1 Aplikace genového inženýrství – příprava farmakologicky nebo průmyslově významných látek • Hormony, • Růstové faktory • Vakcíny, • DNA-vakcíny • Protilátky, • Abzymy, • Imunotoxiny • Další biologicky aktivní látky (interferon, krevní srážecí faktory aj) 2 Gen pro inzulin pre-mRNA mRNA pro pre-proinzulin pre-proinzulin preprohormon proinzulin prohormon aktivní inzulin zralý hormon DNA řetězec C řetězec C řetězec C řetězec B řetězec A řetězec A řetězec A řetězec B Enzymové štěpení řetězec B pre-sekvence mRNA ribozom Translace Sestřih Transkripce 3 Příprava lidského inzulinu v bakteriálních buňkách CNBr štěpí peptidovou vazbu následující za metioninem Transformace E. coli Působení kyanbromidem (CNBr) Purifikace řetězců A a B Beta-galaktozidáza Purifikace fúzního proteinu B-gal-inzulín Kultura buněk Aminotermální část zralého řetězce B Vytvoření aktivní formy inzulínu disulfidová vazba Aktivní inzulín řetězec Břetězec A řetězec Břetězec ABakteriální promotor 4 Příprava lidského růstového hormonu (hGH) v bakteriích Met není u přirozeného hGH Příprava formy hGH sekretované v bakteriálních buňkách 5 Příprava tkáňového aktivátoru plazminogenu (tPA) P T Amplifikace genů tPA tPA Štěpení plazminogenu plazmin Degradace fibrinu – rozpouštění krevních sraženin Komerční výroba 6 Přehled hlavních typů vakcín A. vakcíny vyrobené tradiční technologií: - živá vakcína -- virulentní (dnes se již nepoužívá) -- heterologní (příbuzný patogen) -- atenuovaná - inaktivovaná vakcína -- celobuněčná -- toxoidová (toxin zbavený toxicity) - subjednotková -- s purifikovaným antigenem -- se syntetickým antigenem -- ribozomální B. rekombinantní vakcíny: - subjednotková -- s deletovaným genem -- vektorová C. DNA vakcíny D. antiidiotypové vakcíny - Vakcína připravená z protilátek, které považují jiné protilátky za antigen a navážou se na ně. Antiidiotypové vakcíny mohou stimulovat organizmus k vytváření protilátky proti nádorovým buňkám 7 Konvenční způsoby vakcinace a DNA-vakcinace 8 Reverzní vakcinologie -Stanovení kompletní sekvence genomu patogena -Vyhledání genů kódujících potenciální antigeny pomocí bioinformatických nástrojů – proteiny s mimobuněčnou lokalizací, signální peptidy, epitopy B-buněk -Příprava produktů těchto genů a jejich testování -Vakcína proti meningitidě (MenB) -Streptococcus pneumoniae -Staphylococcus aureus -Chlamydia pneumoniae 9 Příprava podjednotkové vakcíny viru HBV v kvasinkách Infekční částice HBV Plášťový protein Klonovaná DNA viru HBV Izolace sekvence kódující HBsAg Kvasinkový promotor transkripce Vnitřní protein Ligace Počátek replikace pro kvasinky Počátek replikace pro bakterie Kvasinkový expresní vektor Kvasinkový terminátor transkripce Transformace kvasinkových buněk Selekce buněk, které obsahují plazmid Kultura buněk ve fermentoru Shromáždění buněk centrigací Rozbití kvasinkových buněk Purifikace částic HBsAg Výhody: 1. Přesně definovaný antigen 2. Stabilní, skladovatelný 3. Nevyvolává vedlejší účinky Nevýhody 1. Drahá purifikace 2. Odlišná konformace proteinu 10 11 Product Company Therapeutic indication Date approved Příklady rekombinantních vakcín (vakcín obsahujících rekombinantní antigeny) 12 Vazba na receptory mukózy vlastní toxin Struktura choleratoxinu Strategie pro vytvoření delece části peptidu A1 choleratoxinu – příprava kandidátního vakcinačního kmene Vyštěpení části sekvence kódující peptid A1 (klonované v plazmidovém vektoru) – vyštěpí se ~ 90% aminokyselin) Cirkularizace vektoru (připojení XbaI-linkeru, štěpení XbaI, ligace) Přenos vektoru do kmene, v němž je uvnitř genu pro A1 začleněn gen pro rezistenci k tetracyklinu (A1 je inaktivován, buňky jsou TetR) – potenciální reverze A1 vyčleněním tetR – proto není vhodný jako vakcína Vektor se po několika generacích spontánně vyředí Selekce buněk TetS, obsahujících deletovanou formu A1 – tyto buňky tvoří složku A2 a B, a jsou proto imunogenní – reverze není možná Vibrio cholerae 13 Příprava podjednotkové vakcíny proti HSV v buňkách CHO (chinese hamster ovary) Glykoprotein D (gD) imunogenní složka HSV HSV – onkogenní virus, sexuálně přenosná onemocnění, encefalitida, infekce oka Membránově vázaná forma, 14 Úprava genu pro plášťový glykoprotein (gD) HSV pro získání rozpustné formy gD Kompletní gen pro gD obsahující C-terminální úsek kódující transmembránovou doménu – tato forma gD je obtížně purifikovatelná V genu pro gD byla oblast kódující transmembránovou doménu deletována, výsledný produkt je rozpustný a lze jej snáze purifikovat Klonování a exprese genu v savčích expresních systémech (CHO) 15 Využití patogenního druhu Shigella flexneri jako živého vektoru k přenosu DNA pro genetickou imunizaci do savčích epiteliálních buněk Exprese klonovaného genu v cytoplazmě (!euk. P), tvorba produktu, imunizace Aspartát β- semialdehyd dehydrogenáza Perorální podání Buňky invadují do epiteliálních buněk, ale nemnoží se – vhodný vektor pro přenos DNA Patogenní bakterie – nelze použít k vnesení imunizační DNA ~ nepatogenní bakterie Bakterie není patogenní, nemnoží se, plazmid přechází do cytoplazmy host. buněk Plazmidová DNA s genem pro antigen Deleční mutant 16 Struktura protilátky Fab (antigen binding fragment) Fc Fv Papain (hydrolýza) 17 Části IgG Fc = interakce s buněčnými receptory a komplementem Fab = obsahuje vazebné místo pro Ag. Řetězce jsou spojeny disulfidickými můstky Fv = část Fab, váže antigen. Řetězce jsou spojeny flexibilním peptidovým linkerem nebo nově vytvořenou disulfidickou vazbou Funkční části protilátky 18 19 Stejný primer pro všechny Kombinace milionů klonů pro těžké a pro lehké řetězce Klonování cDNA pro přípravu rekombinantních protilátek Soubor cDNA pro těžké řetězce Lymfocyty získané z imunizované myši (přeskupené geny) Soubor degenerovaných 5´-primerů klonovaná cDNA pro těžký řetězec, stejným způsobem se klonuje cDNA pro lehký řetězec 20 Příprava specifické protilátky Příprava milionů cDNA nesoucích informaci pro L a H řetězce Amplifikace genů pro L a H řetězce pomocí PCR, klonování do fágového vektoru Každý fág obsahuje náhodnou kombinaci L a H Soubor fágů představující kombinatorickou fágovou knihovnu Překlonování do expresního savčího nebo bakteriálního vektoru Miliony „monoklonálních“ protilátek 21 Příprava kombinatorické knihovny VL- a VH- oblastí protilátek v E. coli ve vektoru lambda Lidské B-lymfocyty PCR cDNA H a L řetězců mají odlišná místa pro různé RE, což umožňuje jejich oddělené klonování Mnoho různých kombinací – každý „kombinatorický vektor“ obsahuje jednu kombinaci. selekce Využití v diagnostice/terapii Překlonování vybraných kombinací do plazmidu (fág buňky lyzuje a není možné získat větší množství produktu) 22 Konstrukce kombinatorické knihovny Fv ve vektoru bakteriofága lambda cDNA řetězců L a H separátně klonované ve vektorech lambda (knihovny L-řetězců a H-řetězců) Ligace jednotlivých L a H řetězců a jejich klonování v lambda vektoru 23 Vytvoření kombinatorické knihovny Fv protilátek ve vektoru fága M13 (fágemidech) Klonováním do genu 3 vzniká fúzní protein, který je lokalizován na povrchu fága Spojovací peptid Selekce (ELISA-like) 24 • Lidské chromozomy v hybridomech vytvořených po fúzi lidských lymfocytů s myšími myelomovými buňkami jsou nestabilní, takže se takové hybridomy produkující monoklonální protilátky vytvářejí jen vzácně • Nejsou k dispozici linie lidských myelomových buněk, které by mohly nahradit myší myelomové buňky při tvorbě hybridomů • I kdyby bylo možné vytvářet lidské hybridomové buněčné linie, bylo by to proti lékařským etickým zásadám (injikování specifických antigenů do člověk za účelem jiným než terapeutickým, a odběr části sleziny pro získání lymfocytů) Transgenní myši s geny pro lidské imunoglobuliny v YAC (jejich vlastní geny pro Ig knokautovány, pak imunizace, např. tetanotoxinem – tvoří lidské protilátky) Důvod pro přípravu humanizovaných protilátek: obtížná příprava lidských monoklonálních protilátek konvenční hybridomovou technologií 25 Příprava humanizovaných protilátek Myší protilátka Chimerická protilátka Humanizovaná protilátka Variabilní, konstantní a hypervariabilní oblasti jsou z protilátek myši Konstantní oblast je z lidské protilátky, variabilní a hypervariabilní oblasti jsou z myši Hypervariabilní oblasti jsou z myších protilátek, ostatní jsou lidské – zvýšení specifity mutacemi CDR CDRs -complementarity determining regions 65% lidské 95% lidské 26 Lidské protilátky Human monoclonal antibodies (umab) Jsou připravovány z transgenních myší, do jejichž genomu jsou přeneseny lidské geny pro imunoglobuliny. Tyto myši jsou následně imunizovány požadovaným antigenem a produkují pak monoklonální protilátky. Ty jsou pak in vitro použity k přípravě plně humánních protilátek. 27 Protilátka vázající se na antigeny na povrchu tumorových buněk Protilátka vázající se na antigen na povrchu T buněk manipulace na úrovni cDNA rekombinace protilátka s dvojí specifitou Tumorová buňka T buňka T buňka usmrcuje tumorovou buňku Protilátka s dvojí specifitou 28 scFv - single chain antibody variable region fragments (SCA) scFv – terapeutické agents – nové vazebné schopnosti, nižší imunogenicita v důsledku chybění Fc domény, snadnější penetrace do cílového místa (pevné nádory atp). Linker je nutný pro vytvoření konformace schopné vázat antigen Disulfidické můstky (glycin4serin)3 a) b) c) 29 Schematické znázornění struktury „single-chain“ Fv imunotoxinů (scFv) Záměna peptidového linkeru za disulfidický můstek několikanásobně zvyšuje stabilitu scFv a tím zlepšuje jeho terapeutické využití - exotoxin A Pseudomonas - difterický toxin - ricin Protinádorové působení (vazba na receptory a povrchové proteiny nádorových buněk) Např. fúzní protein HER2-Ig + exotoxin Pseudomonas Pbs21 (plasmodium) + Shiva-1 A B human epidermal growth factor receptor 2 -Approximately 30% of breast cancers have an amplification of the HER2/neu gene or overexpression of its protein product. 10-25 aa 30 Terapeutické protilátky Aktivace plazminogenu na plazmin, degradace fibrinu Figure 10.16 Structure of an immunotherapeutic thrombolytic agent. Antifibrin antibody, a monoclonal antibody that is specific for the fibrin found in blood clots, is coupled to plasminogen activator (PA). After the complex binds to the fibrin of a blood clot, the plasminogen activator causes plasmin to accumulate in the vicinity of the clot. The plasmin then degrades the clot. Struktura imunoterapeutické trombolytické protilátky. Antifibrinová protilátka (monoklonální protilátka specifická pro fibrin, který se nachází v krevní sraženině) je vázána s aktivátorem plazminogenu (PA). Když se protilátka naváže na fibrin, PA vede k akumulaci plazminu v blízkosti sraženiny. Plazmin (proteáza fibrinolyzin) pak degraduje krevní sraženinu. 31 Date of approval Type of antibody Company Therapeutic use Some therapeutic monoclonal antibodies that have been approved for human use in either the United States or European Union 32 -omab = myší; -ximab, -zumab = chimerická, humanizovaná; -umab = humánní Příklady schválených terapeutických monoklonálních protilátek 33 B = vazebná doména; T = translokační doména; A = doména s aktivitou Toxiny používané pro přípravi imunotoxinů PE DT 34 1. generace: toxin připojen chemicky disulfidickými vazbami 2. Generace: toxiny zbaveny domény pro vazbu na normální endoteliální buňky 3. Generace: Rekombinantní imunotoxiny. scFv. Vzhledem k aktivitě toxinu na eukaryotické buňky musí být připravovány v bakteriích (E. coli) Etapy vývoje imunotoxinů 35 Rekombinantní imunotoxin se váže na antigeny na povrchu nádorové buňky, endocytózou se dostavá dovnitř, kde toxin zasáhne životně důležité funkce. Endocytóza imunotoxinu a jeho působení na nádorové buňky 36 Pathways of binding, internalization, and processing by immunotoxins leading to the killing of target cells. Shown are ricin-, Pseudomonas- and diphtheria-based immunotoxins. Immunotoxins bind the target antigen, are internalized via clathrin-coated pits, and are processed within endosomal compartments. Ricin and Pseudomonas toxin derivatives must traffic through the endoplasmic reticulum to the cytosol where they enzymatically inactivate protein synthesis. Pseudomonas exotoxin A ADP-ribosylates EF2, while ricin depurinates ribosomal RNA. Diphtheria-based toxins are internalized to endosomes where the A chain of the toxin translocates directly to the cytosol and ADP-ribosylates EF2. Cell death follows inhibition of protein synthesis. dgA: deglycosylated ricin A chain; EF2: elongation factor 2. 37 • An abzyme (from antibody and enzyme), also called catmab (from catalytic monoclonal antibody), is a monoclonal antibody with catalytic activity. Molecules which are modified to gain new catalytic activity are called synzymes. Abzymes are usually artificial constructs, but are also found in normal humans (antivasoactive intestinal peptide autoantibodies) and in patients with the autoimmune disease systemic lupus erythematosus, where they can bind and hydrolyze DNA. Abzymes are potential tools in biotechnology, e.g., to perform specific actions on DNA. • Enzymes function by lowering the activation energy of the transition state, thereby catalyzing the formation of an otherwiseless-favorable molecular intermediate between reactants and products. If an antibody is developed to a stable molecule that's similar to an unstable intermediate of another (potentially unrelated) reaction, the developed antibody will enzymatically bind to and stabilize the intermediate state, thus catalyzing the reaction. 38 Abzym (Ab-enzym) catmab (catalytic monoclonal antibody) Reaction course Energy Hydrolýza esteru Snížení aktivační energie enzymem nebo abzymem Fosfonátový ester 39 Izolace celkové mRNA RT-PCR cDNA Amplifikace variabilních oblastí L a H řetězců Klonování a skríning Příprava protilátky s enzymovou aktivitou (abzymu) Konjugace analogu k nosičovému proteinu 40 Protilátka (abzym) dopraví enzym k receptorům na nádorovým buňkách, kde enzym konvertuje netoxický prekurzor (prodrug) na látku, která účinně nádorové buňky usmrcuje. Tím je omezen toxický účinek na normální buňky. Princip Antibody-Directed Abzyme Prodrug Therapy (ADEPT) The use of abzymes at industrial scale for specific synthesis of molecules is still at the laboratory step, even if some firms like Novartis (Switzerland) or Bristol-Myer Squibb (USA) have shown their interest for using the aldolase abzyme, produced in the Lerner's group, for synthesis of Epothilone A, a new anti-cancer compound. 41 Antibody-Directed Abzyme Prodrug Therapy (ADEPT) – enzymová aktivita abzymu aktivuje prekurzor léčivé látky a tu pak dopravují do blízkosti nádorové buňky 42 Another example of medical application concerns antibodies that specifically hydrolyze cocaine. A commercialization agreement between Columbia University and Ixsys Inc. could allow to use abzymes for treating cocaine overdose and addiction. Perhaps the most exciting application of abzyme technology is the specific targeting of cancer cells for destruction. Cancer cells contain unique determinants, called tumor cell antigens, on their surface that are lacking in normal cells. By utilizing antibodies that specifically bind these tumor cell antigens, cancer drugs can be delivered directly to the tumor. In the case of abzymes, scientists have envisioned antibodies with two distinct antigen binding sites (Figure 4): one site binds with high affinity to a tumor cell antigen, while the second site catalyzes the cleavage of a prodrug. The prodrug is a non-toxic precursor of a cytotoxic drug. First, the antibody is administered to patients, and it binds the tumor cells with high affinity. Secondly, the prodrug is introduced into the bloodstream, but only becomes activated in the vicinity of the targeted antibody. By this technique, tumors are selectively destroyed while healthy cells are spared from the toxic affect of cancer drugs. 43 Potenciální léčba AIDS pomocí abzymu Byl připraven abzym degradující vazebnou oblast proteinu gp120 viru HIV. Tato oblast je jediná část viru HIV, která se u jednotlivých kmenů nemění, neboť je nezbytná pro vazbu viru na T- lymfocyty. Abzym působí opakovaně, po inaktivaci jedné virové částice destruuje další (může zničit až tisíce virů) 44 Přenos DNA: • biolistická metoda: rekombinantní plazmid (E. coli) nesoucí gen pro antigen pod kontrolou virového promotoru je vnesen např. do boltce myši • injekce velkých množství DNA (100 mg rek. plazmidu) přímo do svalů zvířat – účinnost přenosu až 70% • elektroporace Výhody: • Nehrozí reverze: není použit živý nebo oslabený patogen • antigen je správně posttranslačně upraven a není třeba jej purifikovat • na jednom plazmidu mohou být v jednom kroku přeneseny geny pro více antigenů • Snadné skladování, stabilita DNA Nevýhoda: • neznalost osudu přenesené DNA v buňkách, začlenění do genomu hostitele a přerušení genů – proto je výhodnější transientní exprese (extrachromozomální stav) Příklady virových antigenů: chřipka, HIV, bovinní HV, vzteklina, HBV, rotavirus, slintavka a kulhavka, aj. Bakteriální antigeny: Clostridium tetani, Mycobacterium tuberculosis, Genetická imunizace - DNA vakcíny Gen kódující antigen je vnesen do buněk zvířete, v nichž je pak tento antigen produkován a zvíře vytváří protilátky. 45 Navázání plazmidové DNA na kationty povrchu polymerových mikročástic Plazmidová DNA je navázána na biodegradovatelné mikročástice polymerů (0,3- 1,5 µm), z nichž se postupně uvolňuje (1. den 35%, 14. den 75%). Průběžně dochází k expresi antigenu – účinnost je vyšší než při injekci volné DNA stačí zhruba 250x méně DNA). 46 A. Využití mutageneze in vitro pro záměnu klíčových aminokyselin (bodové mutace) • zvýšení termostability proteinů (lysozym aj) • rezistence proteinů k oxidativnímu stresu • zvýšení bioaktivity proteinů druhá generace farmak s vylepšenou farmakokinetikou, strukturou, stabilitou a biologickou dostupností (inzulin – zvýšení schopnosti absorpce, tkáňový plazminogenový aktivátoru – zvýšení poločasu oběhu) Příklad: Subtilizin – hydrolýza proteinů, např. v detergentech prakticky každá vlastnost této serinové proteázy byla pozměněna/optimalizována: • rychlost katalýzy, • substrátová specifita, • tolerance k pH, • tolerance k oxidačním látkám, • termostabilita. • zvýšená stabilita v org. rozpouštědlech (změna konformace proteinu) Proteinové inženýrství Navrhování, vyvíjení a příprava proteinů s vylepšenými charakteristikami (pozměněné nebo zcela nové proteiny) 47 • Klenowův fragment DNA polymerázy, který postrádá 3´-5´ exonukleázovou aktivitu. • Přidání aminokyselin = stabilizace cizích proteinů v E. coli. • Zvýšení afinity proteinů k iontům kovů vložením sekvence His-X3-His do alfa-helixu – zvýšení rezistence k denaturaci. • Jeden gen je fúzován s druhým za vzniku kompletně nového proteinu. Varianty protilátek – jednořetězcové protilátky (SCA – single chain antibodies) jsou umělé protilátky složené z vazebných oblastí těžkého a lehkého řetězce, které jsou spojeny chemicky a vytvářeny v mikroorganismech pomocí expresních vektorů. • Příprava purifikovaných imunogenních složek v prokaryotických nebo eukaryotických systémech (vakcína proti hepatitidě B ve kvasinkách, vakcína proti Salmonella typhimurium – oslabení kmene vnesením mutace do genomu) • Nepatogenní mikroorganismy použité jako vektory pro expresi cizích genů zodpovědných za imunogenicitu (rekombinantní vakcíny, které stabilně exprimují cizí geny: u Vibrio cholerae byl připraven kmen s delecí v genu pro cholerový toxin – mutace byla vnesena rekombinací do standardního kmene. Výsledný kmen produkoval imunogenní, avšak netoxický „toxin“ (netoxickou B podjednotku toxinu). • viry jako vektory pro expresi imunologicky aktivních proteinů (virus vakcinie – rekombinantní vakcíny proti vzteklině) B. Makromodifikace proteinů Část genu se eliminuje vyštěpením restrikčního fragmentu nebo nahradí chemickou syntézou části genu. 48 • Genetickou úpravou lze připravit bakterii, která by produkovala modré barvivo používané na džínovinu. Výroba barviva by byla mnohem ekologičtější nežli současná chemická syntéza, která ročně produkuje asi 16 000 tun tohoto barviva. • Podle evropské legislativy budou muset být takové džíny na viditelném místě označeny nápisem: "Vyrobeno z geneticky modifikovaných organismů". 49 50