start of the mature proteins. N-konec obsahující polární aminokyseliny Místo štěpení SP 1 i 1 Hydrofobní aminokyseliny Zralý protein 41 Instabilita vektorů 1- Segregační instabilita: Ztráta plazmidu, ke které může dojít při dělení buněk v důsledku: chybění funkce par (partitioning) u některých vektorů (pBR322), která zaručuje rovnoměrné dělení kopií do dceřinných buněk. Problém lze řešit selekcí antibiotiky, nebo lze oblast par klonovat, např. z pSC101 do pBR322 a tím plazmidy stabilizovat, vytváření multimerních forem plazmidu a následné nerovnoměrné dědění kopií do dceřiných buněk. Multimerní plazmidy nevznikají u ColE1, který využívá rekombinační systém cer xer, který rozkládá multimery. Toto místo lze klonovat do plazmidu typu pBR322 a eliminovat problémy s multimerizací. Možnou strategií pro překonání segregační instability je eliminace buněk, které plazmid ztratily (např. použití genu cl fága v klonovacím vektoru a využití lyzogenních hostitelů) 2. Strukturní instabilita: Důsledek delecí, inzercí nebo translokací v chromozomech, plazmidech nebo virech (homologní rekombinace a transpozice). 49 Překonání segregační instability vektoru eliminací buněk, které vektor ztratily 1. krok Ztráta vektoru i Indukce profága Represor cl vytvářený rekombinantním vektorem udržuje buňku v lyzogenním stavu 43 Lyže buněk Vektory s dvojím počátkem replikace pro regulaci počtu kopií vektoru P-RNAII nahrazen P-lambda Počátek replikace zajišťující vysoký počet kopií Nízkokopiový počátek replikace ori pSCIOl 30*0 - aktivní je pouze ori pSC101 4 kopie plazmidu/ chromozom indukce (o ooooo o f 1 >—s í "\ inactive repressor f\ °áo°ooaoo^ holt: X 8l{5? lyeegen 42 8 9 J Multicopy plasmid (20-40 kopií) Activita (U/mL rostoucích buněk) 500 2,300 3,100 3,400 4,400 700 Gen pro a-amylázu z B. amyloliquefaciens byl vložen do oblasti pocházející z chromozomu B. subtilis nakloňované v plazmidu E. coli, konstrukt byl vnesen do B. subtilis. Plazmid nesl rovněž geny pro rezistenci k chloramfenikolu a ampicilinu. Buňky B. subtilis s plazmidem byly pěstovány v prostředí s chloramfenikolem, což vedlo k selekci buněk se zvýšeným počtem kopií integrovaného plazmidu, tím zvýšení počtu kopií genu pro amylázu a ke zvýšení jejího množství v buňkách. 50 Struktura rozpoznávací sekvence lox P fága P1 TCGTATA > GCATACAT< TATACGAAGTTAT A^AACI-CSTATA GCArACAT(^ATAGGAAGT7flT ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ | ATAACTTČOWA) GGATAÍ AI rATACCAAO" 1*1 i Podle orientace loxP sekvencí je úsek DNA mezi nimi místně specifickou rekombinací prostřednictvím Cre-rekombinázy buď deletován nebo invertován 51 Struktura rozpoznávací sekvence lox P fága P1 TCGTÁTA > GCATACAT< TATACGAAGTTAT A^AACI-CSTATA GCArACAT(^ATAGGAAGT7flT ^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ | ATAACTTČOWA) GGATAÍ AI rATACCAAQ-IKI i Podle orientace loxP sekvencí je úsek DNA mezi nimi místně specifickou rekombinací prostřednictvím Cre-rekombinázy buď deletován nebo invertován 52 Odstranění selekčního markeru po vnesení plazmidu do bakteriálního chromozomu Marker ioxP gene loxP Site of recombination Cloned gene Plasmid Homologous chromosomal DNA Homologous recombination m- + Cre protein m- Gen cre je na samostatném plazmidu pod kontrolou lac promotoru (indukce IPTG) mom i— 53 Vlivy prostředí ovlivňující expresi genů a tvorbu produktů 1. Složení kultivačního media, zdroje živin (laktóza x glukóza - ovlivňují inducibilní systémy - lac) 2. Teplota (při nižší teplotě bývají cizí proteiny méně toxické) 3. pH 4. Koncentrace kyslíku 54 Důkaz tvorby cizorodého produktu • Imunologické testy • Enzymové testy • SDS-PAGE • Minibuňky • Maxibuňky • Transkripce a translace in vitro 55 Až 80% problému při klonování cizorodých genů spočívá v toxicitě proteinů, zbývajících 20% je způsobeno jinými faktory (např. využívání kodonů) - Toxicita jednotlivých typů rekombinantních molekul pro hostitelské buňky: Rekombinantní DNA není obvykle „toxická", pokud neobsahuje repetitivní sekvence (méně než 1% případů) Funkční rekombinantní RNA může být toxická (asi 15% případů) Toxické proteiny (více než 80% případů) - normálně je protein vytvářen v určitém kompartmentu buňky, během definované časové periody a v určitém množství (prostorová, časová a kvantitativní exprese) - rekombinantní proteiny jsou vytvářeny do nefyziologických koncentrací - funkce rekombinantních proteinů může být pro buňky škodlivá až toxická -pomalejší růst buněk, nižší hustota buněk 56 57 58 59