•„Biotransformace“ = metabolismus cizorodých látek a regulace hladin biotransformačních enzymů •ENZYMY METABOLISMU CIZORODÝCH LÁTEK • • EEnzymy 1. fáze biotransformace xenobiotik, steroidních hormonů a mastných kyselin – monooxygenázy (CYP, AKR, FMO), reduktázy (AKR, NQO), hydrolázy (esterázy, epoxidhydrolázy); další reakce: hydratace, isomerace. • E2. fáze biotransformace – transferázy (GST, UDPGT, SULF, acetylázy aj.); antioxidační enzymy (SOD, CAT, GPx, GR). E E3. fáze biotransformace (ABC transportéry) • • • • •BIOTRANSFORMACE CIZORODÝCH LÁTEK •A STEROIDŮ, EIKOSANOIDŮ AJ. ENDOGENNÍCH •LÁTEK •1. FÁZE BIOTRANSFORMACE: monooxygenázové reakce •(substrát) •R-H + O2 + NADPH R-OH + NADP+ + H2O •(produkt) •CYP enzymy •Funkce cytochromů P450 (CYP): •- Nejprve je nutný přenos elektronů z NADPH na CYP enzym (NADPH:P450- • oxidoreduktáza) •- Aktivace molekuly kyslíku, „roztržení“ vazby •- Oxidace substrátu (hydroxylace, N-demethylace, epoxidace, dehalogenace...) •R-H R-OH • • • • • • O • •- C = C - - C –- C - • • • N-CH3 N-H + HCHO •ROLE CYP1A1/CYP1A2/CYP1B1 A EPOXIDHYDROLÁZ V METABOLICKÉ AKTIVACI POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ Obr-07 • •Seznam nejvýznamnějších cytochromů P450, které jsou zodpovědné za biotransformaci cizorodých látek: • E CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1 (metabolizuje polycyklické aromatické • uhlovodíky); E CYP2C9 (metabolizuje nesteroidní antiflogistika a • další léčiva), CYP2D6 (beta-blokátory, kodein); CYP2E1 • (org. rozpouštědla jako ethanol, benzen, toluen) E CYP3A4 (metabolizuje asi 30% všech xenobiotik, • především léčiv včetně antibiotik); E CYP4A11 a další CYPs metabolizující mastné kyseliny • (CYP4A = PUFA hydroxylázy; CYP2C a CYP2J = PUFA • epoxygenázy) a některá xenobiotika. • •Další desítky CYP enzymů jsou zapojeny do biosyntézy a metabolismu endogenních látek, např. CYP7A (hydroxylace cholesterolu), CYP17 (hydroxylace steroidů), CYP19 (aromatáza – přeměna androgenů na estrogeny). E •Vlastnosti cytochromů P450 Cytochromy P450 = hemoproteiny; v UV-VIS spektru maximum při 450 nm (v redukovaném stavu a navázaný oxid uhelnatý); výjimka mezi enzymy: široká substrátová specifita, různé katalytické aktivity, výskyt nejvíce v játrech, GIT, plicích, ledvinách, ale i v dalších tkáních). Klasifikace podle podobnosti sekvencí: genové rodiny CYP1, CYP2, CYP3, CYP4 atd., podrodiny CYP1A, CYP1B atd. (cca 60% sekvence), jednotlivé isoformy CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1; polymorfismus. CYP3A4 s navázaným inhibitorem Aktivní místo CYP1A2 s navázaným b-naftoflavonem (modrá barva) •CYKLUS CYTOCHROMU P450: •AKTIVACE KYSLÍKU A MONOOXYGENACE Obr_01 •Přenos elektronů: •NADPH • •NADPH:P450 oxido- •reduktáza • • •cytochrom P450 • •(substrát RH, •produkt ROH, •produkce ROS) • • • •Aktivace kyslíku: •ROS = vedlejší •produkty • • interakcí se substrátem vzniká vysokospinová forma Fe3+-hemu a dochází k přenosu elektronů •STEROIDY: substrátová specifita CYP enzymů •(s výjimkou aromatázy monooxygenázové reakce inaktivují steroidní hormony) Obr-02 Obr-06 Obr-09 • •Hydroxylace steroidů •v různých pozicích •(v závorkách isoformy •CYP enzymů) • •6b-hydroxylace = •specifická reakce CYP3A • aromatáza •METABOLISMUS POLYCHLOROVANÝCH BIFENYLŮ (PCB) – příklad 1. fáze metabolismu persistentních organických sloučenin Met_PCB_mikrob 02-pcb •Mikrobiální •degradace •včetně arom. jádra •Metabolismus •u vyšších •živočichů: •oxidativní metab. •(hl. cesty A-D, C) • • •Persistetní arom. •sloučeniny: obsahují Cl •v sousedních pozicích – •bariéra vzniku epoxidu •monooxygenázovou reakcí • • •REGULACE CYPs: nukleární a cytosolové receptory kontrolují expresi CYP proteinů CYP01 expozice a indukce CYP enzymů ovlivňuje metabolismus endogenních látek! (společné enzymy CYP pro biotransformaci cizorodých i endogenních látek) expozice ciz. látkami indukuje hladiny CYP enzymů •XENOBIOTIKA, STEROIDY AJ. •LÁTKY INDUKUJÍ VLASTNÍ •METABOLISMUS AKTIVACÍ •RECEPTORŮ/TRANSKRIPČNÍCH •FAKTORŮ, KTERÉ KONTROLUJÍ •EXPRESI BIOTRANSFORMAČNÍCH •ENZYMŮ A ABC TRANSPORTÉRŮ - vazba xenobiotika na receptor • (aktivace receptoru) - dimerizace receptoru - vazba receptoru na specifické • responsní elementy v promoterových • oblastech cílových genů •NUKLEÁRNÍ A CYTOSOLOVÉ RECEPTORY _NR08 •nukleární receptory •cytosolový receptor •dimerizační partner •specif. responsní element v promoterech •ligand receptoru •NUKLEÁRNÍ A CYTOSOLOVÉ RECEPTORY KONTROLUJÍCÍ EXPRESI CYP ENZYMŮ CYP02 •Cizorodé nebo •endogenní látky, •které indukují •hladiny CYP •enzymů • •SEZNAM CYTOCHROMŮ P450 (CYP) ZODPOVĚDNÝCH ZA BIOSYNTÉZU / METABOLISMUS STEROIDŮ A METABOLISMUS XENOBIOTIK q CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1: genová exprese regulována AhR (indukce dioxiny, PAH; endogenní ligandy?); monooxygenace PAH, estradiolu; q CYP2B: exprese regulována GR/CAR, indukce steroidy, fenobarbitalem, monooxygenace velké řady xenobiotik, testosteronu aj. q CYP2A, CYP2C, CYP2D q CYP2E: indukce především stabilizací proteinu (indukují etanol, pyrazol aj.), monooxygenace etanolu, (w-1)-hydroxylace mastných kyselin q CYP3A: exprese regulována GR/PXR; indukce dexametazonem aj. steroidy, monooxygenace velké řady xenobiotik (nejdůležitější enzym biotranformace), 6b-hydroxylace testosteronu q CYP4A: exprese regulována PPARa, indukce peroxisomálními proliferátory (clofibrate, dialkylestery kyseliny ftalové), w-hydroxylace mastných kyselin q CYP7A, CYP11A, CYP17, CYP19 (aromatáza): enzymy steroidogeneze q další důležité CYP metabolismu vitamínu D3 a kyseliny retinové •REGULACE EXPRESE BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ: • •CYTOSOLOVÝ Ah (aryl hydrocarbon) RECEPTOR •AhR (Aryl hydrocarbon receptor) • •biotransformačních enzymů •CYP1A1/1A2/1B1, UGT, GST, •NQO1, ... •regulátorů bun. cyklu / apoptózy (p27, Bax,...) •přímé interakce (ER?,..) •AhR kontroluje genovou expresi další funkce AhR-dependentní genové exprese •AKTIVACE Ah RECEPTORU A INDUKCE CYP1A1 SUBSTRÁTEM CYP1A obr_09 •AhR/ARNT nasedá na XRE = DRE = xenobiotic (dioxin) response element •substrát S je ligandem AhR •monooxygenázová reakce •LIGANDY / INDUKTORY AhR •Strukturní podobnost (šířka, výška, molekulární objem, planarita molekuly) •Nekoplanární látky •(např. PCB se dvěma •chlóry v pozici ortho) •nevykazují planární •pozici aromatických jader •a nejsou agonisty AhR •TCDD = nejsilnější agonista AhR •= modelový dioxinový toxikant •Koplanární PCB •(podobný dioxinům, agonista AhR) •ENDOGENNÍ AGONISTÉ AhR obr_08 •dosud nejsou přesně určeny (deriváty tryptofanu ?) •Fyziologické •funkce AhR: • •nezbytný v řadě •procesů •vývoje tkání, •differenciace •buněk aj. •(viz myší AhR- •deficientní •modely) •AKTIVACE Ah RECEPTORU / AhR-DEPENDENTNÍ GENOVÁ EXPRESE obr_11 • •Produkty genové •exprese: -detox./bioaktiv. enzymy - apoptóza; - bun. cyklus; - ? - •Přímé interakce AhR •(„cross-talk“ s ER, ...) • • •Regulace AhR: •- degradace AhR po •navázání ligandu •- AHRR = AhR represor •REGULACE CYTOCHROMU P4501B1 (CYP1B1) •DRE = •dioxin •response •element (je velmi komplexní – několik responsních elementů) •REGULACE EXPRESE BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ: • •NUKLEÁRNÍ RECEPTORY •NUKLEÁRNÍ RECEPTORY (NR) _NR01 •NUKLEÁRNÍ RECEPTORY: •struktura domén receptorů _NR06 • • •vazba ligandu •aktivace MAPK •NUKLEÁRNÍ RECEPTORY MOHOU BÝT •AKTIVOVÁNY TAKÉ PROTEINKINÁZAMI _NR05 • •Ligand-independentní •modulace •transkripčního •faktoru (MAPK, PKA,..) • •NUKLEÁRNÍ RECEPTORY - KLASIFIKACE _NR02 _NR02a Ligandy (agonisté) jaderných receptorů •NUKLEÁRNÍ RECEPTORY _NR03 • • •= „xenosensory“ a „lipidní sensory“ •(aktivace transkripce po expozici xenobiotiky resp. lipidy) •NUKLEÁRNÍ RECEPTORY: •vazba antagonistického a agonistického ligandu _NR07 •Antagonisté: •vazba bez •transaktivace • • •REGULACE GR / PXR / CAR obr_12 •Více úrovní •regulace; • •aktivace nízkou •vs. vysokou •koncentrací •ligandu •FENOBARBITAL (PB) – agonista CAR •(a induktor biotransformačních enzymů), ale také indukce metabolismu endogenních látek obr_03 • •Biotransformace: • •enzymy 1. fáze • •enzymy 2. fáze • • • •Modulace endogenního •metabolismu •PPARa •(Peroxisomal •Proliferator- •Activated •Receptor alpha) •Induktory: •mastné •kyseliny, •hypo- •lipidemika •(fibráty), •environ. •látky •(ftaláty) PPAR_Obr-01 kontroluje expresi CYP4A11 a enzymů metabolismu lipidů •LIGANDY PPARa • PPAR_substraty_Obr-05 • • • •Farmaka •(hypolimidemika) •Environmentální •kontaminanty •(Endogenní) lipidy •DŮSLEDKY AKTIVACE PPARa • PPAR02 •Nerovnoměrná •indukce CYP4A •(vedl. produkt: H2O2) •a dalších enzymů •(např. CAT) •dependentních •na PPARalfa •DALŠÍ ENZYMY 1.FÁZE BIOTRASFORMACE A JEJICH REGULACE •DALŠÍ ENZYMY 1.FÁZE BIOTRASFORMACE A JEJICH REGULACE -flavinmonooxygenázy (FAD enzymy, NADPH přímo reaguje s enzymem); -peroxidázy (hemoproteiny oxidující 2-aminofluoren, PAH, fenoly; radikálové jednoelektronové reakce); -alkoholdehydrogenázy (koenzym NADH, oxidace prim. a sek. alkoholů); -aldehyddehydrogenázy (oxidace= detoxikace aldehydů a ketonů); -aldoketoreduktázy (AKR, oxidační reakce alkoholů – NAD+; redukce aldehydů a ketonů na alkoholy za účasti NADPH); -reduktázy xenobiotik (aldoketoreduktázy AKR, dehydrogenázy s krátkým řetězcem SDR, dehydrogenázy se středně dlouhým řetězcem, NADPH/chinonoxidoreduktáza - dvouelektronová redukce chinonů); -hydrolázy (štěpení substrátu za účasti vody; acetylcholinesterázy, karboxyesterázy, epoxidhydrolázy) ALKOHOLDEHYDROGENÁZY Metabolismus etanolu třemi enzymovými systémy ALDOKETOREDUKTÁZY -většinou monomerické NAD(P)(H)-dependentní oxido- • reduktázy; konvertují karbonyl alkohol - dosud 115 enzymů ve 14 „genových rodinách“; - substrátová specifita: cukerné aldehydy; steroidní • hormony; prostaglandiny a lipidové aldehydy; • metabolizují také některé chemické karcinogeny • (NNK, PAH-trans-dihydrodioly, aflatoxindialdehyd) • •Příklady lidských AKR: •AKR1A1 (aldehydreduktáza) •AKR1B1 (aldosareduktáza) •AKR1C1-1C4 (20a-, 3a-, 3a/17a-, 3a-HSD) •AKR1D1 (5b-reduktáza) •1. fáze biotransformace PAH: •účast CYP1A1/1A2/1B1 (monooxygenace), EH •(hydroláza) a AKR (reduktáza) • • • • •katecholy = •- metabolity PAHs, - podobně • metabolity • steroidů (E2) • •Detoxikace •versus •bioaktivace •ALDOKETOREDUKTÁZY Obr-11 Obr-10 •Detoxikace NNK •Biotransformace aldehydů •lipidní peroxidace •REGULACE ALDOKETOREDUKTÁZ Obr-12 • • •KLASICKÝ POHLED NA INDUKCI GENOVÉ EXPRESE KONTROLOVANOU XRE A ARE: transkr. faktor Nrf2 je indukován reaktivními metabolity a ox. stresem • •Miao et al., Biochem. Pharmacol., 2004 •XRE = xenobiotic (dioxin) respons element; •ARE = antioxidant response element •Bifunkční induktory •= xenobiotika •aktivující •AhR a Nrf2 • •NQO; GST a další •enzymy 2. fáze •biotransformace •TRANSKRIPČNÍ FAKTOR Nrf2 JE REGULOVÁN OXIDATIVNÍM STRESEM / ELEKTROFILNÍMI METABOLITY A TAKÉ AKTIVACÍ AhR • •Miao et al., JBC, 2005 •EPOXIDHYDROLÁZY •Funkce: •- metabolismus lipidů (epoxidů) v živočišných a rostlinných buňkách - metabolismus intermediátů xenobiotik s epoxidovou skupinou - - •celkem 7 forem EH: - savčí solubilní (cytosolová) EH - mikrosomální EH - leukotrien A4 hydroláza • etc. • • •Regulace? •ROLE CYP1A1/CYP1A2/CYP1B1 A EPOXIDHYDROLÁZ V METABOLICKÉ AKTIVACI •POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ Obr-07 •