Cytologie 2 Aleš Hampl 2017 • Mitochondrie • Lyzosomy + Peroxisomy • Buněčné inkluze • Cytoskelet • Úprava buněčného povrchu • Buněčný cyklus, dělení buňky a diferenciace buněk organely inkluze cytoplazma cytoskelet základní cytoplazma buňka karyoplazma (jádro) Mitochondrie 1 • ve všech buňkách vyjma erytrocytů • dvojmembrána • průměr cca 0,5 m • délka až 50 (100) m • oxidativní metabolismus (glukóza – ATP + CO2 + H20) • cytochrom c – aktivace apoptické dráhy • původ ve vajíčku • mtDNA (cirkulární) • hnědá tuková tkáň – produkce tepla • obě membrány s nízkou fluiditou • obě membrány osazeny mnoha proteiny • růst a dělení mitochondrií Mezimembránový prostor Mitochondrie 2 Mitochondrie 3 s kristami s tubuly (v endokrinních steroidy produkujících buňkách) mitochondrie mikrotubuly Mitochondrie 4 Lyzosomy 1 endozomo-lyzosomový systém • ve všech buňkách vyjma erytrocytů • váčky cca 0,05 – 0,5 m • obdány membránou • uvnitř kyselé prostředí (cca pH 5) • uvnitř enzymy (min. 50 typů) • označení manózo-6-fosfátem Lyzosomy 2 primární x sekundární • primární • sekundární (fagolyzosomy a autofagické vakuoly) • reziduální tělíska (lipofuscin) sekundární lyzosomy Lyzosomy 3 Peroxisomy • strukturně podobné lyzozomům • funkčně příbuzné mitochondriím • „jádro“ = nukleoid • odbourávání mastných kyselin (H202, H2O, 02) • detoxifikace (doplňují funkce SER) • vznik: pučení z ER nebo dělení peroxisom lyzosom nukleoid Buněčné (cytoplazmatické) inkluze 1 • sekreční granula • zásobní látky: cukry (glykogen), tuky • krystaly (bílkoviny) • pigmenty: endogenní (autogenní a hematogenní) + exogenní Buněčné (cytoplazmatické) inkluze 2 Sekreční granula Sekreční granula Golgiho aparát Drsné ER Buněčné (cytoplazmatické) inkluze 3 Lipidové inkluze Buněčné (cytoplazmatické) inkluze 4 Glykogen β-granula α-granula Buněčné (cytoplazmatické) inkluze 5 Glykogen Glykogen v buňkách jater (světelný mikroskop; periodic acid-Schiff reakce) Buněčné (cytoplazmatické) inkluze 6 Krystaly Bílkovinné inkluze v Leydigových buňkách Buněčné (cytoplazmatické) inkluze 7 Pigmenty (barevné inkluze): Exogenní x Endogenní • Autogenní Specifické funkce – melanin • Hematogenní Rozklad hemoglobinu – hemosiderin, biliverdin, bilirubin Pigment z opotřebování lipofuscin - akumulace residuálních tělísek v dlouhožijících buňkách (neurony, kardiomyocyty) Cytoskelet 1 Mikrotubuly Intermediární filamenta Mikrofilamenta (aktinová) 25 nm 10 nm 7 nm mikrotubuly mikrofilamenta - aktin Cytoskelet 2 Mikrofilamenta (aktinová) G-aktin (globulární) F-aktin (fibrilární) • různé izoformy aktinu () • rychlá polymerizace a depolymerizace • polarizace (+ a – konce) • stabilizace asociovanými proteiny (tropomyosin – myofibrily) • síťování asociovanými proteiny (fimbrin, filamin, …) • ukotvení do membrány (vinculin, tallin, …) • kortikální aktin – membránový skelet Cytoskelet 3 Mikrotubuly • duté válce • -tubulin + -tubulin – dimery • rychlá polymerizace a depolymerizace • polarizace (+ a – konce) • MAP (proteiny asociované s mikrotubuly) • MTOC – mikrotubuly organizující centrum (centrozom; -tubulin) • mechanická podpora • transport uvnitř buňky • dělící vřeténko • řasinky a bičíky • mitotické jedy (kolchicin, taxol, …) -tubulin -tubulin Cytoskelet 4 Mikrotubuly - motory Kinesiny • pohyb k „plus“ konci mikrotubulů • transport směrem od centrozomu Dyneiny • pohyb k „mínus“ konci mikrotubulů • transport směrem k centrozomu • transport axonem na dlouhé vzdálenosti Cytoskelet 5 Intermediární filamenta • „chemicky“ velmi heterogenní skupina • stejná stavba (tetramery) tvořící “lanko“ • stabilnější než aktinová a tubulinová vlákna • specifické pro buněčné typy: Cytokeratin (epitely) Vimentin (buňky mezenchymového původu) Desmin (svalové buňky) Neurofilamenta (neurony) Gliový fibrilární kyselý protein (neuroglie) Laminy (jaderný obal) Cytokeratinová intermediární filamenta ve stratum basale epidermis Buněčné povrchy 1 volný povrch laterální povrch bazální povrch Volný • mikroklky (nepravidelné, pravidelné – žíhaná kutikula, kartáčový lem) • cilie (řasinky) Laterální mezibuněčná spojení: • těsná=okluzní: zonula occludens • adhezní: zonula adherens, desmosom • komunikační: nexus Bazální • bazální labyrint • hemidezmosomy Buněčné povrchy 2 Volný povrch lidských embryonálních kmenových buněk rostoucích v in vitro kultuře Mikroklky Buněčné povrchy 3 Mikroklky (microvilli) Pravidelně uspořádané mikroklky = žíhaná kutikula = kartáčový lem Aktinová filamenta v mikroklcích • 20 v mikroklcích epitelových buněk • několik set ve stereociliích vláskových buněk Tloušťka cca 0,1 m Délka 1-6 m Buněčné povrchy 4 Mikroklky (microvilli) žíhaná kutikula (apex enterocytů) kartáčový lem (proximální kanálky ledviny) Gluten - Celiakie Buněčné povrchy 5 Cilie = Řasinky + Flagella = Bičíky Tloušťka cca 0,25 m Délka 7-10 m Osové vlákno – Axonema 20 mikrotubulů (9x2 + 2) Dyneinová raménka (pohyb) Buněčné povrchy 6 Cilie = Řasinky + Flagella = Bičíky Bazální tělísko Centriol 9 x 3 Buněčné povrchy 7 Cilie = Řasinky + Flagella = Bičíky ve světelném mikroskopu v elektronovém mikroskopu Buněčné povrchy 8 Kinocilie = Řasinky vejcovod Mikroklky sekrečních buněk Řasinky řasinkových buněk Mezibuněčné spoje 1 laterální povrch bazální povrch Adhezní Těsnící Komunikační • Macula adherens (desmosom) • Zonula adherens • Hemidesmosom • Fokální kontakt • Zonula occludens (bariérový spoj, tight junction) • Gap junction (nexus) Spojovací komplex Mezibuněčné spoje 2 Adhezní • Macula adherens (desmosom) • Zonula adherens • Hemidesmosom • Fokální kontakt ECM plic v oblasti alveolů Jednotná stavba • Transmembránové proteiny (cadheriny+ integriny) • Adaptorové (plakové) proteiny • Vlákna cytoskeletu buňka-buňkabuňka-ECM Mezibuněčné spoje 3 Adhezní • Macula adherens (desmosom) Průměr cca 0,3 m Mezera mezi membránami cca 20-40 nm Mezibuněčné spoje 4 Adhezní • Hemidesmosom • Focal adhesion Epidermolysis bullosa Mezibuněčné spoje 5 • Fokální adheze bazální lamina Mezibuněčné spoje 6 Bazální labyrint Mezibuněčné spoje 7 Těsnící • Zonula occludens (bariérový spoj, tight junction) Poškození: Clostridium perfringens Helicobacter pylori (ZO-1) Mezibuněčné spoje 8 Těsnící • Zonula occludens (bariérový spoj, tight junction) Mezibuněčné spoje 9 Komunikační • Gap junction (nexus) Mezibuněčné spoje 10 Komunikační • Gap junction (nexus) Životní projevy buněk • Pohyb – intracelulární, amoeboidní, řasinky, bičíky • Metabolismus – příjem, zpracování, výdej • Dráždivost • Růst • Diferenciace • Rozmnožování (dělení) Zygota Mnohobuněčné embryo Dynamický mnohobuněčný organismus Dělení buněk & Specializace buněk Dělení buněk & Specializace buněk DIFERENCIACEBUNĚK MNOŽENÍBUNĚK Množení x Diferenciace buněk 1 Zygota Mnohobuněčné embryo Dynamický mnohobuněčný organismus STABILNÍ GENOM Genomická ekvivalence (= stejné množství DNA a stejná nukleotidová sekvence ve všech buňkách organismu – klonování) VARIABILNÍ TRANSKRiPTOM Regulátory transkripce X Množení x Diferenciace buněk 2 + další regulace: • translace • posttranslační modifikace Množení x Diferenciace buněk 3 Kmenové buňky • pomalé dělení (obvykle) • multipotentní Progenitorové buňky • „transit amplifying cells“ • rychle se dělí • multipotentní Terminálně diferencované buňky • nedělí se Obnova a regenerace tkání Oligodendrocyt Astrocyt Neuron „Široká nabídka“ kmenových buněk Kmenové buňky generují a regenerují naše tělo 1. Nediferencovaný růst 2. Diferenciace Schopnost vytvářet diferenciované/funkčně specializované buňky Pluri-/Multi-potence Schopnost vytvářet identické kopie Sebeobnova Odlišné vlastnosti Fetální Orgánové Tkáňové Embryonální kmenové buňky „Dospělé“ kmenové buňky Indukované pluripotentní kmenové buňky Nádorové kmenové buňky Kmenové buňky lze nalézt, vyjmout z tkáně a zkoumat 1 Collect lung Chop lung Enzymatic digestion Differential centrifugation Lung epithelial organoids Mesenchymal cells Single‐celled lung epithelial cells Culture in  non‐adherent conditions Enzymatic digestion Primary spheres Secondary spheres Enzymatic digestion Culture  in 3D Matrigel / collagen Culture  in 3D  Matrigel Kmenové buňky lze nalézt, vyjmout z tkáně a zkoumat 1 KB plic po izolaci Rostoucí sféroid z KB plic „lungosféra“ Základní koncept 1 MITÓZA a CYTOKINEZE produkují dvě geneticky identické buňky Dělení buněk 1 STABILNÍ (NEMĚNNÝ) GENOM Udržuje se prostřednictvím semikonzervativní duplikace DNA Kondenzovaný duplikovaný chromozom chromatida centromera telomera telomera Dělení buněk 2 ho homologní páry chromozomů duplikace duplikace nesesterské chromatidy sesterské chromatidy sesterské chromatidy chromozom s jednou chromatidou chromozom s jednou chromatidou otcovský chromozom mateřský chromozom Metabolismus chromozomů – Homologní chromozomy Dělení buněk 3 Páry homologních chromozomů (2N) organizované do podoby „KARYOTYPU“ Dělení buněk 4 Základní koncept 2 MITÓZA a CYTOKINEZE jsou částí buněčného cyklu Buněčný cyklus • má semi-modulární charakter • je vybaven kontrolními body • mezi buňkami je koordinován růstovými faktory G1 START M S kontrolní bod DNA replikace kontrolní bod poškození DNA G2 kontrolní bod metafáze (SAC) G0 Dělení buněk 5 Interfáze začíná v dceřinné buňce G1 S G2 Chromozómy kondenzují, začíná se tvořit dělící vřeténko Chromozomy se seřazují v metafázní (ekvatoriální) rovině Chromatidy se přesunují k protilehlým pólům vřeténka Formují se nová jádra a chomozomy začínají dekondenzovat Dělí se cytoplazma a vznikají dvě nové buňky Dělení buněk 6 centrozóm kinetochorové mikrotubuly kinetochora chromatida astrální mikrotubuly polární mikrotubuly Mitotické vřeténko „mrak“ proteinů centrioly aster Mitotické vřeténko Dělení buněk 7 Separace centrozomů Duplikace centrozomů Zrání centrozomů Segregagce centrozomů Metabolismus centrozomů Semikonzervativní duplikaceDělení buněk 8 Modifikováno z katalogu firmy Santa Cruz Biomedicals, USA Dělení buněk 9 Regulace – Cyklin-Dependentní Kinázy (CDK) + Cykliny Periodicita exprese cyklinů Dělení buněk 10 Dělení buněk 11 profáze metafáze Dělení buněk 12 anafáze -telofáze telofáze Děkuji za pozornost !