•Hlavní mechanismy toxicity cizorodých látek HLAVNÍ MECHANISMY TOXICITY XENOBIOTIK E „Přímé“ mutageny / genotoxiny; metabolická aktivace promuta-genů, adukty s DNA, chromosomální aberace; oxidativní stres - oxidativní poškození DNA E E Mechanismy nádorové promoce – (negenotoxické) modulace intracelulární signální transdukce a změny genové exprese, oxidativní stres aj. AhR-dependentní (dioxinová) aktivita. Efekty v plasmatické membráně. Chemicky indukovaná karcinogeneze. E Další receptor-dependentní mechanismy endokrinní disrupce (např. estrogenita, antiestrogenita) E Inhibice mitochondriálních funkcí (respirace, syntéza ATP, ale také apoptóza – porušení mitochondriální membrány) E ENeurotoxicita, imunotoxicita, poruchy metabolismu endogenních látek atd. GENOTOXICITA EGenotoxicita = potenciálně škodlivé účinky chemických látek nebo záření na genetický materiál; důsledkem nemusí být smrt buňky, ale trvalé genetické změny (mutace, chromosomální aberace aj.). EPříklady hlavních genotoxinů: PAHs (benzo[a]apyren), alkyl-PAHs, aromatické a heterocyklické aminy, nitro- a nitrososloučeniny, halogen. deriváty uhlovodíků (CCl4), aldehydy a epoxidy, azobarviva a akridinová barviva, silná oxidační činidla, některé těžké a transitní kovy (Cd, Cr) aj. ETypy genotox. poškození: bodové mutace (ox. deaminací cytosinu vzniká uracyl, analoga bazí, alkylace bazí); chromosomální aberace (delece, inserce, duplikace, inverze úseku chromosomu, translokace úseku chromosomu na nehomologní chromosom); klastogeny = způsobují zlomy chromosomů (UV záření, interkalační látky); euploidie = změna počtu chromosomových sad, např. tetraploidie, aneuploidie = změna počtu jednotlivých chromosomů. ETeratogeneze – vznik poškození plodu (vrozené vývojové vady apod.); způsobují to teratogeny (některá org. rozpouštědla, viry aj.; mutagenní látky mohou působit jako teratogeny). •1) GENOTOXICITA – METABOLICKÁ AKTIVACE •POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ Obr-07 •DETOXIKACE POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ: • •Protektivní úloha GST, UDPGT aj. enzymů 2. fáze biotransformace GST_reakce BaPDE •GENOTOXICITA – METABOLICKÁ AKTIVACE •POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ • Obr-09 < < nejsilnější genotoxin ze skupiny PAHs je dibenzo[a,l]pyren (DB[al]P) -stérická dostupnost metabolitů (dihydrodiolepoxidů) pro GST event. další enzymy 2. fáze biotransformace •GENOTOXICITA – METABOLICKÁ AKTIVACE •POLYCYKLICKÝCH AROMATICKÝCH UHLOVODÍKŮ Obr-08 • •detoxikace - •metabolická • aktivace • -tvorba aduktů • s proteiny • -tvorba aduktů • s DNA • • • • • • • • • Akrylamid: detoxikace vs. tvorba aduktů •MALONDIALDEHYD - TYPICKÝ PRODUKT PEROXIDACE LIPIDŮ TVOŘÍ ADUKTY S DNA Obr-02 •2) HLAVNÍ TYPY POŠKOZENÍ DNA Genotox_bulky DNA adducts •Alkylace (methylace) •= O -OCH3 •Vznik objemných •aduktů •(“bulky adducts“) •UV záření: •dimerizace •Oxidativní poškození •DNA – viz dále •O •OCH3 •HLAVNÍ TYPY OXID. POŠKOZENÍ DNA (“apurinic sites“) • 01-depurin •Oxidativní deaminace •Depurinace (nestabilní •modifikované nukleotidy) •PRODUKTY OXIDATIVNÍHO POŠKOZENÍ DNA Obr-01 •Biomarker •oxidativního •poškození •DNA •(stanovení •HPLC) • 3) POSTGENOTOXICKÉ SIGNÁLY •POSTGENOTOXICKÉ SIGNÁLY: sensory genotox. poškození, přenos •post-genotoxických signálů a regulátory bun. cyklu, oprav DNA a •apoptózy (H2AX, ATM, ATR, ChK1, ChK2, p53) •(podle Roos, Kaina, 2006) • POSTGENOTOXICKÉ SIGNÁLY •(sensory poškození a regulátory buněčného cyklu) Příklad odpovědí na dvoušroubovicové zlomy (DSB) •OXIDATIVNÍ STRES •OXIDATIVNÍ STRES •Oxidativní stres je nerovnováha mezi (zvýšenou) produkcí ROS a oxidovaných metabolitů a limitovanou kapacitou antioxidačních •mechanismů. • •Hlavní mechanismy vzniku ROS: - chorobné stavy (reumatoidní choroby, záněty...) - vedlejší produkty respirace a dalších metabolických procesů • (prostaglandin H syntáza, diaminooxidáza, xanthinoxidáza) - radiace - metabolismus ciz.látek - aktivace O2 v cyklu P450 (např. • pomalu metabolizované substráty fenobarbital, lindan CYP2B); • redoxní cyklování chinonů aj.; v experimentálních studiích • přímá produkce ROS (terc-BuHP), snížení hladiny GSH • (dietylmaleát) •REAKTIVNÍ FORMY KYSLÍKU: •redoxní cyklování chinonů / antioxidační enzymy Obr-12 •PEROXIDACE LIPIDŮ Obr-15 vznik peroxidů lipidů (PUFA = nenasycené mastné kyseliny v membr. fosfolipidech) detoxikace aldehydů (AKR aj. reduktázami) detoxikace org. hydro- peroxidů (GPx) •DŮSLEDKY OXIDATIVNÍHO STRESU Oxid_stres • (různé role ox. stresu v chemické karcinogenezi) •ENDOKRINNÍ DISRUPCE •MECHANISMY ENDOKRINNÍ DISRUPCE • • Ebiosyntéza steroidních hormonů (např. inhibice CYP19 – aromatázy snižuje hladinu estrogenů); • Etransport steroidních a thyroidních hormonů (kompetice vazby hormonů na transportní bílkoviny snižuje hladinu hormonů v cílových tkáních); E Eaktivace nebo suprese nukleárních receptorů (AR, ER, TR aj. vede k nežádoucím změnám v receptor-závislé genové expresi) • Ekatabolismus (inaktivace) hormonů probíhá za účasti biotransformačních enzymů (např. hydroxylace steroidů enzymy CYP) • •AKTIVACE AhR A NUKLEÁRNÍCH RECEPTORŮ • EAktivace AhR (indukce CYP1A1/1A2/1B1 = ovlivnění katabolismu steroidních hormonů; aberantní aktivace AhR = vývojové defekty; interakce s ER aj. nukleárními receptory). • E Aktivace / suprese ER = xenobiotika jako estrogeny / antiestrogeny E E Aktivace / suprese AR = androgeny / antiandrogeny • E Xenobiotika modulující thyroidní funkce (aktivace nebo suprese TR = např. neurodevelopmentální defekty; kompetice xenobiotik s proteiny transportu T4) E E Aktivace PPARg – obesogeny (tributyltin, bisfenol A, alkylftaláty) – několik mechanismů, např. disrupce metabolismu lipidů a ukládání tuku (PPARg zvyšuje biosyntézu lipidů); diferenciace preadipocytů na adipocyty; v mozku deregulace apetitu – “central balance of energy“ (např. receptory neurotransmiterů) • •PCB jako endokrinní disruptory (příklad působení cizorodých látek více mechanismy) •Koplanární PCB: induktory AhR (“dioxin-like •compounds“); •efekty také na thyroidní funkce (kompetitivní •vazba na thyroid-binding protein); •antiestrogenita (suprese ER-dependentní •genové exprese; •indukce hydroxylace (inaktivace) estradiolu •Nekoplanární PCB: •nízkomolekulární kongenery mají •estrogenní aktivitu (aktivace ER); •prevalentní výšechlorované PCB jsou •antiestrogenní a antiandrogenní (ER, AR); •vazba na thyroid-binding protein; •vazba na RyR (disrupce Ca2+ signálování •= neurotoxicita) • •VLIV CIZORODÝCH LÁTEK NA METABOLISMUS A HOMEOSTÁZI LIPIDŮ •Xenobiotika ovlivňují syntézu a metabolismus lipidů: •role syntézy ceramidu a DAG v signální transdukci •(ovšem neplatí obecně!) lipidy03_ceramide_DAG_17 •PC-PLC a •SMsyntáza • •versus • •SMáza • • • • •Mechanismy účinku ceramidu: •aktivuje enzymy signální transdukce lipidy02_SMSase_19 •Další efekty xenobiotik: produkce mediátorů zánětlivých procesů a toxických lipidových metabolitů (kyselina arachidonová jako substrát pro enzymy CYP, LOX a COX) AA_met_COX_LOX_CYP •REGULACE EXPRESE TRANSKRIPČNÍMI FAKTORY NF-kB (ovlivněny řadou xenobiotik) •GENOVÁ EXPRESE •COX-2, PLA2, •iNOS, cytokinů •(TNFa aj.), •chemokinů •PROZÁNĚTLIVÉ •PROCESY •NEUROTOXICITA • E Inhibice acetylcholinesteráz (např. karbamáty, organofosfáty, ..) • E Modulace uvolňování dopaminu; efekty na další signálování pomocí neurotransmiterů (efekty na cholinergní receptory apod.) • EInterakce s ryanodyne receptorem (RyR) – deregulace Ca2+ koncentrací = modulace Ca2+-dependentní enzymů • EPoruchy diferenciace a růstu nervové tkáně (inhibice GJIC, • další interakce, např. s TR) •NEUROTOXICITA: inhibice acetylcholinesterázy (AChE) Tox_AChE • •Zpomalení •regenerace •vazebného místa •(uvolnění produktu •esterázové reakce) •NEUROTOXICITA: interakce s RyR •a modulace Ca2+ • •IMUNOTOXICITA • • EObecně mohou být po expozici xenobiotiky porušeny všechny typy humorální a buněčné imunity E EApoptóza vede k supresi krevních buněk (příklad: benzo[a]pyren je cytotoxický v relativně nízkých koncentracích) E ESuprese funkce a hmotnosti thymu (dioxiny, koplanárními PCB aj. AhR agonisty) • E Poruchy indukce protilátkové odpovědi a další mechanismy • • •CHEMICKÁ KARCINOGENEZE – základní koncept: • EMnohastupňový proces vývoje rakoviny, komplexní interakce genetických, genotoxických a epigenetických (negenotoxických) faktorů. Základní fáze karcinogeneze: • 1) iniciace (akumulace mutací v určitých skupinách genů); • 2) promoce (epigenetické změny – změny genové exprese, především změněný statut metylace DNA a acetylace histonů; ovlivnění přenosu signálů regulujících bun. cyklus, proliferaci, diferenciaci a apoptózu; inhibice mezibuněčných spojení GJIC, AJ) • 3) progrese, metastáze (další změny genové exprese, genetická instabilita a chromosomová instabilita) • EFaktory ovlivňující mutagenitu/genotoxicitu a karcinogenitu: • 1) genetické predispozice („susceptibility“); • 2) environmentální faktory (chemické kontaminanty, nutriční vlivy), kombinace 1 + 2; • 3) suprese imunologických funkcí; • 4) neznámé faktory • ECizorodé látky mohou ovlivňovat všechny uvedené procesy • •CHEMICKÁ KARCINOGENEZE Carcinoigenesis_Obr-06 Vznik mutací - genetická instabilita prakticky ve všech fázích •SUSCEPTIBILITA Epolymorfismus CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1, CYP2E1, GSTM1, NQO1, NAT aj. genů biotransformačních enzymů; EDNA repair; mutace v tumor-supresorových genech; Eotázka etnik, pohlaví, věku; Ekomplexní vlivy spolu s nutričními návyky (včetně mikronutrientů, vitamínu, PUFA aj.). • •ENVIRONMENTÁLNÍ EXPOZICE Ekouření; Echemické zatížení vzduchu (prach, PAHs, volatilní karcinogeny); Ekontaminovaná potrava (pesticidy, persistetní látky, např. PCB, dioxiny); Epracovní prostředí (PAHs, chemické výroby, cytostatika aj.) E •PREKLINICKÉ EFEKTY Echromos. aberace, genové mutace, aktivace onkogenů, inaktivace tumor. supresor. genů, komponenty bun. cyklu • • •CHEMICKÁ KARCINOGENEZE • EGENOTOXICKÉ KARCINOGENY reagují s DNA a ireversibilně pozměňují genom (bodové mutace, změny v chromosomální struktuře, zlomy, výměny sesterských chomatid, klastogeny); interakce chemických látek s DNA:alkylace, oxidativní poškození nukleotidů, interkalace. INICIACE zahrnuje mutace genů DNA repair, onkogenů (ras, myc aj.) a tumor-supresorových genů (např. p53) - genů kontrolujících buněčný cyklus a proliferaci (PAHs, nitro-PAHs, NNK aj. nitrososloučeniny) ENEGENOTOXICKÉ KARCINOGENY modulují signální transdukci a gen. expresi - pozměněna proliferace a diferenciace, inhibována apoptóza a mezibuněčná komunikace; především působí ve fázi PROMOCE karcinogeneze (dioxiny, PCB, OCP, azbest, křemenný prach, keramická vlákna, kovové ionty, např. Co, Mn, Ni, Cr, Be) EKOKARCINOGENY - samy nejsou nutně karcinogenní, potencují aktivaci chemických karcinogenů •MECHANISMY NEGENOTOXICKÝCH PROCESŮ • • Eaktivace nebo suprese transkripčních faktorů (AhR, NF-kB,..), „klasické“ epigenetické mechanismy (de/methylace DNA nebo acetylace/deacetylace histonů); E E aktivace intracelulární signální transdukce (ERK1/2, ...); • Estrukturní a funkční změny cytoplasmatické membrány, efekty na intercelulární komunikaci (např. inhibice GJIC, disrupce adherence) - vyvázání se z homeostatické kontroly okolních buněk, angiogeneze, procesy související s progresí a metastázemi • • •ZÁKLADNÍ MECHANISMY NÁDOROVÉ PROMOCE • E Mitogenní efekt, zvýšení buněčné proliferace, vyvázání • z kontaktní inhibice růstu (role onkogenů - mutanty ras, myc, b-cat,.. a inaktivace tumorových supresorů) • - interference s transdukčními signály, které kontrolují normální buněčný růst a diferenciaci (aktivace EGFR/ErbB2-ras-ERK, aktivace proteinkinázy C např. produkcí DAG po expozici forbolestery), produkce ROS, aberantní produkce růstových faktorů atd. • - aktivace ER- nebo AR-dependentní buněčné proliferace • E Inhibice apoptózy (nefunkční tumorové supresory, např. p53) = další mechanismus přežívání buněk E E Inhibice mezibuněčné komunikace (GJIC), disrupce adherence • buněk , angiogeneze, přechod z epiteliálního na mesenchymální • fenotyp buňky • Přežívání a transformace buněk = komplexní mnohastupňový proces iniciace a promočních mechanismů – de/diferenciace, angiogeneze, ...); výsledek změn v genové expresi, na povrchu buňky, intracel. signalizace aj. •ZÁKLADNÍ MECHANISMY NÁDOROVÁ PROMOCE •(Hannahan, Weinberg, 2000) •PŘÍKLAD AKTIVACE BUN. PROLIFERACE •(aktivací signální transdukce) Obr-06 velmi časté mutace = chronická aktivace proliferačních drah •MECHANISMY NEGENOTOXICKÝCH PROCESŮ TPA_Obr-02 •Forbol-myristátacetát = PMA, TPA (modelový tumorový promoter) •chemická aktivace proteinkináz C a ERK1/2: •- hyperfosforylace Cx, inhibice GJIC •- mitogenní efekty DISRUPCE MEZIBUNĚČNÝCH SPOJENÍ – VEDE K NÁDOROVÉ PROMOCI, INVAZIVITĚ A METASTÁZÍM INTERCELULÁRNÍ SPOJENÍ GJIC (“gap junction intercellular communication“) •Základní stavební •jednotkou jsou •proteiny konexiny •(connexin 32, 43 atd.), •které tvoří hexamery •(konexony); •konexony sousedních •buněk mohou tvořit •společný kanál, •kterým procházejí •signální molekuly •(cAMP, Ca2+ atd.) INHIBICE GJIC (scrape-loading / dye transfer assay; prostup fluoreskující luciferové žluti monovrstvou buněk) •kontrola •expozice TPA (aktivace PKC a ERK1/2, •hyperfosforylace konexinu) • DISRUPCE ADHERENTNÍCH SPOJENÍ (ADHERENS JUNCTIONS) •biosensor density •kontrola bun. proliferace •signálování beta- kateninu – •vývoj tkání, nádor. promoce • Disrupce adherentních spojů (“adherens junctions“) vede ke změně fenotypu buňky •Markery EMT: • •E-kadherin • •N-kadherin •Vimentin CHEMOPROTEKTIVNÍ LÁTKY E snižují riziko karcinogeneze různými mechanismy účinku (inhibice enzymů, antioxidační efekty) E přírodní (směsi i individuální chemické látky) nebo syntetického původu E příklady chemoprotektivních sloučenin: dietární flavonoidy / glykosidy flavonoidů (antioxidanty, antiestrogeny, modulátory CYP enzymů aj.) Obr-13 INDUKTORY / INHIBITORY 1. A 2. FÁZE BIOTRANSFORMACE Obr-09 XRE ARE MECHANISMY PROTEKTIVNÍCH VLASTNOSTÍ RESVERATROLU Obr-03 Obr-04 aktivační vlastnosti RES protizánětlivá aktivita RES