Chromozomové aberace u člověka jako příčina genetických onemocnění a možnosti jejich vyšetření Vladimíra Vallová Odd. genetiky a molekulární biologie UEB PřF MU Odd. lékařské genetiky FN Brno Osnova  charakteristika a mechanismus vzniku CHA u člověka  vrozené aberace chromosomů u člověka a syndromy s nimi spojené  indikace ke stanovení karyotypu člověka a možnosti vyšetření chromosomů člověka  moderní přístupy v cytogenetice člověka – DNA čipy  moderní přístupy v cytogenetice člověka – metoda MLPA Geneticky podmíněná onemocnění u člověka 1. Monogenní choroby (AD, AR, XD, XR) – poruchy strukturních genů, hormonů, enzymů (metabolické poruchy) 2. Chromosomové aberace (CHA) 3. Patologické stavy s multifaktoriálním typem dědičnosti (cukrovka, aterioskleróza) 4. Choroby s nemendelistickým způsobem dědičnosti - mitochondriální, expanze trinukleotidových repeticí… 5. Genetické poruchy somatických buněk (nádory) Zastoupení genetických chorob  incidence vážných monogenně podmíněných chorob odhadnuta na 0,36% u živě narozených novorozenců (studie na 1 000 000 dětí), méně než 10% se manifestuje po pubertě  0,6 % populace má vrozenou chromosomovou aberaci  až 80 % populace onemocní do konce života multifaktoriálně podmíněnou chorobou (genetická predispozice + vliv zevního prostředí) Chromosomy… Karyotyp člověka 46,XY 46,XX Co může poškodit chromozomy ? a) náhodné chyby při buněčných procesech (chyby replikace, reparace, rekombinace DNA) b) klastogeny v životním prostředí (ionizující záření, UV záření, chemikálie, viry atd.) Chromozomové aberace a jejich rozdělení Vrozené CHA  20 – 50% všech početí  50 – 60% abortů v I. trimestru  5% všech rozpoznaných těhotenství  4,4% se potratí  0,6 % se narodí → VVV, psychomotorická retardace, sterilita, stigmatizace, aj. Získané CHA - v somatických buňkách A) nádorová tkáň (leukémie, solidní nádory) – onkocytogenetické vyšetření B) hodnocení působení mutagenů – studujeme v lymfocytech periferní krve - rizikové prostředí, léky Chromozomové aberace a jejich rozdělení Numerické - změny v počtu chromozomů (polyploidie, aneuploidie) Strukturní - změny ve struktuře chromozomů (balancované, nebalancované) Polyploidie – zmnožení celé sady chromozomů  triploidie (3n = 69,XXX) – 1 až 3 % početí  tetraplodie (4n = 92,XXXX) obě tyto konstituce jsou u člověka letální  mixoploidie – 46,XX/69,XXX - 46,XX/92,XXXX Russel, 2001 Vznik polyploidie u člověka  Triploidie –  Diandrie – haploidní sada navíc pochází od otce  tzv. dispermie (oplození vajíčka dvěma spermiemi) nebo splynutí neredukované spermie s vajíčkem  Digynie – haploidní sada navíc pochází od matky  důsledkem splynutí neredukovaného vajíčka se spermií – chyba při meiotickém dělení vajíčka nebo nevyloučení polárního tělíska  Tetraploidie vzniká endoreduplikací, tj. rozdělením chromozomů bez rozdělení buňky. Russel, 2001 Triploidie u člověka Odlišný fenotyp závisí na rodičovském původu nadpočetné sady chromozomů: Diandrie - částečná hydatidózní mola Digynie - nemolární produkt, extraembryonální tkáně jsou redukované Je pravděpodobně způsoben imprintingem genů (aktivní otcovské aley určitých genů podporují vývoj obalů, aktivní mateřské alely dalších genů zase vývoj vlastního embrya). Aneuploidie - numerická odchylka se týká pouze určitého chromozomu. Konkrétní chromozom může být buď zmnožen – trizomie (tři kopie), tetrazomie (čtyři kopie), nebo ztracen – monozomie (jedna kopie). Nejčastější aneuploidie u člověka Nondisjunkce – příčina aneuploidií Vznik aneuploidie a) v důsledku chyby při rozchodu chromozomů do dceřiných buněk během buněčného dělení (nondisjunkce) b) opožděním chromozomu při rozchodu v anafázi buněčného dělení * Věk a nondisjunkce - věk matky > 35 let, věk otce > 50 let Věk matky:  stárnutí vajíčka, špatná funkce dělícího vřeténka (s věkem klesá četnost rekombinací chromozomů)  kumulace mutagenního ovlivnění během života ženy (meiotické dělení u ženy začíná již v době embryonálního vývoje, pak je zastaveno a pokračuje až v době pohlavní dospělosti)  změny v intracelulárních podmínkách v důsledku hormonální nedostatečnosti Nondisjunkce +21 Oogeneze : spermiogeneze 80 % mat : 20 % pat MI mat : MII mat 80 % : 20 % Přibližné % výskytu chromozomálních aberací ve vztahu k věku matky (průměr dle různých autorů) Věk matky 20 25 30 35 40 45 Všechny CHA 0,12 0,22 0,34 0,49 1,59 5,26 Věk jako příčina aneuploidií * Věk a opoždění chromozomu v anafázi - závislost není tak zřejmá VÝSKYT CHROMOSOM. ABERACÍ V ZÁVISLOSTI NA VĚKU MATKY Mozaika vs. chiméra Chromozomální mozaika – dvě (nebo více) buněčných linií s různým karyotypem pocházejících z jedné zygoty. Vzniká nondisjunkcí při mitotickém dělení a poměr buněčných linií závisí na tom, ve kterém dělení k nondisjunkci nebo ztrátě chromozomu došlo a na tom jak jsou abnormální buňky životaschopné. Chiméra - dvě buněčné linie s odlišným karyotypem, pocházející ze dvou zygot. U člověka známe vzácně chiméru 46,XX/46,XY. http://ghr.nlm.nih.gov Nejčastější syndromy spojené s numerickými CHA Autozomy: +13 Patau sy +18 Edwards sy +21 Down sy +8 Warkany 2 sy +9 trizomie 9 (Rethore: +9p) +22 trizomie 22 Gonozomy: Ženy X Turner sy XXX XXXX Muži XXY Klinefelter sy XXXY XXYY XYY Cytogenetika!! Strukturní změny chromosomů - jsou následkem chromosomových zlomů, na které navazuje určitá přestavba. Mohou vznikat spontánně nebo jako následek působení různých vnějších faktorů. • Nebalancované (část genetického materiálu chybí či přebývá): – Delece – Duplikace – Izochromozom – Dicentrický chromozom – Ring chromozom – Marker chromozom • Balancované (zachováno původní množství genetického materiálu) – Inverze – Translokace Delece a duplikace  Terminální  Intersticiální • zlom chromozomů – ztráta acentrického fragmentu (delece) • nerovnoměrný crossing-over (delece – duplikace) • důsledek abnormální segregace chromozomů s balancovanými translokacemi nebo inverzemi Russel, 2001 http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Crossing-over.jpg Nejčastější syndromy spojené s delecí/ duplikací u člověka  del 4p – Wolf Hirschhorn sy  del 5p – Cri du chat sy  del 18q – 18q deleční sy  mikrodeleční/mikroduplikační sy Cytogenetika!! Izochromosom, dicentrický chromosom – porucha dělení centromery  Izochromozom: jedno rameno chybí, zbývající je naopak duplikováno  přítomnost jednoho izochromozomu v karyotypu - parciální monozomie pro jedno rameno, parciální trizomie pro druhé  u člověka nejčastější i(Xq),i(18p), i(12p)  dicentrický chromosom – fúze dvou částí chromozomů, každá má centromeru  u člověka nejčastěji z pohlavních nebo akrocentrických chromozomů http://ghr.nlm.nih.gov Marker chromozom Marker • malý nadbytečný chromozom, který často není možno určit pruhovacími metodami • bez euchromatinu • s euchromatinem – parciální trizomie Ring chromozom • výskyt - 1/4000 u novorozenců, 1/2500 u amniocentéz http://ghr.nlm.nih.gov Inverze  nezpůsobuje abnormální fenotyp  klinický význam pro potomstvo – přenašeč jakékoliv inverze má zvýšené riziko tvorby abnormálních gamet – nebalancované CHA u potomstva  celkové riziko narození dítěte s nebalancovaným karyotypem se v případě přenašeče pericentrické inverze odhaduje na 5 až 10 % Russel, 2001 Syndrom: inv dup(15) Normální varianta: inv(9)(p11q12)  výskyt asi u 1% jedinců vyšetřovaných v cytogenetických laboratořích  normální varianta – neovlivňuje fenotyp často jako marker chromozom Translokace  výměny chromozomových segmentů mezi dvěma či více chromozomy  prosté  reciproké  Robertsonovské translokace  komplexní translokace (postihují tři či více chromozomů) Ukázka reciproké translokace pomocí techniky FISH Balancované translokace - důsledky  výskyt v populaci s četností asi 1 : 500  neovlivňují jednoznačně fenotyp nositele (5 x vyšší výskyt v populaci mentálně retardovaných pacientů)  významná příčina sterilit u přenašečů  v důsledku aberantní meiotické segregace vznik gamet s nebalancovanými přestavbami (duplikace, delece) http://www.pronatalgroup.cz/pronatal-cz/neplodnost-lecba-cytogenetika.php Robertsonovské translokace Zápis: 45,XX,der(13;14)(q10q10) – 45 chromozomů Nejčastější Robertsonovská translokace – chr. 13 a 14 (1 na 1300 osob!) Asi 4% případů Downova syndromu – důsledek Robertonovských translokací postihujících chromozom 21 Robertsonovské translokace Komplexní chromozomové přestavby  vrozené komplexní přestavby se vyskytují zřídka  jsou charakterizovány 3 nebo více zlomy lokalizovanými na dvou nebo více chromozomech  možná asociace s - mentální retardací - vrozenými anomáliemi - opakovanými spontánními aborty 46,XY,t(1;14),(p34;q24),t(4;6)(q25;p23)pat Shaffer & Lupski 2000 Klinické indikace pro vyšetření karyotypu člověka  narození mrtvého plodu a úmrtí novorozence  novorozenec s mnohočetnými VVV  problémy časného růstu a vývoje (neprospívání, opoždění, malá postava,anomálie genitálu, mentální retardace…)  porucha pohlavního vývoje  problémy s fertilitou – sterilní a infertilní páry  dárci gamet  těhotenství u žen pokročilého věku anebo nepříznivými výsledky screeningu  rodinná anamnéza (známá chromozomová abnormalita u příbuzných I. stupně)  nádorová onemocnění Materiál pro vyšetření chromozomových změn u člověka  periferní krev (bílé krvinky)  vzorky různých tkání (biopsie kožní)  buňky plodové vody, choriových klků, placenty  pupečníková krev  kostní dřeň  vzorky solidních nádorů Možnosti vyšetření Laboratorní vyšetření  Cytogenetické vyšetření - karyotyp, hodnocení mozaiky, získané chromosomové aberace  Molekulárně cytogenetické vyšetření - FISH (metafázní, interfázní), SKY, CGH  Molekulárně genetické vyšetření - analýza DNA, RNA  Další laboratorní vyšetření - screening DPM, biochemie, hematologie, histologie, imunohistochemie…  Další odborná vyšetření - neurologie,endokrinologie…  Cytogenetické vyšetření - karyotyp, hodnocení mozaiky, získané chromosomové aberace  Molekulárně cytogenetické vyšetření - FISH (metafázní, interfázní), SKY, CGH  Molekulárně genetické vyšetření - analýza DNA, RNA  Další laboratorní vyšetření - screening DPM, biochemie, hematologie, histologie, imunohistochemie…  Další odborná vyšetření - neurologie,endokrinologie… Možnosti vyšetření chromosomů člověka Molekulární karyotypování – 1000x citlivější než klasická cytogenetika I. Klasická cytogenetika  klasické barvení - získané chromosomové aberace  diferenciační barvení - odliší jednotlivé chromozomy dle charakteristických pruhů - vhodné pro studium vrozených CHA, chromozomálních změn u nádorů Klasické barvení – hodnocení zlomů C-pruhy - heterochromatín G-pruhy vs. R-pruhy II. Molekulární cytogentika - FISH • 1969 Parduová a Gall - radioaktivní značení • 1986 Pinkel a kol. - fluorescenční značení (FISH) Hybridizace značené sondy s chromozomy na cytogenetickém preparátu Přítomnost, počet a poloha signálů  nevyžaduje přítomnost mitóz – cytogenetika interfáze  rychlé zhodnocení velkého počtu buněk  rychlá identifikace známých delecí, duplikací, amplifikací, translokací SKY (spektrální karyotypování) mFISH (multicolor FISH), mBand  v jedné hybridizační reakci simultánní vizualizace všech 22 autozomů a chromosomů X a Y v odlišných barvách  citlivost v rozmezí 1 – 2,5 Mb  kombinatórní značení sond; celkový počet kombinácí při použití N fluorochromů je 2N – 1 Využití technik SKY a mFISH, mBand  odhalení balancovaných přestaveb  kryptické translokace a inzerce  marker chromozomy  nadbytečný materiál neznámého původu  komplexné přestavby  charakterizace místa zlomu či odhalení intrachromozomové přestavby (mBand) Komparativní genomová hybridizace (CGH)  umožňuje během jedné hybridizační reakce stanovit straty (delece) či zisky (duplikace, amplifikace) sekvencí DNA v celém genomu; neodhalí balancované přestavby  rozlišovací schopnost – 10 Mb,  nevyžaduje mitotickou aktivitu zkoumaných buněk zelená - zisk červená - ztráta Referenční DNA Testovaná DNA  Array- CGH CGH Technika array-CGH aneb rozdíl je jen v podkladě… Array-CGH patří mezi tzv. moderní metody analýzy genomu, konkrétně mezi čipové technologie… Moderní metody analýzy genomu: DNA čipy  principem metody je hybridizace značené vyšetřované DNA s imobilizovanými sondami na čipu  sondy: jednotlivé molekuly DNA o známé sekvenci, které jsou upevněny ve shlucích (spoty) na pevném podkladu  počet spotů se pohybuje od řádově stovek do milionů podle typu čipů  podklad:  sklo: mikroskopické sklíčko; různé úpravy povrchu  nylonová nebo nitrocelulózová membrána  plast, gel  mikrokuličky (BeadArrays® (Illumina))  historie: Southern blot (polovina 70. let), skutečné mikročipy - polovina 90. let 20.st., pak masivní rozvoj a vývoj různých adaptací a variací; komerční trh Dělení mikročipů Podle počtu sond  Nízkohustotní (desítky až stovky specifických sond, někdy označované jako tzv. „macroarray“, např. analýza specifických signálních drah)  Vysokohustotní (tisíce až miliony specifických sond; většina analýz) Podle přípravy  „Off chip“ - „spotované“ - přenesení už připravené sondy (oligonukleotidy, cDNA, BAC, atd.) - kontaktní a bezkontaktní  „On chip“ – syntetizované in situ - pouze oligonukleotidy  fotolitografická syntéza (Affymetrix, Roche/Nimbelegen)  „Ink-jet“ syntéza (Agilent) van Hal a kol., 2000; upraveno Dělení mikročipů Podle značení  fluorescence, autoradiografie, chemiluminiscence a počtu snímaných barev  Jednokanálové – značení jednou barvou  Dvoukanálové - kombinace dvou DNA značených odlišnými fluorochromy Podle typu sond  BAC, PAC  cDNA  Oligonukleotidové - s krátkymi nebo dlouhými oligonukleotidy - v současnosti nejrozšířenějším typem, použitelné pro prakticky všechny aplikace Dělení mikročipů Podle aplikace I.analýza genomu – materiál: genomová DNA - array-CGH, SNP čipy, resekvenační čipy II. expresné štúdie – mRNA, proteiny III. epigenetické štúdie - ChIP-on-Chip (vazba proteinu na DNA) I. Array-CGH   Solinas-Toldo a kol., 1997  vyhází z principu klasické (chromozomální) CGH  nahrazení chromozomů separovanými klony (BAC, c-DNA klony, oligonukleotidy)  duplikace, delece, amplifikace – CNV(copy number variants)  nedetekuje balancované přestavby Array-CGH Postup  Izolace DNA  Kontrola kvality, stanovení kvantity  Celogenomová amplifikace  Naštěpení DNA  Naznačení DNA - fluorescence  Hybridizace  Odmytí  Skenování  Analýza dat Příprava DNA čipů pro techniku array-CGH 5. Scanning www.agilent.co m 6. Analysis and interpretation Vyhodnocování array-CGH aCGH Analytics Software, Agilent Technologies Rozlišení array-CGH 1.velikost klonů  Úseky genomové DNA vložené do vektorů  BAC (Bacterial Artificial chromosome) - 50–200 kb  PAC (Phage Artificial chromosome) - 75-200 kb  Rozlišení ~ 1Mb  cDNA - 1-2 kb  Pouze genové oblasti  Rozlišení - 1-2 kb  Oligonukleotidy - 25-85 bazí  Rozlišení - pod 1 kb 2.rozložení a vzdálenost klonů Rozlišení array-CGH  Cílená aCGH – vybrané oblasti zájmu, např. mikrodelece, mikroduplikace  Chromozomově-specifická aCGH  Celogenomová aCGH - sondy  v určitých intervalech  překrývající se - tilling arrays Davies et al., 2005 Agilent Human CGH Microarray Agilent ISCA CGH+SNP Microarray CGH probes SNP probes 60K SNP probes ~5-10 Mb LOH Porovnání záchytu chrom. aberací pomocí HR-CGH a oligonukleotidových čipů – různý formát Pacient s del(1)(p36), ~ 3,2 MB HR-CGH negativní 8x15K negativní 4x44K del(1)(p36) 2x105K del(1)(p36) Human CGH Microarray, Agilent Technologies, CGH Analytics 3.5, Aberration algorithm: ADM-1, Treshold: 6.0, Genome: hg18 Karyotyp normální • se stále se zvyšujícím rozlišením je stále obtížnější nalézt hranici mezi benigními (polymorfními) a patogeními CNVs • získat data je snadné • interpretovat výsledek je obtížné • existuje normální karyotyp? Array-CGH a variabilita v počtu kopií (CNVs) Array-CGH a CNVs • doposud detekováno 29 133 CNV • 12 % lidského genomu obsahuje CNV • 0,12 – 7,3 % rozdíly v CNV mezi jedinci • 41 % všech CNV pokrývá geny CNV patogenní x benigní CNV nejasného významu CNVs – segmenty DNA větší než 1 kb přítomné ve variabilním počtu kopií v porovnání s referenčním genomem Global variation in copy number in the human genome Richard Redon et al.: Nature. 2006 November 23; 444(7118): 444–454. Buysse et al., 2009 Výsledky 15 753 analýz array-CGH ze 7 skupin ISCA International Standards for Cytogenomic Arrays (ISCA) Consortium >145 members, total cases to date (Nov 26th 2011): 28,526 patogenní CNV = 2 766 (17,6 %) Velikost patogenních CNV: Průměr: 6,2 Mb Median: 2,7 Mb Median počtu genů: 44 Delece – 63,6 % vs. duplikace – 36,4 % Charakteristika patogenních CNVs II. SNP čipy  umožňují rozlišit nejen CNV ale i SNP - sondy pro detekci CNV + sondy speciálně navržené pro detekci SNP  detekce uniparentální dizomie (UPD), ztráty heterozygotnosti (loss of heterozygosity – LOH)  genotypizace, asociační studie SNP čipy The DNA sequences of the four oligos highlighted in the first bloc differ only at the last position. To determine which alleles are present, genomic DNA from an individual is isolated, fragmented, tagged with a fluorescent dye, and applied to the chip. The genomic DNA fragments anneal only to those oligos to which they are perfectly complementary: in this case, the allele with the ~T~ SNP allele binds to the ~~A oligo, and the allele with the ~C~ SNP allele binds to the ~~G oligo. A computer reads the position of the two fluorescent tags and identifies the individual as a C / T heterozygote. [The single spots in the other three columns indicate that the individual is homozygous at the three corresponding SNP positions]. Princip SNP čipů - Affymetrix  25bp sondy, záměna 13. nukleotidu  jednobarevná detekce - na čip se hybridizuje pouze označená testovaná DNA Princip SNP čipů - Agilent  60bp, SNPs pouze v místech rozpoznávaných restrikčními endonukleázami Výsledky CGH + SNP čipů  Nádorová genetika  Klinická genetika  Farmakogenomika  Asociační studie – asociace SNP i CNV s řadou onemocnění (revmatoidní artritida, diabetes, nádorová onemocnění, psychiatrická onemocnění)  Evoluční studie Využití arrayCGH a SNP čipů Nádorová genetika  identifikace specifických klonálních aberací postihujících jednotlivé typy nádorů  bližší upřesnění chromosomových oblastí obsahujících onkogeny či tumor supresorové geny  kvantifikace celkové chromosomové nestability genomu nádorových buněk  studium genetických změn při vývoji nádorů Neuroblastom  pevný dětský nádor sympatického nervového systému  5–10 případů /106 dětí/rok  10 % rakoviny v dětském věku; 50 % do 2 let; 90 % do 6 let  klinická stádia (1,2 / 3,4; 4S) (International Staging System for Neuroblastoma) G.M.Brodeur et al., 1995: Molecular Basis for Heterogeneity in Human Neuroblastomas Charakteristika TYP I (LR) Typ II (IMR) TYP III (HR) N-myc normální normální amplifikováno 1p36 LOH ne ±ano obvykle ano Ploidie hyper2n / 3n 2n / 4n 2n / 4n Věk* obvykle < 1rok obvykle = 1 rok obvykle 1-5 let Stadiumo obvykle 1, 2, 4s obvykle 3, 4 obvykle 3, 4 Pravděpodobnost přežití 3 roky 95% 25-50% < 5% * v době stanovení diagnózy • International Staging System for Neuroblastoma Význam array CGH u dětských pacientů s neuroblastomem Klinická genetika Postnatálna genetika  hledání příčin u pacientů s MR, VVV, dysmorfickými črtami a normálním anebo zdanlivě balancovaným karyotypem  definování a upřesnění mikrodelečních/mikroduplikačních syndromů  původ nadbytečného materiálu, marker chromozomů … Prenatální a preimplatační genetika  detekce aneuploidií  díky celogenomové amplifikaci i určovaní změn v blastomerách nebo polárních tělískách Mentální retardace (MR)  Výskyt MR u 2-3 % populace  17- 20% pacientů s idiopatickou MR kauzální nebalancované aberace celogenomový screening pomocí array-CGH Význam array CGH u pacientů s MR a/nebo VVV Záchyt CNVs pomocí array CGH u pacientů s MR/VVV závisí na:  typu čipu, rozlišení  pokrytí známých syndromů  kritériích výběru pacientů Buysse et al., 2009 Vyšetřovací postup u pacientů s MR a VVV na OLG FN Brno karyotyp G-pruhování normální normální MLPA array- CGH FISHFISH specifický syndrom aberace potvrzení aberace I. II. III. potvrzení Array - CGH CNV jiná Vyšetření rodičů Negativní výsledek známy del/dup syndrom Běžná CNV CNV zděděná CNV benigníCNV patogenní CNV nejasného významu CNV nezjištěna Kauzalita? CNV de novo Používaný algoritmus vyšetření pomocí aCGH CNV nalezena CNV nalezena CNV nalezena Ověření Gene rich Gene poor Interpretace CNV nalezených pomocí array-CGH v klinické genetice – rozhodovací kriteria Array-CGH u pacientů s MR - korelace genotypu s fenotypem Využití web. databází k interpretaci výsledků  DECIPHER  ISCA  ECARUCA  GENOGLYPHIX  CARTAGENIA BENCH Array-CGH u pacientů s MR - korelace genotypu s fenotypem Databáze jsou důležité pro:  klinickou interpretaci výsledků array-CGH  identifikaci kauzálních regionů pro nové chromozomové syndromy  možnost vyhledat stejnou či podobnou aberaci a srovnat fenotypové projevy  možnost rozlišení benigních CNVs  odhad prognózy dle typu a funkce genů nacházejících se v sledované oblasti Vždy v kontextu • s fenotypem pacienta • s vyšetřením rodičů • s databázemi Interpretace array CGH The questions that need to be answered are: Is microarray analysis sufficient for the detection of cytogenetic abnormalities? Is there still a role for karyotyping and FISH in this new era of cytogenetics ? Molekulární karyotypování aneb soumrak konvenční cytogenetiky v éře DNA mikročipů? Prenatal Diag. 31, 235,2011 GenoSensor™ Array300 Genom icAnalysisReport GenosensorReport(33 of287 targ ets ) only ta rg ets whose p <= 0.0 1 Tgt Nam e Lo cation # MassRatio Mean CV(% ) Mean Ref (c /s) NonModal (n h p