Mechanismy navozující změny genetické informace
1. Mutace
2. Rekombinace
3. Transpozice
Význam změn genetické informace:
- adaptace na prostředí, evoluce druhů
- využití ve výzkumu (identifikace genů, regulace exprese aj)
Mutace
= dědičná změna genotypu, jejíž molekulární podstatou
je nukleotidová substituce, delece, inzerce nebo inverze
Změna primární struktury nukleové kyseliny
Změny ve fenotypu organismů mohou mít i další
příčiny
Standardní typ x mutanta
Standardní alela (alela divokého typu, wild-type allele) standardní
fenotyp
Mutantní alela - mutantní fenotyp (většinou recesivní)
Směr mutací
- původní (přímá) mutace
- zpětná mutace - úplná nebo částečná obnova funkce
(reverze fenotypu)
Klasifikace mutací
1. Podle úrovně, na níž působí
a) Genové (bodové) mutace – změna bází nebo sekvence bází na úrovni genu
b) Chromozomové mutace – změna sekvence na úrovni chromozomu
c) Genomové mutace – změna počtu chromozomů (plazmidů)
2. Podle typu zasažené buňky
a) Genetické (gametické) mutace – vznikají v gametách, přenášejí se na potomstvo
b) Somatické mutace – vznikají v somatických buňkách
3. Podle vlivu na životaschopnost organismu
a) Vitální mutace – slučitelné s přežitím organismu
b) Letální mutace – neslučitelné s přežitím organismu
c) Podmíněně (kondicionálně) letální mutace – slučitelné s přežitím za určitých podmínek (ts, sus supresorsenzitivní
x supresorové mutace)
4. Podle stupně fenotypového projevu (u diploidních organismů)
a) Dominantní mutace – projevují se plně i v heterozygotním stavu
b) Recesívní mutace – projevuje se plně v homozygotním stavu, projev je maskován dominantní alelou
(recesivní mutací obvykle vzniká nefunkční produkt)
- neúplné (leaky) mutace: funkce genu se částečně zachovává
- nulová (null) mutace: úplná ztráta funkce genu (často delece genu nebo jeho části)
- posunová mutace: mění se čtecí rámec (obvykle delece nebo inzerce)
- polární mutace: mutace ovlivňující expresi sousedních genů (např. v operonech)
5. Podle vzniku
a) Spontánní mutace – vzniká bez zjevné vnější příčiny
b) Indukovaná mutace – vzniká po vystavení organismu/buněk mutagenům
Posunové mutace
Vznik mutace ve strukturním genu
- tiché mutace
- nesmyslné mutace
(stop kodon)
Tautomerní formy bází v DNA
Vznik spontánních mutací - substituce
párování bází v nestabilních tautomerních formách
3
1
6
4
4
4
Vznik spontánní mutace po začlenění tautomerní formy
báze do DNA při replikaci
Výsledek: GC AT
U je odstraňován
uracil-DNA glykozylázou
Důsledky spontánní deaminace bází
GC AT
Horká místa mutací
C T
uniká reparaci5-metylcytozin
Posunová mutace vede k posunu čtecího rámce
Vznik inzercí a delecí - horká místa (Hot-spots) - oblasti repeticí
Vznik inzercí a delecí „sklouzáváním“ řetězců při replikaci
„replication slippage“
„polymerase slippage“
Expanze trinukleotidů:
dědičné neurologické
choroby
Specificita mutagenů - distribuce mutací různého
typu vyvolaných různými mutageny v genu lacI.
EMS UV-záření
Začlenění vzácnější
enolformy BU proti G
Začlenění běžnější
ketoformy BU proti A
přechod enolformy BU na
ketoformu a párování s A
přechod ketoformy BU na
enolformu a párování s G
Výsledek: transice
oběma směry
Mutageneze pomocí 5-BU
Mutageneze pomocí 5-BU
(analog tyminu)
transice v obou směrech:
5-BU(keto) - A
5-BU(enol, ioniz) - G
Působení alkylačních činidel
Působení hydroxylaminu: specifické transice GC AT
(preferenční hydroxylace N na C-4 cytozinu)
Oxidativní deaminace bází vyvolaná kyselinou dusitou
cytozin uracil (T), adenin hypoxantin (G)
Interkalační činidla
Inst.Cancer.Res.
(akridinový derivát)
etidium bromid
Typy reverzí (záměny bází ve stejné pozici kodonu)
Supresorová mutace
Definice: mutace, která částečně nebo úplně ruší účinek
jiné mutace (tzv. supresorsenzitivní mutace)
a) intragenová: vzniká uvnitř téhož genu
b) intergenová: vzniká v jiném genu
Na rozdíl od reverzí mutace proběhne v jiném místě DNA
Intragenová supresorová mutace (I)
Supresorsenzitivní mutace
ATC CTC CCT TTC
ATC TCT CCC TTT
Inzerce T
Posunová mutace
(posun čtecího rámce)
Supresorová mutace
ATC TCT CCC TTT
Delece C
ATC TCT CCT TT
Obnova původního
čtecího rámce
Intragenová supresorová mutace (II)
TCA původní kodon
Supresorsenzitivní mutace (první mutace)
TAA stop kodon, ztráta funkce produktu
TAT kodon pro jinou aminokyselinu, obnova
funkce produktu (někdy jen částečná)
Supresorová mutace (druhá mutace)
Standardní gen
TTC CCA ACA GCT TTA
TTC CCA ACA GCT TAA
Supresorsenzitivní
mutace
STOP
Intergenová supresorová mutace v genu pro tRNA
Předčasné zakončení translace
gen pro tRNALeu
XYZXYZXYZ-AAT-XYZ
Supresorová mutace
XYZXYZXYZ-ATT-XYZ
Přepis do mRNA
UUC CCA ACA GCU UAA
Přepis do tRNA s
antikodonem AUU, který
se bude párovat s
terminačním kodonem
UAA
syntéza proteinu pokračuje
Sekvence
přepisovaná do
antikodonu
Gen - supresor
Mechanismus intergenové supresorové mutace
Proteiny cytochromového systému P-450 vyznačující se
oxygenázovou aktivitou (detoxikace nepolárních látek),
+ řada dalších enzymů
Amesův test na mutagenitu
Zajištění
metabolické
aktivace
REPARACE MUTAČNĚ POŠKOZENÉ
DNA
• A. Přímé reparace
– 1. fotoreaktivace
– 2. dealkylace
• B. Nepřímé reaparace
– 1. Excizní reparace
• bázová
• nukleotidová
• řízená metylací
– 2. rekombinační /postreplikační/
– 3. reaparace kroslinků
• C. Inducibilní reparace
– 1. SOS-odpověď
– 2. adaptivní odpovědi
• na alkylační poškození
• na environmentální stres
Genetický aparát
pro reparaci DNA
- velmi konzervativní
- asi 100 genů
- distinktní dráhy,
které se mohou
prolínat
AP-místo Chybná báze Tyminový dimer
TYPY REPAROVATELNÝCH POŠKOZENÍ NA DNA
Vznik AP míst =
nejčastější spontánní
mutace (depurinace je
100x častější než
depyrimidinace)
FOTOREAKTIVACE
DNA obsahující dimer
Vazba fotolyázy v místě
dimeru (6-7 bp)
Monomerizace dimeru za
přítomnosti světla (365-400 nm)
uvolnění fotolyázy
FADH2
Folát/deazaflavin
fotolýza
Zachycení světla
Alkyltransferáza: 6O-Metylguanin-DNA-metyltransferáza
(6O-MGT= Ada-protein)
nemetylovaná forma metylovaná forma
Transkripční
aktivátor
Dvojí úloha proteinu Ada při reparaci alkylované DNA
Aktivace genů zodpovědných za reparaci
Bázová excizní oprava
1. Abnormální báze v DNA
2. Rozpoznání specifickou glykozylázou
3. Vyštěpení abnormální báze
4. Odstranění cukrfosfátového zbytku
5. Zacelení mezery
Rozpoznání chybné báze
glykozylázou, vznik AP-místa
Vyštěpení
chybné báze
Resyntéza chybějícího
úseku, spojení mezery DNA-
ligázou
Přerušení cukrfosfátových
vazeb
AP-endonukleázami
Odstranění dR
s chybějící bází
BÁZOVÁ EXCIZNÍ REPARACE
DNA-GLYKOZYLÁZY PŮSOBÍCÍ NA POŠKOZENÉ DNA
DNA obsahující poškození (T-T,
chybný pár bazí aj)
NUKLEOTIDOVÁ EXCIZNÍ REPARACE (SHORT PATCH REPAIR)
Vazba UvrA2B1
disociace UvrA
vytvořeni preincizního komplexu
vazba UvrC
vytvoření incizního komplexu štěpení
cukr-fosfátové kostry
vyštěpení krátkého oligonukleotidu o
délce 11-13 b
resyntéza chybějícího úseku DNA - jako
templát slouží řetězec bez poškození
spojení mezery DNA-ligázou
4-5b -x-- 8b
SOS
UvrABC
excinukleáza
DNA-polI
Nukleotidová excizní oprava
Metylace DNA místně-specifickými metylázami
Rodičovská molekula
Dceřiné molekuly DNA
krátce po replikaci
Plně metylované dceřiné
molekuly DNA
REPARACE ŘÍZENÁ METYLACÍ (REPARACE
NA DLOUHOU VZDÁLENOST, mismatch repair)
A-C A-T
UvrD
DNA
polymeráza
A
C
MutS rozpozná chybnou bázi a vytvoří
smyčku na DNA, na kterou se váže
MutL, což umožní navázání a aktivaci
MutH, která štěpí G v GATC - poté
DNA-helikáza odmotá jednořetězec a
ten je nahrazen reparační syntézou
POSTREPLIKAČNÍ
REKOMBINAČNÍ REPARACE
Vznik mezery při syntéze DNA
vazba proteinu RecA
navození homologního párování
neporušeného a porušeného řetězce
reparační syntéza DNA podle sesterského
řetězce
rekombinace homologních řetězců
poškození zůstává v jedné z molekul a je
opraveno později
SOS-ODPOVĚĎ
geny din = damage induced, SOS-genes (31 genů
u E. coli)
• 1. Indukce SOS mutageneze – vznik adaptivních mutací
(mutageneze adaptivní fáze)
• 2. Excizní reparace dlouhých úseků
• 3. Zvýšená schopnost reparace ds zlomů
• 4. Indukce profágů (lambda, P22, f80)
• 5. Indukce tvorby kolicinů
• 6. Zmírnění restrikce
• 7. Inhibice buněčného dělení
PRŮBĚH SOS-REPARACE
Slabá exprese všech genů
DNA bez poškození
Poškození DNA
Silná exprese všech genů
O = operátor RecA
LexA
LexA = dimer, podrobující se autokatalytickému štěpení za účasti RecA* (koproteáza)
RecA*
helikální filament RecA-DNA
Změny růstových vlastností buněk navozené mutacemi
regulačních genů
mutace
(p53, Rb-protein)
Porucha regulace
buněčného cyklu
Obecné rysy onkoproteinů
- vytváří se v buňce, kde se
normálně netvoří
- vytváří se v nadměrném
množství
- vytváří se ve formě, která není
regulovatelná
Nádorové supresorové geny
(programovaná buněčná smrt)
Funkce proteinu p53 při zástavě buněčného cyklu
Zástava buněčného
cyklu (vstupu do Sfáze)
proteinem p21
Reparace
poškození na DNA
p53 podporuje
expresi genu p21,
který je inhibitorem
kináz regulujících
buněčný cyklus
(cyklin dependentní
kinázy)
TP 53, tumor protein 53
Model stimulace proliferace buněk růstovými faktory a účast Rb-proteinu
Za nepřítomnosti
růstových faktorů se
buňka nedělí
V přítomnosti
růstových faktorů
Mutace genu
pro Rb
Vznik retrovirů přenášejících onkogeny
retrovirus
Inzerční aktivace
protoonkogenu pomalu
transformujícími retroviry
nádor
Transdukce onkogenu
akutně transformujícími
retroviry
nádor
Akutně a pomalu transformující retroviry
Rekombinace - proces vzniku nové
kombinace genů
- obecná (homologická, RecA-závislá) –
vyžaduje dlouhé úseky DNA s vysokým
stupněm sekvenční homologie
- místně-specifická, nehomologická,
(ilegitimní) – probíhá mezi molekulami
DNA, které obsahují jen krátké
specifické sekvence rozpoznávané
místně-specifickými rekombinázami,
niákoliv RecA-proteinem
Bod překřížení
Posun bodu
překřížení
Průběh homologní
rekombinace
Homologické
molekuly dsDNA
(dsDNA x ssDNA)
Vznik náhodných
zlomů
Spojení řetězců
Dva možné výsledky
Hollidayovo spojení
(Hollidayova struktura)
RecBCD protein - helikázová a
nukleázová aktivita
Počáteční fáze procesu homologní rekombinace
Vazba RecBCD kompelxu na
konce DNA
Pohyb RecBCD komplexu po DNA a
vyhledání specifických sekvencí
Vytvoření jednořetězcového vlákna
vyčnívajícího z DNA
Párování jednořetězce s
homologickou sekvencí DNA
RecA
Rozložení Hollidayova spojení
I. regenerace původních
molekul DNA obsahujících
krátkou heteroduplexní
oblast
Resolvázy
(endonukleázy)
RuvC a RuvG
II. vytvoření hybridních molekul
DNA obsahujících krátkou
heteroduplexní oblast a zaměněné
krajní úseky
Konformace I a II se
neliší
Model působení RuvABC proteinů při rekombinaci
Na Hollidayovo spojení se váže jeden nebo dva tertramery
RuvA a udržují ho v planární rovině
Na komplex s RuvA se vážou dva hexamery
proteinu RuvB, z nichž každý tvoří kruh
okolo řetězce DNA
Na komplex se váže RuvC a štěpí dva z řetezců.
Hollidayovo spojení se rozloží na jednu z možných
konfigurací podle toho, které řetězce budou štěpeny.
a b
A Bhomolog 1
homolog 2
endonukleáza
DNA-ligáza, předcházená
pravděpodobně exonukleázou
a DNA-polymerázou
(a) Párování
homologických
chromozomů.
(b) Vznik
jednořetězcových
zlomů.
(c) Vzájemné
prostupování
řetězců.
(d) Výměna řetězců.
(e) Vznik kovalentního
jednořetězcového
můstku.
(f) Trojrozměrná struktura.
(g) Ekvivalentní 3-D struktura.
(h) Rušení jednořetězcového
můstku.
(i) Dvourozměrný pohled.
(j) Rekombinované
chromozomy.
a b
A B
a
bA
B
a
bA
B
helikáza a protein
vázající se na jednořetězce
a b
A B
a b
A B
DNA-ligáza, předcházená
pravděpodobně exonukleázou
a DNA-polymerázou
rotace nižších konců
a
b
A
B
a
b
A
B
a
b
A
B
proteiny typu Rec A
a b
A B
180°
endonukleáza
zlomy
Genová konverze následující po crossing-overu
vytvoření krátké
heteroduplexní oblasti v místě
Hollidayova spojení
rekombinující alely R a r
Reparace vede k
záměně R za r
Opravná syntéza
DNA po crossing-
overu
Začlenění fágového genomu do chromozomu hostitelské
buňky procesem místně-specifické rekombinace
Jednoduchý crossing-over
Krátké homologické sekvence
Integráza, integrační faktor
hostitele, excizionáza
Začlenění DNA bakteriofága lambda do chromozomu E. coli
Vytvoření posunutých zlomů
Spojení
molekul
Spojení molekul v místě rekombinace
DNA profága