Epigenetické procesy probíhající v buněčných jádrech. Eva Bártová Biofyzikální ústav AV ČR Brno What is epigenetics ? Epigenetics refers to heritable changes in the phenotype that occur irrespective of alterations in the DNA sequences. Berger et al., Genes Dev., 2009 Epigenator: emanates from the environment and triggers and Intracellular pathway. Epigenetic signaling pathway could be a protein-protein interaction or modification-based events. Epigenetic initiator: signal, which responds to the Epigenator and is necessary to define the precise location of epigenetic chromatin environment. Initiator could be DNA-binding protein, noncoding RNA, factor that coordinates chromatin structure. Epigenetic Maintainer: signal, which sustained the chromatin environment in the first and subsequent generation. It is DNA methylation, histone modification, histone variants, nucleosome positioning. (Berger S. et al., 2009) 1. Buňka může existovat i bez významně redukovaného množství H1. 2. H1 varianty nejsou hlavní determinanty buněčného fenotypu. 3. Funkce H1 variant je nejenom při utlumení transkripční aktivity ale také při její aktivaci (může snižovat nebo i zvyšovat expresi specifických genů. 4. H1 hraje důležitou úlohu v kondensaci chromatinu. Spíše je důležitý pro stabilizaci nukleosomů než pro vlastní řízení kondenzace chromatinu. 5. Experimentálně navozená redukce H1 vede ke zkrácení linkerové DNA The linker histone H1 is involved in maintaining higher-order chromatin structures and displays dynamic nuclear mobility, which may be regulated by posttranslational modifications. H1 tail phosphorylation play in important role. Using the technique of fluorescence recovery after photobleaching, Contreres et al., 2003 observed that the mobility of a GFP-wild-type H1 fusion protein is dependent on Cdk2 activity. GFP-H1 mobility was decreased in cells with low Cdk2 activity but not in the cells with bloked phophorylation of H1. Decreased the mobility of GFP-H1. Overexpression p21 GFP-H1b GFP-M1-5 Varianty histonů H1: varianty H1o, H5 a testis-specific varianta H1. varianty H1 se různě uplatňují během buněčného cyklu, diferenciace a vývoje. RA diferenciace myších F9 je doprovázena zvýšenou transkripci histonu H1o. H2A: H2A.X, H2A.Z, MacroH2A, H2A-Bbd, H2AvD, H2A.X. varianta H2A.Z je konzervativní během evoluce. Macro H2A se vyskytuje u Xi, zatímco H2A-Bbd u Xa chromosomu a autosomů. H2A.Z se vyskytuje v intergenických oblastech. H2B: nemá varianty, uplatňuje se při regulaci kondenzace chromatinu, represi transkripce a během gametogeneze, H2B je zodpovědný za uspořádání chromatinu u spermií – nahrazení histonů protaniny . Varianty histonů H3: existují dvě hlavní Varianty H3.3 a centromerické varianty H3 (cenH3) = CENP-A-Z: jsou zodpovědné za vazbu kinetochoru a segregaci sesterských chromatid u eukaryot Varianty histonů H3: phosphorylation of CENP-A on Ser-7 is essential for kinetochore function. Overexpression of CENP-A plays an important role for aneuploidy in colorectal cancers. Varianty histonů H4: většina genů kódujících hlavní histonové proteiny jsou exprimovány během S fáze buněčného cyklu. V případě H4, geny jsou konstitutivně exprimovány během buněčného cyklu. Pro H4 nejsou známy žádné varianty. Úpravy pre-mRNA histonů probíhají v Cajal bodies. Biochemické modifikace histonů Vztah mezi acetylací a metylací histonů: acetylace histonů je katalyzována histon acetyltransferázami (HATs) a odstraňována histon deacetylázami (HDACs). HDACs odstraní acetylskupinu, která je nahrazena methyl skupinou za účasti HMTs (Suv39H1- human, Clr4 – S.pombe) 2004: Objev demethylace histonů za účasti aminové oxidasy LSD1 (KIAA0601) (Shi et al., Cell 2004). LSD1 specificky demethyluje H3 (K4), epigenetickou modifikaci zodpovědnou za transkripční aktivitu. HATs: HAT1, PCAF, CBP/p300, TFIIC90, ELP3, SRC1, CLOCK (see Allis et al., 2007). HDACs: Class I, II, III HMTs: SUV39H1, SUV39H2, G9a, MLL1, hSet 1, hSet 2, SUV4- 20H1, SUV4-20H2, EZH2 (PcG silencing) Demethylases: LSD1 (transcriptional activation), JHDM1b (H3K4me3), Jmjd2b (H3K9me3), JHDM2a, JMJ D2B (heterochromatin formation) HP1 protein HMTs: D. melanogaster: Su(var)3-9 je lokalizován v oblastech kondenzovaného chromatinu a je to klíčový regulátor v organizaci represivního chromatinu. Homolog u S.pombe je Clr4 umyší SUV39h1 a u lidských buněk SUV39H1. Tyto HMTs specificky methylují H3(K9). HP1 protein CD: protein-chromatin CSD: protein-protein HD: HP1-to-DNA and linker histones H3K9me1/me2/me3 Primárním důsledkem histonových modifikací je snížení schopnosti histonových konců interagovat s dalšími složkami chromatinu, včetně DNA. Activity Inactivity Ikaros, Helios H3K27me3 Inaktivace X chromosomu ve vztahu k epigenetickým modifikacím Chadwick nad Willard, PNAS, 101, p.17450-17455 Inaktivace X chromosomu ve vztahu k epigenetickým modifikacím MeCP2: Methyl-CpG binding Protein, specifically binds to to methylated DNA INAKTIVITY IMPRINTING Myší embryo: samičí alela je zamethylována, nevyjadřuje se Dospělý jedinec: obě alely jsou demethylovány Gametogeneze: se obnoví původní stav Platí pro gen IGF II. ISSN1471-0056 Methylation state of telomeres (Cbx1=HP1b, Cbx3=HP1g, Cbx5 = HP1a) a-4x-methyl H3(K9) FAKULTATIVNÍ HETEROCHROMATIN Polycomb group (PcG) proteins are highly conserved regulatory factors that were initially discovered in Drosophila. PcG genes are best known for their role in maintaining silent expression states of Hox genes during development, while trithorax group (trxG) proteins maintain Hox gene expression patterns in the appropriate spatial domains. PcG and trxG proteins are also involved in the regulation of normal cell proliferation, and their mutation has been linked to defects in stem cell fates and to cancer. They act by regulating chromatin structure and chromosome architecture at their target loci. H2AK119Ub K27 K27me3 H2AK119Ub1 PcG – related proteins GFP-BMI1 Experiments of Gabriela Galiová DNA repair Chou et al., PNAS (2010) Experiments of Gabriela Galiová and Lenka Stixová Experiments of Gabriela Šustáčková and Lenka Stixová HP1 proteins •HP1 proteiny jsou hlavní složkou heterochromatinu a hrají důležitou úlohu při jeho tvorbě. HPs jsou mají vysokou afinitu k pericentromerickým a telometrickým oblastem chromosomů. • HPs interagují s HMTs jako je SUV39h1 a SUV39h2, která jsou zodpovědné za methylaci H3(K9). HPs se skládají z vysoce konzervativních oblastí: a) N-terminální chromodomény (CD) b) strukturálně odvozené C-terminální chromoshadow domény (CSD) FUNKCE HP1s a) Uspořádání chromatinu b) Regulace transkripce c) Optimální regulace délky telomer a zprostředkování procesu telomeric silencing HP1b HP1 proteiny u ECS HP1a HP1b Metoda IHC E1 Snímek 50 E1 Eva; 29. 2. 2016 Ligation mediated PCR Centrum základního výzkumu pro monoklonální gamapatie a mnohočetný myelom LC 06027 Shrnutí problematiky 1. Organizace chromatinu, struktura nukleosomů 2. Varianty histonů 3. Epigenetické modifikace histonů a jejich funkce 4. Epigenetické modifikace centromer, Xi a telomer 5. HP1 protein a jeho sub-typy – struktura a funkce 6. Účinky HDACi 7. Methylace DNA versus methylace histonů