Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
1
prof. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc.
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta MU
STUDIUM BUNĚK V
PODMÍNKÁCH IN VITRO
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
2
 vývoj kultivací živočišných buněk v podmínkách
in vitro
 podmínky kultivace savčích/lidských buněk in
vitro
 kultivační postupy
 typy kultivací (terminologie)
 vlastnosti normálních a transformovaných
buněčných linií
 praktické aplikace
 archivace, sbírková pracoviště
Program přednášky:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
3
VÝVOJ KULTIVACÍ
ŽIVOČIŠNÝCH BUNĚK
V PODMÍNKÁCH IN VITRO
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
4
 1907: kultivace nervových vláken izolovaných
z žabích embryí (Harrison)
 1912: explantáty kuřecí pojivové tkáně a
srdeční svaloviny (Carrel; Burrows)
 1916: trypsinizace a pasážování (Rous &
Jones)
 1943: stabilizace první buněčné linie - myší
fibroblasty: L-cells (Earle et al.)
 1948: první buněčný klon: L929 (Sanford et al.)
 1952: stabilizace první lidské linie - karcinom
děložního krčku: HeLa (Gey et al.)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
5
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
6
1952 - stabilizace první lidské linie HeLa (Gey et al.)
 karcinom děložního krčku
 Henrietta Lacks (1920-1951)
 Johns Hopkins University Hospital (Baltimore,
USA)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
7
Linie HeLa:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
8
mikrotubuly (anti-Tu)
mikrofilamenta (phalloidin)
jádra (DAPI)
Linie HeLa:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
9
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
10
PODMÍNKY KULTIVACE
SAVČÍCH / LIDSKÝCH
BUNĚK IN VITRO
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
11
Kultivační podmínky pro savčí a lidské buňky
 co nejpodobnější podmínkám v původním
organismu:
 teplota 37oC,
 maximální vlhkost vzduchu, 5% CO2
 neutrální pH (6,8 až 7,2)
 živiny
 sterilní prostředí
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
12
STABILNÍ PROSTŘEDÍ PRO KULTIVACE
CO2 inkubátory
 definovaná stabilní teplota (37oC)
 maximální vlhkost vzduchu
 definovaný stabilní obsah CO2 (5%),
příp. i O2 (řízená hypoxie)
 vodní nebo vzduchový plášť
 vnitřní povrch: měď nebo nerez
 připojení tlakových lahví přes redukční ventily
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
13
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
14
Bazální médium
 tekuté nebo práškové
 soli, aminokyseliny, vitamíny, lipidy, zdroj
energie, indikátor pH
+ krevní sérum / růstové faktory
Kompletní médium
ŽIVNÉ MÉDIUM
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
15
Voda pro tkáňové kultury:
 ultrapure type I - resistivita < 18 MΩ/cm
 TOC (total organic carbon) < 10 ppb (parts per
bilion)
Úprava vody pro tkáňové kultury:
 reverzní osmóza
 absorbce na aktivní uhlík
 iontoměniče
 elektrodeionizace
 UV záření
Složení bazálního média
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
16
Vyvážené solné roztoky
= BSS (balanced salt solutions):
 udržování pH a osmolality
 udržování membránového potenciálu buněk
 kofaktory enzymů
 tvorba fokálních adhezí (růst na pevném
substrátu)
 ionty: Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Cl-, SO4
2-, PO4
3-, HCO3

stopové prvky: Fe, Zn, Cu, Se …
Hlavní typy BSS:
DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline)
HBSS (Hank's balanced salt solution)
EBSS (Earle's balanced salt solution)
ESSS (Eagle's spinner salt solution)
Složení bazálního média
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
17
Pufrovací systém:
 NaHCO3, HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulphonic
acid)
Aminokyseliny:
 esenciální, resp. vzácné (člověk, myš):
arginin, histidin, isoleucin, leucin, lysin,
methionin, fenylalanin, threonin, tryptofan, valin
 in vivo syntetizované ve specifických orgánech
(játra, resp. ledviny):
cystein, glutamin, tyrosin
 lze nahradit hydrolyzátem z proteinů (krátké
peptidy)
Složení bazálního média
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
18
 voda
 anorganické sloučeniny (ionty, stopové prvky)
 aminokyseliny
----------------------------------------------------------------
 vitamíny (zejména skupina B)
 lipidy (esenciální mastné kyseliny, cholesterol…)
 hormony (inzulín, hydrokortizol)
 glukóza (zdroj energie)
 fenolová červeň (indikátor pH)
 antibiotika (penicilin + streptomycin)
Složení bazálního média
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
19
Many modifications of Eagle’s
Medium have been developed since
the original formulation appeared in
the literature. Among the most
widely used of these modifications is
Dulbecco’s Modified Eagle’s
Medium (DMEM).
DMEM is a modification of Basal
Medium Eagle (BME) that contains a
4-fold higher concentration of amino
acids and vitamins, as well as
additional supplementary
components. The original DMEM
formula, first reported for culturing
embryonic mouse cells, contained
1,000 mg/L of glucose. An alteration
with 4,500 mg/L glucose is optimal
in cultivating certain cell types.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
20
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
21
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
22
Krevní sérum
 fetální telecí/hovězí - FCS/FBS, koňské, lidské...
 nedefinovaná směs růstových faktorů a dalších
složek
 obsah v médiu 5 - 20% podle typu buněk
 bezsérová média pro speciální aplikace (definovaná
směs růstových faktorů - tzv. serum replacement)
Nejdůležitější látky obsažené v séru:
 růstové faktory
 albumin
 transferrin
 anti-proteázy (antitrypsin, macroglobulin)
 attachment factors (fibronectin, laminin)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
23
Výhody použití séra:
 směs nejdůležitějších faktorů pro přežívání a
proliferaci buněk
 univerzální použití pro kultivaci většiny buněčných
typů
 ochrana buněčné kultury před výkyvy prostředí a
toxickými vlivy (změny pH, ionty těžkých kovů,
endotoxiny, proteolytické enzymy)
Nevýhody použití séra:
 potíže s reprodukovatelností (původ zvířat, krmení,
roční doba…)
 riziko kontaminace
 dostupnost a cena
 vliv na produkci proteinů do média
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
24
Typy médií pro savčí buňky:
 Eagleovo médium (BME) a jeho modifikace
(např. EMEM, AMEM, DMEM, GMEM, JMEM)
 RPMI média
(např. RPMI 1629, RPMI 1630, RPMI 1640)
 další média užívaná se sérem
(např. Fischerovo, Williamsovo)
 média užívaná bez séra
(TC199, MCDB)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
25
 práce v tzv. laminárních boxech (HEPA filtry) typ
podle úrovně Biosafety Level (BSL)
 jednorázový plastik
(sterilizováno radiací)
 sterilní sklo, nástroje a roztoky
(horkovzdušná sterilizace, autoklávování)
 antibiotika
(běžně směs Pen/Str, případně gentamycin,
amphotericin, nystatin)
STERILNÍ PROSTŘEDÍ
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
26
BSL-1
 mikroorganismy, které nezpůsobují onemocnění u
zdravých dospělých; standardizované lidské a
živočišné buněčné linie
BSL-2
 běžné patogeny středního rizika, mohou způsobovat
různě závažná onemocnění, která lze dobře léčit (HBV,
Salmonella, Toxoplasma, klinický materiál - krev, tělní
tekutiny, tkáně; některé sbírkové linie - např. HeLa)
ÚROVNĚ BIOLOGICKÉHO RIZIKA
= BIOSAFETY LEVELS (BSLs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
27
Laminární box - biohazard třída I
horizontální vertikální
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
28
HEPA filtry
(částice > 0,3 mm)
Laminární box - biohazard třída II
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
29
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
30
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
31
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
32
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
33
BSL-3
 lokální nebo exotické patogeny vysokého rizika,
respiračně přenosné, způsobují závažná a potenciálně
letální onemocnění, která jsou obtížně léčitelná
 Mycobacterium tuberculosis, virus encefalitidy St. Louis,
antrax
BSL-4
 extrémně rizikové patogeny, respiračně přenosné,
způsobují letální onemocnění, proti nimž neexistuje
léčba ani vakcinace
 hemorrhagické viry (Ebola, Marburg)
ÚROVNĚ BIOLOGICKÉHO RIZIKA
= BIOSAFETY LEVELS (BSLs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
34
BIOSAFETY LEVEL 3 (BSL-3)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
35
BIOSAFETY LEVEL 4 (BSL-4)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
36
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
37
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
38
(Treated for cell culture)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
39
Cell factories
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
40
Typy kontaminací
 mykoplazmata
 viry
 bakterie, plísně, kvasinky
 kontaminace jinou buněčnou linií
(cross-contamination) – autentizace linií (!!!)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
41
Kontaminace – mykoplazmata
Detekce mykoplazmat:
a) fluorescenční mikroskopie
(značení DNA)
b) PCR – specifické primery
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
42
Autentizace linií
Profil STR (short tandem repeats):
• srovnání se sbírkou nebo jiným vzorkem
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
43
KULTIVAČNÍ POSTUPY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
44
invertovaný mikroskop
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
45
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
46
Typy buněčných kultur:
 adherované:
rostou přichycené na pevném podkladu
 suspenzní:
rostou volně v médiu
Kultivace na živné vrstvě (feeder-layer):
 obvykle inaktivované myší buňky (fibroblasty,
peritoneální makrofágy)
 hybridomy, embryonální kmenové buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
47
Suspenzní kultury
 odstranění starého média centrifugací
 naředění buněk v čerstvém médiu
 přenesení do nové kultivační lahvičky/misky s
čerstvým médiem
Adherované buňky
 odstranění starého média, oplach v pufru
 uvolnění buněk z podkladu proteolýzou fokálních
adhezí (trypsin / EDTA/ accutase)
 inaktivace trypsinu přidáním séra
 alternativa: mechanické uvolnění (škrabky)
 centrifugace, naředění buněk v čerstvém médiu
 přenesení do nové kultivační lahvičky/misky
s čerstvým médiem
SUBKULTIVACE (PASÁŽOVÁNÍ)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
48
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
49
TYPY KULTIVACÍ
(TERMINOLOGIE)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
50
TKÁŇOVÉ KULTURY / CELL CULTURES
 orgánová/tkáňová kultura (organ/tissue culture)
trojrozměrná kultura nerozvolněné tkáně, která si
uchovává histologické znaky a vlastnosti původní
tkáně v prostředí in vivo
 buněčná kultura (cell culture)
kultura odvozená z jednotlivých buněk, které už
nejsou spojeny do struktury tkáně
 primokultura / primární kultura (primary culture)
buňky v kultuře jsou získány přímo z původní tkáně
nebo fragmentu orgánu
primární buňky, primární linie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
51primokultura multiformního glioblastomu - 5. den
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
52primokultura multiformního glioblastomu - 12. den
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
53primokultura multiformního glioblastomu - 12. den
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
54
Buněčná linie
 populace buněk odvozená z primokultury při první
pasáži a dále udržovaná v podmínkách in vitro
(pasáž = přenos buněk z jedné kultivační nádobky
do nádobky nové)
 diploidní (normální nenádorové buňky)
 stabilizovaná (nádorově transformované buňky)
 charakterizace buněčné linie:
označení (název), druh organismu, pohlaví, věk,
výchozí orgán, typ kultury, počet pasáží, růstové
parametry, morfologie, karyotyp, markery
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
55
Buněčný kmen
 buněčná populace, získaná subkultivací z původní
linie - vyselektována na základě exprese určitého
znaku
Buněčný klon
 buněčná populace, vzniklá pomnožením jediné
buňky, izolované z původní linie
 všechny buňky v buněčném klonu teoreticky
identické, avšak v praxi určitý stupeň
heterogenity
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
56
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
57
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
58
NORMÁLNÍ A
TRANSFORMOVANÉ
BUNĚČNÉ LINIE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
59
Růstové parametry buněčných linií:
 generační doba
období mezi dvěma mitózami = délka buněčného
cyklu
 population doubling time (PDT)
čas, potřebný ke zdvojnásobení počtu buněk v
populaci
 lifespan (délka života)
geneticky naprogramovaný počet dělení buňky
 kontaktní inhibice
zástava proliferace po dosažení určité limitní
saturační density
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
60
Kontaktní inhibice
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
61
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
62
Diploidní buněčné linie:
 normální nenádorové buňky
 omezená délka života in vitro
 standardní karyotyp (diploidní)
 obvykle anchorage-dependent
(vyžadují podklad k přichycení = náhrada ECM)
 schopnost kontaktní inhibice
 tzv. "stárnutí kultury" = změna morfologie a
růstových parametrů se vzrůstající dobou v
podmínkách in vitro
 LEP (lidské embryonální plíce)
HPLC (lidské lymfocyty periferní krve)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
63
Stabilizované buněčné linie:
 nádorově transformované buňky
 neomezený generační potenciál = nesmrtelnost
v podmínkách in vitro
 kratší PDT, redukovaná závislost na podkladu
 obvykle heteroploidní, resp. aneuploidní
 často bez schopnosti kontaktní inhibice
 lidské adherované: HeLa, A431, MCF-7, Saos-2…
lidské suspenzní: HL-60, Jurkat, HeLa-S…
L929, 3T3 (myší fibroblasty),
CHO (chinese hamster ovary)
MDCK (Madine-Darby canine kidney)
VERO (African green monkey kidney)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
64
Rozdíl v počtu chromosomů během kultivace
normální buňky
(gliové buňky)
transformované buňky
(maligní melanom)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
65
PRAKTICKÉ APLIKACE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
66
 základní výzkum (buněčná biologie, cytogenetika,
onkologie, imunologie, biochemie, molekulární
biologie, virologie…)
 prenatální diagnostika
 toxikologie (testy léčiv, kosmetických přípravků,
implantátů
 reprodukční medicína (IVF)
 klinická onkologie (typizace nádorů, testování
multidrug resistance, hodnocení markerů)
 výroba očkovacích látek (virové vakcíny)
 průmyslová výroba specifických buněčných produktů
(transgenní linie)
 regenerativní medicína (příprava buněčných a
tkáňových derivátů)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
67
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
68
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
69
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
70
KRYOKONZERVACE,
ARCHIVACE,
SBÍRKOVÁ PRACOVIŠTĚ
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
71
Kryokonzervace živočišných buněk
 kultura v exponenciální fázi růstu
 po trypsinizaci resuspendování v zamražovací směsi:
90% sérum (FCS) + 10% kryoprotektivum (DMSO,
glycerol)
 dvoustupňové zamražování:
"pomalý krok" (optimální pokles o 1oC za minutu)
"rychlý krok" (přemístění kryoampulí z -80oC do -
150oC (hlubokomrazící boxy) nebo do -196oC
(kontejnery s tekutým dusíkem)
 rozmražování:
nejprve rychlé ohřátí (rozmražení směsi), pak pomalé
přidávání vychlazeného média (cca 1ml za minutu)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
72
Příklady
kryoprotektiv:
glyceroldimethylsulfoxid
(DMSO)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
73
Vliv rychlosti zamražování na přežití buněk:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
74
American Type Culture Collection (ATCC)
https://www.lgcstandards-atcc.org/Products/All/CCL-2.aspx
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
75
European Collection
of Authenticated Cell Cultures (ECACC)
https://www.phe-culturecollections.org.uk/products/celllines/generalcell/detail.jsp?refId=93021013&collection=ecacc_gc
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 01 / 20.2.2017
76