Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
1
METODY STUDIA
BUNĚČNÉHO ŽIVOTA A
SMRTI IN VITRO
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta MU
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
2
„For every cell,
there is a time to live and a time to die.“
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
3
 typy buněčné smrti
 apoptóza
 metodické přístupy ke studiu apoptózy
 cytotoxicita vs. viabilita
 apoptóza a medicínské aspekty
Program přednášky:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
4
TYPY BUNĚČNÉ SMRTI
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
5
Buněčná smrt:
katastrofická buněčná smrt
 nekróza
fyziologická buněčná smrt
 apoptóza
(programmed cell death type I, PCDI)
kaspáza-dependentní
kaspáza-independentní
autofagie
(programmed cell death type II, PCDII)
hodnocení podle biochemických změn
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
6
KATASTROFICKÁ
(NEPROGRAMOVANÁ)
BUNĚČNÁ SMRT
-
NEKRÓZA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
7
Indukce nekrózy
a) rozsáhlé poškození, při němž už nemohou
být aktivovány mechanismy apoptózy
b) působení stresových faktorů
 změny koncentrace iontů, pH...
 vyčerpání zdrojů energie
 změny teploty
 poškození buňky nebo jejích organel
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
8
Příznaky a průběh nekrózy:
 poškození mitochondriální membrány
 pronikání iontů Ca2+ do mitochondrií
 zakulacení a prasknutí mitochondrií
 ztráta regulace transportu iontů
 zakulacení buňky (swelling)
 lýze buňky
 vznik nekrotického ložiska
 invaze makrofágů
 zánětlivá reakce
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
9
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
10
FYZIOLOGICKÁ
(PROGRAMOVANÁ)
BUNĚČNÁ SMRT
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
11
PROGRAMOVANÁ BUNĚČNÁ SMRT
(Programmed Cell Death, PCD)
• indukovaný, regulovaný a selektivní
proces pro vyřazování určitých buněk
Apoptóza (apoptosis, type I PCD)
• kaspázy
• kalpainy, katepsiny, granzymy
Autofagie (autophagy, type II PCD)
• autofagozomy/autolysozomy
(lysozomální proteázy)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
12
AUTOFAGIE (PCDII)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
13
Průběh autofagie
1. indukce (starvace)
2. vytvoření autofagosomu (nejasný původ, ER?)
3. vazba a fúze s lysosomem
4. rozpad autolysosomálního veziklu
• účast savčích homologů genů Atg (kvasinky)
Typy autofagie:
• mikroautofagie (transfer do lysosomu přímou
invaginací)
• makroautofagie (vznik autofagosomu)
• chaperon-mediated autofagie (CMA) - selektivní
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
14
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
15
Průběh autofagie:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
16
APOPTÓZA (PCDI)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
17
Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H., Currie, A.R.
Apoptosis: A basic biological phenomenon with wide
ranging implications in tissue kinetics.
British Journal of Cancer (1972) 26, 239.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
18
2002 - Nobelova cena za fyziologii a lékařství:
za výzkum genetické regulace vývoje orgánů a
programované buněčné smrti
Sydney Brenner
H. Robert Horvitz
John E. Sulston
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
19
Caenorhabditis elegans
• 959 somatických buněk = dospělý hermafrodit,
navíc 131 podléhá apoptóze
• regulace apoptózy - 14 genů Ced:
indukce: Ced-3 (kaspáza 1), Ced-4 (Apaf-1)
represe: Ced-9 (Bcl-2)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
20
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
21
Příčiny apoptózy
1. Apoptóza je nezbytná pro řádný vývoj organismu:
• resorpce ocásku během metamorfózy pulce v
žábu
• odstranění tkáně mezi prsty během
embryogeneze
• odstranění nadbytečných neuronů při vytváření
synapsí v mozku
• uvolňování endometria na počátku menstruace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
22
odstranění nadbytečných neuronů při
vytváření synapsí v mozku
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
23
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
24
syndaktylie (defekt apoptózy)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
25
Příčiny apoptózy
2. Apoptóza je nezbytná pro likvidaci buněk, které
představují ohrožení integrity organismu
• buňky infikované viry
• efektorové buňky imunitního systému po
odeznění imunitní odpovědi
• buňky s poškozením DNA
zvýšená produkce proteinu p53
(induktor apoptózy)
• nádorově transformované buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
26
Indukce apoptózy
Odstranění pozitivního signálu
• růstové faktory - neurony
• Interleukin 2 (IL-2) - lymfocyty
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
27
Indukce apoptózy
Přijetí negativního signálu
• zvýšení hladiny oxidačních látek v buňce
• poškození DNA (volné radikály, UVR, gama záření,
chemoterapeutika)
• molekuly (death activators), které se napojují na
specifické receptory (death receptors)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
28
Apoptóza vyvolaná vnitřními signály:
• zdravá buňka exprimuje na vnější membráně mitochondrií
BCL-2, ten inhibuje oligomerizaci BAK a BAX
• při vnitřním poškození buňky (poškození DNA, ↑c Ca2+...)
- permeabilizace vnější membrány (póry z BAK, BAX proteinů)
- uvolnění cytochromu-c z mitochondrií do cytoplasmy
• vzniká apoptosom:
APAF-1
cytochrom C
prokaspáza 9
(dATP)
• vzniká aktivní kaspáza 9 (iniciační), která štěpením aktivuje
další kaspázy (efektorové)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
29
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
30
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
31
Změny mitochondrií
změna permeability
mitochondriální
membrány
detekce cytochomu-C
- fl. mikroskopie
- flow-cytometrie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
32
Apoptóza vyvolaná vnitřními signály,
nezávislá na kaspázách
• probíhá i při aplikaci inhibitorů
kaspáz
• průběh smrti je delší
• ztráta mitochondriálního
transmembránového potenciálu
• inhibice respiračního řetězce
• štěpení DNA pomocí AIF
(apoptosis inducing factor)
a ENDOG (endonukleáza G)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
33
Apoptóza vyvolaná vnějšími signály:
• aktivační molekuly (death activators) se napojují na
specifické receptory v plazmatické membráně (death
receptors, DR1-5):
 Tumor necrosis factor  (TNF-) - TNF receptor
 Lymphotoxin (TNF-) - TNF receptor
 Fas-ligand (FasL) - Fas receptor (CD95)
• přenos signálu do cytoplasmy aktivuje prokaspázu-8 (10)
(iniciační kapázy)
• aktivovaná kaspáza-8 (-10) štěpením dalších prokaspáz
spouští proteolytickou kaskádu
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
34
DISC
death-inducing
signaling complex
• ligand
• receptor
• adaptorové proteiny
• prokaspáza-8
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
35
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
36
Apoptóza vyvolaná vnějšími signály:
dependence receptotors (např. DCC)
• rozdílná signalizace:
při navázaném ligandu -> přežívání buňky
po uvolnění ligandu -> aktivace kaspázové kaskády
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
37
Současné rozdělení
regulované buněčné smrti
a) autofagická buněčná smrt
b) apoptóza vyvolaná vnitřními signály, závislá na kaspázách
c) apoptóza vyvolaná vnitřními signály, nezávislá na kaspázách
d) apoptóza vyvolaná vnějšími signály, aktivací death receptors
e) apoptóza vyvolaná vnějšími signály, (de)aktivací dependence
receptors
f) anoikis – smrt způsobená ztrátou kontaktu k podkladu nebo okolním
buňkám (mechanismus vnitřní apoptózy)
g) cornification (keratinizace) - terminální diferenciace epidermálních
buněk, vznik vrstvy mrtvých keratinocytů (=stratum corneum)
h) entosis (buněčný kanibalismus) – pohlcení buňky stejným typem
(ne fagocytem), postupná degradace ve fagozomu
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
38
cornification
entosis
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867407013943
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
39
Současné rozdělení
regulované buněčné smrti
i) mitotická katastrofa – iniciace navození smrti v M-fázi buněčného
cyklu vlivem poškození mitotického aparátu
j) necroptosis (regulovaná nekróza) – smrt vyvolána aktivací death
receptorů při současné inaktivaci kaspáz (8,10)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
40
k) parthanatos – při nadměrné aktivaci PARP (poly ADP-riboza
polymeráza), tvorba PAR, následná degradace chromatinu; popsánu u
mrtvice, diabetu a neurodegenerativních chorob
l) pyroptosis – původně popsáno u makrofágů po infekci (S.
tiphymurium), typickým příznakem aktivace kaspázy-1-> aktivace
pyrogenního IL-1b
m) netosis – odvozeno od NET (Neutrophil Extracelular Trap) =
mikrobicidní struktura složená z chromatinu, histonů a
antimikrobiálních proteinů produkovaná granulocyty
smrt specifická pro granulocyty, nezávislá na kaspázách; silná
vakuolizace cytoplazmy, dekondenzace chromatinu, rozpad membrány
jádra a granulí – podobnosti s autofagií a regulovanou nekrózou
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
41
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
42
METODICKÉ ASPEKTY
STUDIA APOPTÓZY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
43
Průběh apoptózy:
normální
buňka
smršťování rozpad
(fragmentace)
apoptotická
tělíska
(apo-bodies)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
44
1. zmenšení (smrštění) buňky
2. poruchy mitochondrií a uvolnění cyt-C
3. blebbing plazmatické membrány
4. změny v plazmatické membráně
5. kolaps jádra (degradace chromatinu)
6. zvýšená aktivita transglutaminázy
7. aktivace kaspáz, proteolytické štěpení
8. rozpad buňky na apoptotická tělíska
9. fagocytóza apoptotických tělísek
Morfologické a biochemické
příznaky apoptózy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
45
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
46
Metodické milníky studia apoptózy
• morfologické příznaky (1972)
blebbing membrány, kondenzace chromatinu, kolaps
jádra, vznik apo-bodies
• fragmentace DNA (1987)
fragmenty: ladder, zlomy v řetězcích: TUNEL
• aktivace proteolytické kaskády (1995)
produkty proteolytického štěpení
• změny plazmatické membrány (1997)
externalizace fosfatidylserinu: annexin-V
• změny mitochondrií (1998)
změny permeability mitochondriální
membrány, detekce cytochomu C a AIF
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
47
Blebbing plazmatické membrány
• degradace kortikálního cytoskeletu
(fodrin, aktin)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
48
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
49
Základní metodické přístupy studia apoptózy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
50
Změny v plazmatické membráně
• externalizace fosfatidylserinu
(„eat me“ signal)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
51
Změny v plazmatické membráně
• detekce fosfatidylserinu
• Annexin V + fluorochrom
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
52
Změny v plazmatické membráně
• detekce fosfatidylserinu – Annexinem V
• flow cytometrie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
53
Kolaps jádra (degradace chromatinu)
• kondenzace chromatinu na periferních oblastech
jádra
• internukleosomální štěpení DNA
 nízkomolekulární fragmenty: násobky 180bp →
žebříček
• fragmentace jádra
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
54
CAD – kaspázou aktivovaná Dnáza
ICAD – inhibitor CAD
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
55
Principy detekce fragmentace DNA
• stanovení úbytku DNA
• označení a detekce DNA zlomů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
56
Principy detekce fragmentace DNA
• stanovení úbytku DNA
• použití fluorescenční sondy
vázající DNA
• sub-G1 peak
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
57
TUNEL
DAPI
Principy detekce fragmentace DNA
• označení a detekce DNA zlomů
• TUNEL: Terminal deoxynucleotidyl transferase
dUTP nick end labeling
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
58
Aktivace proteolytického štěpení
Kaspázy
• cysteinové proteázy, štěpící na karboxyskupině
kyseliny asparagové
• caspases = cysteinyl-aspartic-acid-proteases
• 14 druhů kaspáz (u člověka):
iniciační (apikální - 8, 9, 10 a 12)
efektorové (exekuční - 3, 6 a 7)
pro-inflamatorní
Katepsiny, kalpainy, granzymy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
59
Aktivace kaspáz, proteolytické štěpení
prokaspáza
kaspáza
aktivní
kaspáza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
60
Aktivace proteolytického štěpení
Substráty kaspáz - proteiny
• „cell death“ proteiny (Bcl-2,Bcl-XL, prokaspázy..)
• regulátory b. cyklu (MDM2, p21, Rb, cyklin A..)
• cytoskelet (aktin, fodrin, cytokeratiny, laminy..)
• DNA metabolismus (ICAD, PARP..)
• RNA metabolismus
• signální dráhy
• transkripční faktory
• proteiny spojené s neurodegenerativními chorobami
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
61
Aktivace kaspáz – imunodetekce
• detekce aktivované kaspázy nebo produktu štěpení
• fluorescenční mikroskopie
• flow-cytometrie
M30 + anti myší IgG-FITC / propidium jodid
detekce fragmentu cytokeratinu 18: protilátka M30
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
62
a-tubulin / DAPI aktivovaná kaspáza 3
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
63
Aktivace kaspáz – imunodetekce metodou WB
Lamin A Poly (ADP-ribose) polymerase
Kaspáza-3
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
64
Rozpad buňky na apoptotická tělíska
• účast nově formované aktinové 3D struktury a
nesvalového myosinu
• apoptotická tělíska obsahují zbytky jádra,
organely a části cytoplazmy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
65
Fagocytóza apoptotických tělísek
• pohlcení apoptotických tělísek okolními buňkami
(makrofágy, dendritické buňky)
• fagocytující buňky vylučují cytokiny, které
zabraňují zánětu ve tkáni
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
66
CYTOTOXICITA
vs.
VIABILITA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
67
Cytotoxicita
• vlastnost faktoru/látky/buněk vyvolávající
buněčnou smrt
• nezávislý jev na mechanismu smrti
• př. cytotoxické T-lymfocyty, NK buňky…
 aktivují receptory smrti – indukují apoptózu
 tvorba perforinových kanálů, lýze buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
68
Studium a hodnocení cytotoxicity
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
69
Porucha soudržnosti plazmatické membrány
• DNA sondy neprocházející do živých buněk
 ethidium bromid
 propidium jodid
 TOTO family
 SYTOX
• barviva vylučovaná ze živých buněk
 trypanová modř
• mikroskopie, analyzátory, flow cytometrie
• umírající apo. buňky mají soudržnou membránu
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
70
Uvolnění cytoplazmatických enzymů
• např. laktátdehydrogenázy (LDH)
1) LDH redukuje NAD+ na NADH a H+ oxidací laktátu
na pyruvát
2) NADH dehydrogenáza redukuje tetrazoliovou sůl na
formazan
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
71
Stanovení proliferace
• analýza syntézy DNA
• inkorporace označených prekurzorů DNA
[3H]-TdR: triciovaný thymidin
BrdU (5-bromo-2’-deoxy-uridin):
analog thymidinu
thymidin bromodeoxyuridin
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
72
• množství cyklujících buněk v populaci: 30-60min
• množství buněk v G0 fázi: 24h
• detekce pomocí protilátky – nutná denaturace
• analýza: mikroskopicky, flow-cytometricky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
73
Stanovení počtu živých buněk
• počítání živých a mrtvých buněk – Bürkerova komůrka
• Trypanová modř
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
74
• Použití automatických analyzátorů na počítání
živých a mrtvých buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
75
Stanovení proliferace v buněčné populaci
• metabolická aktivita – mitochondriální dehydrogenázy
• aplikace substrátu MTT, XTT, WST-1
• kolorimetrické stanovení
• 96-jamkové destičky
 základní výzkum
 testování léčiv a materiálů
 léková rezistence
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
76
Srovnání principu a citlivosti MTT, XTT a WST
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
77
Cytostatický vs. cytotoxický efekt
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
78
APOPTÓZA
A MEDICÍNSKÉ
ASPEKTY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
79
Apoptóza a nádory
Chemo- a radio- terapií indukovaná buněčná smrt
strategie:
• zabránit neregulovanému buněčnému dělení
nádorových buněk
• ovlivnění buněčného cyklu a DNA syntézy u rychle se
dělících buněk
- antimetabolity
- genotoxické látky způsobují apoptózu
- mitotické inhibitory
• defekty v apo dráhách negativně ovlivňují léčbu
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
80
Chemo- a radio- terapií
indukovaná buněčná smrt - signalizace
• indukce poškození DNA – (DNA damage signal)
• přenos z DNA vazebných proteinů na kinázy PI3K rodiny
(ATM, ATR) - funkce v kontrolních uzlech
• fosforylují efektorové kinázy (Chk1, Chk2 a c-Abl)
• fosforylace TF - p53, p73, E2F..
• zvýšení exprese genů – skupiny reparace DNA, zástava
buněčného cyklu a apoptóza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
81
Vztah p53 a apoptózy
• aktivuje mitochondriální apopotickou dráhu
- upregulace proapoptotických genů (Bax, Bid, Noxa,
Puma)
- downregulace antiapoptotických genů (Bcl-2, Mcl-1)
• aktivuje receptorovou apoptotickou dráhu
upregulace death receptorů (Fas, DR4, DR5)
• nezávisle na transkripci
translokace p53 do mitochondrií a vazba na Bcl-2 a
Bcl-XL
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
82
Apoptóza a nádory
Inhibice apoptózy nádorových buněk
bez účasti virů:
• narušení apoptózy aktivované receptory u nádorových buněk (např.)
a) nedostatečná aktivita inicičních kaspáz (8,10) – z důvodu
metylace promotoru, delece nebo mutace genu pro kaspázu-8
(neuroblastom, plicní karcinom, Ewingův sarkom, melanomy)
b) sekrece „decoy“ molekuly, která se váže na FasL a brání její
vazbě na FasR (nádory plic a střeva)
c) sekrece FasL nádorovými buňkami indukuje apoptózu
cytotoxických lymfocytů
• narušení apoptózy spouštěné mitochondriemi u nádorových buněk
(např.)
a) delece a/nebo metylace genu pro Apaf-1 (melanom)
b) nedostatečná aktivita iniciční kaspázy 9 (nádory ovaria)
c) overexprese Bcl-2 z důvodu translokace (leukémie)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
83
Apoptóza a nádory
Viry inhibující apoptózu transformovaných buněk:
tvorba proteinů blokujících apoptózu na různých
úrovních
• receptorová apoptóza
• mitochondriální apoptóza
• p53
• podpora proliferačních signálních drah
• Human papilloma virus (HPV):
exprese proteinu E6 - inaktivátor proteinu p53
• Epstein-Barrové virus (EBV):
produkuje protein, podobný proteinu Bcl-2
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
84
When Cells Die II:
R. A. Lockshin, Z. Zakeri
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
85
Apoptóza a imunitní systém
• nutnost odstranění aktivovaných lymfocytů
• produkují protilátky a cytokiny, jsou cytotoxické
Regulace apoptózy
• omezení růstových faktorů (IL-2)
pro T buňky reagující na vnější a přechodné
antigeny
• pomocí „death“ molekul (Fas ligand)
pro T buňky reagující na vnitřní a trvalé antigeny
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
86
Apoptóza a imunitní systém
defekty v indukci apoptózy a autoimunitní choroby
• neschopnost navození apoptózy a přežívání autoreaktivních
lymfocytů
- mutace ve Fas receptoru (CD95) nebo Fas ligandu
–> lymfadenopatie (zvětšení uzlin), akumulace
lymfocytů
• účast „death“ receptorů a ligandů v poškození
okolní tkáně místo lymfocytů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
87
Defekty v indukci apoptózy a autoimunitní choroby
• systémový lupus erythematodes (SLE),
• lupenka,
• revmatoidní artritida,
• Hashimotovo struma…
systémový lupus
erythematodes
- častěji u žen (90%)
- motýlový erytém na obličeji
- artritida
- zánět ledvin
- nedokrvení periferii
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
88
Autoimunitní choroby:
systémový lupus erythematodes
• porucha funkce makrofágů
• vznik sekundární nekrózy
• uvolnění prozánětlivých látek
• vystavení autoantigenů
• zánět
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
89
Apoptóza a imunitní systém
AIDS:
pokles CD4+ T-lymfocytů
• pouze část infikována HIV, většina umírá apoptózou
• infikované buňky produkují virové proteiny
(Tat, gp120, Nef, Vpu),
• blokují Bcl-2, aktivují pro-kaspázu 8
• změny v expresi cytokinů (↑ IL-4, IL-10; ↓ IL-12, INF-γ)
• viry a jejich proteiny v extracelulární prostoru aktivují
apoptózu v okolních lymfocytech
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
90
Apoptóza a degenerativní onemocnění
Alzheimerova choroba
Parkinsonova choroba
Huntingtonova choroba
nejasné mechanismy indukce apoptózy:
• volné radikály
• nedostatečná hladina nervových růstových faktorů
• vysoká hladina neurotransmiterů
• vnitrobuněčná akumulace toxických proteinů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 02 / 27.2.2017
91