Fyziologie působení farmak a toxických látek Přednáška č. 1 PAS proteiny jako stresové senzory a vývojové regulátory Náplň předmětu: Fyziologie komunikace Nízkomolekulární látky přírodního a antropogenního původu: • Signalizace • Toxicita • Fyziologické podmínky vs. lidské zásahy Mechanismy jejich působení na buněčné úrovni Již na úrovni jednobuněčných organismů je nezbytná schopnost: 1. Přijímat a identifikovat signály z vnějšího prostředí – např. za účelem výměny genetické informace; 2. Eliminovat toxické látky přijímané z vnějšího prostředí/vznikající jak vedlejší produkty metabolismu; Degradace a exkrece toxických látek a vedlejších metabolických produktů Příjem a přenos specifických signálů U mnohobuněčných organismů (živočichů) se vyvinuly stovky signálních drah a dalších mechanismů: 1.Embryonální a postnatální vývoj; 2.Regulace metabolismu a obecně, homeostázy; 3.Pohlavní rozmnožování; 4.Tvorba a degradace signálních molekul i toxických sloučenin; přenos signálu Zásahy z vnějšího prostředí: 1. Produkty sekundárního metabolismu rostlin a hub; 2. Zásahy člověka – cílené – aplikace chemických látek jako jsou pesticidy, syntetické feromony; terapie; 3. Zásahy člověka – nezamýšlené – toxické sloučeniny; odpad. Per-Arnt-Sim –nadrodina proteinů PAS environmentální senzory, které zprostředkovávají transkripční odpověď na různé typy stimulů: cirkadiánní rytmy – vnímání světelných podnětů; vnímání hladiny kyslíku; sensing of toxicants; vývojové regulace – deregulovány v nádorových onemocněních; Tyto proteiny umožňují adaptaci na rychlé změny v prostředí. Existují 3 hlavní podskupiny bHLH proteinů: (a) pouze s bHLH doménou; nebo ty, kde bHLH doména navazuje na druhou dimerizační doménu: (b) doménu leucinových zipů (Zip) nebo (c) PAS doménu. PAS proteiny jsou součástí širší rodiny basic-helix-loophelix (bHLH) proteinů: PAS proteiny (rodina transkripčních faktorů): http://mcardle.oncology.wisc.edu/bradfield/ PAS doména PAS oblast obsahuje 2 sousedící opakování ~130 aminokyselin, PAS A and PAS B. Tato doména je velmi starý signalizační prostředek, který zůstává zachován v průběhu evoluce. Byla identifikována v proteinech živočichů, bakterií, hub, kvasinek a rostlin: řada bakterií obsahuje PAS-like proteiny, které detekují světlo a kyslík (Dos, Aer, FixL, PYP); podobné proteiny vnímají světlo u rostlin (fytochromy PhyA-PhyE, NPH1; faktor interagující s fytochromem - PIF3). Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2000;40:519-61. bHLH PAS 100 aa Arnt protein N C A B TAD Dimerizace DNA NLS AhR protein N C Variabilní konecA B TAD DimerizaceDNA Ligand/HSP90/X AP2 binding NLS Struktura a funkce domén AhR a ARNT: AhR = • transkripční faktor aktivovaný ligandy; • zprostředkovává toxicitu řady environmentálních polutantů; • reguluje metabolizaci xenobiotik a podílí se na bioaktivaci promutagenů. Jak byl objeven AhR? • různá citlivost inbredních myších kmenů na indukci aktivity enzymů (CYP1A) v jaterních mikrozómech po expozici TCDD a 3-methylcholanthrenu – 60. léta; • autozomálně dominantní typ dědičnosti; • izolace unikátního proteinu; klonování genu – 90. léta Josephy and Mannervik, Molecular Toxicology, 2nd ed. Evoluce a AhR: AHR1 AHR2 AHRR ARNT Chem. Biol. Interact. (2002) 141: 131 Organism: Name: Ligand-binding: Physiological function: Nematodes: Caenorhabditis elegans AHR-1 No Neuronal development; Behavioral effects. Insects: Drosophila melanogaster Spineless (Ss) No Development; Regulation of homeobox genes and dendrite morphology. Vertebrates: AhR (AhR1, AhR2) Yes Toxicity mechanisms; Liver and kidney development; Neuronal differentiation? Circadian rhytms? Evoluce a AhR: Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43:309 Toxické AhR ligandy: • polychlorované dibenzo-p-dioxiny, dibenzofurany a bifenyly; • polycyklické aromatické uhlovodíky; Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAHs) • vážný regionální problém v ČR – • doprava; průmyslová výroba;   A 0 50 100 150 200 250 Třeboň Praha Poruba Bartovice Karviná koncentrace[ng/m 3 ] PASU PANU oxidované PAU alkylované PAU ostatní PAU 16 US EPA PAU B 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Třeboň Praha Poruba Bartovice Karviná % PASU PANU oxidované PAU alkylované PAU ostatní PAU 16 US EPA PAU 2,3,7,8-tetrachlordibenzo-p-dioxin • jedna z nejtoxičtějších látek vznikajících činností člověka; • modelový zástupce této skupiny, definující jejich toxicitu; Langlebiges Gift Ein Dioxin-Skandal erschüttert Deutschland: Hühner, Puten und Schweine haben auf deutschen Bauernhöfen vergiftetes Futter gefressen. Ein Futtermittelhersteller hatte technische Fette aus der DieselProduktion für Tiernahrung genutzt. Über Eier oder Fleisch nehmen Menschen die Dioxine auf, wo sie sich in Leber und Gewebe einlagern. O O Cl Cl Cl Cl Dioxiny a kontaminace potravin: Seveso - 1976 V červenci 1976 došlo k malé chemické továrně zhruba 15 km severně od Milána k explozi a zamoření okolí 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinem (TCDD) Výroba a používání herbicidů Vietnam – Agent Orange Spolana Neratovice – pracovní expozice Dioxiny a kontaminace potravin: Endogenní a přírodní ligandy AhR??? deriváty tryptofanu; Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43:309 FICZ deriváty lipidů a flavonoidy Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 43:309 Jiné přírodní ligandy AhR??? Schmidt & Bradfield, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12:55 Toxické účinky dioxinů: transkripční koregulátory TNGCGTG „xenobiotic response genes“ cytoplazma buň. jádro AhR hsp90 p23 XAP2 ligand ARNT ?? (podle Kewley et al., 2004) Aktivace AhR: Chemico-Biological Interactions 141 (2002) 41–61 Aktivace AhR: + TCDD C ontrol TC D D 5 nM PC B 126 100 nM actin (40 kDa) CY1A1 (60 kDa) AhR (93 kDa) Aktivace AhR: Geny regulované AhR obsahují v promotorové nebo enhancerové oblasti tzv. xenobiotic response elements (XRE) / dioxin responsive elements (DRE): • enzymy I. fáze biotransformace - CYP 1A1, CYP 1A2, CYP 1B1; • enzymy II. fáze biotransformace - UDP-glucuronosyltransferase, GST-Ya, NADP(H):oxidoreductase; • regulátory buněčného cyklu, apoptózy, diferenciace, senescence – Bax?, p27Kip1, JunD, TGF-; • AhRR. AhR deficientní myši: • růstová retardace; • narušení vývoje jater a imunitního systému; • hromadění retinoidů v játrech; • abnormální vaskularizace ledvin a jater; • řada efektů v imunitním systému a hematopoéze; • odolné vůči karcinogenním účinkům BaP a teratogenitě TCDD; Jaterní defekty: Walisser et al., J Biol Chem 2004;279:16326-31 BaP není karcinogenní v AhR KO myších: Shimizu et al., PNAS 2000;97: 779–82 Seminars in Immunology 23 (2011) 99–105 AhR a imunitní systém AhR a imunitní systém Seminars in Immunology 23 (2011) 99–105 AhR je nezbytný pro imunotoxické účinky TCDD: CTL response Koncepce toxických ekvivalentních faktorů (TEF) Toxicita směsi - TEQ = Σ[Ci] × TEFi • vzhledem k tomu, že látky dioxinového typu mají společný mechanismus účinku – aktivaci AhR, lze předpokládat, že jejich schopnost aktivovat tento receptor je úměrná jejich toxicitě; • referenční toxikant – TCDD; • TEF = EC50 (daná látka)/EC50 (TCDD); • TEF pro jsou definovány WHO; Toxické ekvivalentní faktory (TEF) van den Berg et al., Toxicol Sci, 2006;93:223-41 J Biochem Mol Toxicol 16:317–325, 2002; AhR interaguje s řadou dalších proteinů: AhR-ER crosstalk Safe et Wormke, Chem Res Toxicol, 2003;16:807-16 Ohtake et al., 2003, NATURE 423 www.nature.com/nature Přímá interakce AhR-ER Využití AhR-ER crosstalk v nádorové terapii? ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS 356, 239–248, 1998; CANCER RESEARCH 61, 3902–3907, 2001 Mol Cancer Ther 2004;3(6):715–25 Využití AhR-ER crosstalk v nádorové terapii? pRB-dephosphorylation pRB-phosphorylation cyclin E + cdk2 cyclin A + cdk2 cyclin A/B + cdk1 D-cyclins + cdk4 / cdk6 pRB = retinoblastoma protein cdk = cyclin-dependent kinase p27 Úloha AhR v regulaci buněčného cyklu Progress in Cell Cycle Research, 5 (2003): 261-267 Úloha AhR v regulaci buněčného cyklu Puga, Elferink Dietrich Úloha AhR v regulaci buněčného cyklu je pravděpodobně složitější MCF-7WB-F344 ARNT – základní dimerizační partner: The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 36 (2004) 189–204 Faktor indukovaný hypoxií – HIF1 The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 36 (2004) 189–204 HIF podrodina: Biochimica et Biophysica Acta 1755 (2005) 107 – 120 Masson, N. et al. J Cell Sci 2003;116:3041-3049 Buněčné prostředí mění hladinu HIF: Molecular Pharmacology doi:10.1124/mol.106.027 029 ARNT – základní dimerizační partner – vzájemná kompetice?? Myre a Imbeault, 2013, Obesity Reviews, doi: 10.1111/obr.12086 ? AhR-HIF-1 crosstalk ? Toxicology Letters 155 (2005) 151–159 JBC 274, 12115–12123, 1999 (Comprehensive Toxicology, vol. 14) Regulace cirkadiánních rytmů PAS proteiny CLOCK/BMAL1 heterodimer kontroluje expresi genů závislou na cirkadiáních rytmech – PER, CRY – zpětněvazebná regulace vlastní exprese; Regulace cirkadiánních rytmů Nature Rev Mol Cell Biol 11(2010): 764-776 Nature Rev Cancer 9 (2009): 886-896 dochází k interakcím mezi AhR signalizací a regulací cirkadiánních rytmů?? – nezodpovězená otázka; Biochemical Pharmacology 85 (2013): 1405–1416 AhR-retinoid receptors crosstalk J. Nutr. 133: 277S–281S, 2003. JBC (2004) 279(24):25284-93.