Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
1
FERTILIZACE
A
EMBRYOGENEZE
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta MU
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
2
Program přednášky:
• meióza a gametogeneze
• mechanismy fertilizace
• časná embryogeneze
• hybridi a chiméry
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
3
Způsoby rozmnožování eukaryot
Nepohlavní rozmnožování
• potomstvo geneticky identické s rodičovským
organismem
Pohlavní rozmnožování
• původní kombinace genů zanikají a vznikají
nové → každý organismus je geneticky
jedinečný
• kompetitivní selekční výhoda pro organismy v
nepředvídatelně variabilním prostředí
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
4
HAPLOIDIEDIPLOIDIE
FÚZE GAMET
MEIÓZA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
5
MEIÓZA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
6
MEIÓZA
• dvě po sobě jdoucí dělení:
I. meiotické (heterotypické, redukční)
II. meiotické (homeotypické, ekvační)
Genetický význam meiózy:
• redukce počtu chromozomů při tvorbě pohlavních
buněk
• náhodná segregace chromozomů - v gametách 2n
(223 = 8.388.608) možných kombinací chromosomů
• párování homologických chromosomů, které umožňuje
crossing-over a tím i rekombinaci genů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
7
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
8
Schéma kombinace
chromozomů v gametách
• počet kombinací 2n
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
9
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
10
Premeiotická interfáze
• Meióza I:
profáze I: leptotene
zygotene
pachytene
diplotene
diakineze
metafáze I, anafáze I, telofáze I
• Meióza II:
profáze II, metafáze II, anafáze II, telofáze II
Stádia meiotického dělení
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
11
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
12
Tvorba bivalentů a crossing-over
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
13
Chromatidy v průběhu I.profáze
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
14
SYCP (synaptonemal complex protein ) 1 - 3
Synaptonemální komplex
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
15
Synaptonemální komplex
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
16
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
17
a) Nerovnoměrný crossing-over
• v profázi I
• důsledek: ztráta (delece) v jedné a zdvojení (duplikace)
ve druhé zúčastněné chromatidě
Poruchy meiózy a jejich genetické důsledky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
18
b) Neoddělení (nondisjunkce)
• chromozomy v anafázi I nebo chromatidy v anafázi II
• porucha centromer nebo porucha mitotického aparátu
• důsledek: aneuploidie
Poruchy meiózy a jejich genetické důsledky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
19
GAMETOGENEZE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
20
Srovnání
spermatogeneze
a oogeneze
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
21
• primordiální zárodečná buňka -> spermatogonie
(46, soustavně se mitoticky dělí)
• spermatocyt I. řádu
(46, probíhá meióza I.)
• spermatocyt II. řádu
(23, probíhá meióza II.)
• spermatida
(23, dozrává bez dalšího dělení)
• spermie
(23, uvolňují se do lumina semenných
kanálků)
1 spermatogonie 
 4 haploidní rovnocenné spermie
GAMETOGENEZE: SPERMATOGENEZE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
22
Průběh
spermatogeneze
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
23
Syncytia v průběhu
spermatogeneze
• spojení cytoplasmatickými
můstky
• synchronizované dělení
• spermatogonia typu A =
kmenové b.
• další typy jsou „committed“
• vznik spermatocytů
- regulace GDNF
(glial derived neurotrofic
factor), - sekrece Sertoliho b.
↓c = diferenciace
↑c = self-renewal
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
24
Morfologie spermie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
25
• primordiální zárodečná buňka
(46, mitotické dělení)
• oogonium
(46, mitóza, ve 3.měsíci po oplození vývoj v
oocyty)
GAMETOGENEZE: OOGENEZE
počet oogonií v
ovariu během života
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
26
oocyt I. řádu
(46, začne meióza I, zastavení v profázi ještě před
narozením, při dozrávání se dělící vřeténko přesunuje k
periferii buňky – nerovnoměrné dělení)
oocyt II. řádu (+ pólocyt)
(23, vstupuje do meiózy II, zastavení v metafázi II.)
ovum (+ pólocyt)
(23, meióza dokončena v případě oplození)
GAMETOGENEZE: OOGENEZE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
27
Průběh oogeneze
1 oogonium  1 zralé
vajíčko + 2-3 pólocyty
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
28
Stádia folikulu
primordiální
folikul
primární folikul
jednovrstevný
sekundární
folikul
Graafův
folikul
primární folikul
mnohovrstevný
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
29
REGULACE OOGENEZE
1. regulační bod = diplotene meiózy I
• dlouhodobé zablokování buněčného
cyklu (u člověka až 50 let); u některých
živočišných druhů až do fertilizace
• dekondenzace chromosomů,
počet chromozómů = 2n
genová dávka = 4c
• transkripční aktivita → akumulace
materiálu pro časnou embryogenezi,
růst oocytu
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
30
REGULACE OOGENEZE
diplotene meiózy I => průběh meiózy I
• hormonální stimulace (LH) → Cdk1/cyklin B (MPF =
maturation promoting factor) → kondenzace
chromosomů, rozpad jaderné membrány,
formování spindlu, pokračuje dělení
• anaphase - promoting
complex → spouští anafázi
• proběhne cytokineze
• pouze částečná deaktivace
Cdk1 , přetrvávající M-fáze
(kondenzovaný chromatin,
bez jaderné membrány)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
31
REGULACE OOGENEZE
2. regulační bod = metafáze meiózy II
• po cytokinezi I. meiózy - zvýšení aktivity MPF
• metaphase arrest - u většiny obratlovců až do fertilizace
• anaphase-promoting komplex syntetizován až po
fertilizaci (do té doby blokován)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
32
MECHANISMY
FERTILIZACE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
33
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
34
Kapacitace spermií
• 5-6 hodin (člověk)
• změny lipidů a glykoproteinů plazmatické membrány
(ztráta cholesterou → zvýšení fluidity)
• změna membránového potenciálu (efflux K+)
• influx Ca+ a HCO3
- → aktivace adenylátcyklázy →
syntéza cAMP → indukce kapacitace
• zvýšení metabolismu a pohyblivosti spermie
Kontakt spermie a oocytu
• 300 miliónů spermií v ejakulátu → 200 spermií v místě
fertilizace ve vejcovodu
• termotaxe, změna teploty až o +2°C
• chemoatraktanty uvolňované folikulárními buňkami
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
35
Zona pellucida
• extracelulární matrix oocytu (specifické složení)
• 3 typy glykoproteinů (ZP2+ZP3, ZP1)
• bariéra mezidruhové fertilizace
• ZP3 - receptor druhově specifické vazby, na něj se váže
GalT (galaktosyl transferáza) spermie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
36
Akrosomální reakce
• obsah akrosomu uvolněn exocytózou
• vazba na ZP3 - indukuje zvýšení koncentrace Ca2+ v
cytoplazmě spermií → exocytóza
• hydrolytické enzymy → průchod zonou pellucidou
• vazba proteinů vnitřní akrozomální membrány spermie
na ZP2
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
37
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
38
Mechanismus fúze spermie a oocytu
• u většiny druhů nejasný
• u myši: vazba proteinů ADAM na integriny oocytu
• Fertiliny (α, ) – patří do skupiny ADAM = trans-membránové
proteiny spermií s vazebnou doménou pro integriny oocytu
• CD9 nutný pro fúzi plazmatických membrán (CD9 KO-
nefúzuje)
• po fúzi exocytóza kortikálních granulí
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
39
Mechanismus fúze spermie a oocytu
• u savců nově popsán komplex Izumo1 / Juno
• spermie exprimuje ligand Izumo1
• oocyt exprimuje receptor Juno (folátový receptor 4)
• po fertilizaci je Juno vyloučen v extracelulárních váčcích
• nepřítomnost receptoru na povrchu blokuje polyspermii
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
40
Průběh
fertilizace
vznik polárního
tělíska
změna
konc. Ca2+
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
41
Fúze prvojader
• u nižších živočichů ihned po fúzi gamet
• u savců pouze prostorové přiblížení prvojader
• dekondenzace chromatinu, replikace DNA
• přiblížení prvojader pomocí MT z centriolu spermie
• rozpad jaderných membrán
až při prvním mitotickém
dělení zygoty
• navázání chromozomů na
spindl tvořený z centriolu
spermie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
42
Fúze prvojader
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
43
Mechanismy blokující polyspermii
• primární blok:
depolarizace plazmatické membrány oocytu po fúzi s první
spermií
• sekundární blok - kortikální reakce oocytu:
 uvolnění obsahu kortikálních granulí → enzymy měnící
vlastnosti zony pellucidy (štěpení ZP2, hydrolýza cukerných
zbytků na ZP3)
 intracelulární zvýšení koncentrace Ca2+ (vede k dokončení
II. meiotického dělění)
Důsledky polyspermie:
více centriolů → multipolární spindl → porucha segregace
chromosomů → nondisjunkce → aneuploidie → zástava vývoje
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
44
ČASNÁ
EMBRYOGENEZE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
45
Časná embryogeneze u obojživelníků:
• velmi krátký buněčný cyklus (30 min)
• zmenšování objemu dceřinných buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
46
Časná embryogeneze u obojživelníků:
• 3 fáze vývoje: rýhování, gastrulace, neurulace
• celkem 24h
• 1. a 2. dělení vertikálně, 3. ekvatoriálně
• 5. dělení = 32 buněk = blastula
• 12. dělení = ±4000 buněk = midblastula
• dělení už nejsou synchronizována,
zpomalují se
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
47
Časná embryogeneze u savců:
• zygota – 1. dělení po 24h, 2. a 3. po dalších 12h
vznik blastomer
• morula - do 32 buněk
• blastocysta – od 64 buněk,
• trofoektoderm (3/4), inner cell mass
• = ICM (1/4), blastocoel, zona pelucida
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
48
Gustav Klimt – Danae (1908)
blastocysty
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
49
Časná embryogeneze u savců:
• diferenciace trofoektodermu
a) polární část – přiléhá k ICM, proliferuje
b) murální část – kolem blastocoelu, velké polyploidní b.
• diferenciace ICM
a) epiblast – základ pro 3 zárodečné vrstvy
b) hypoblast – extraembryonální tkáň
• Hatching – opuštění zony pelucidy,
v děloze, proteolytické enzymy
produkované trofoblastem
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
50
Průběh časné embryogeneze u myši
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
51
Průběh časné embryogeneze u člověka
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
52
Tvorba a umístění
zárodečných listů
u lidského embrya
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
53
Inaktivace chromozomu X
• v časné blastocystě inaktivace paternálního X
• zůstává inaktivován v extraembryonálních tkáních
• v ICM se inaktivace ztrácí - později náhodná inaktivace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
54
TVORBA
HYBRIDŮ
A CHIMÉR
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
55
HYBRID
• z genetického pohledu
potomek vzniklý pohlavním rozmnožováním dvou
odlišných homozygotů stejného druhu =>heterozygot
• z taxonomického pohledu
potomek vzniklý z křížení mezi 2 jedinci odlišného
taxonu
 v rámci druhu (mezi poddruhy)-tygr bengálský x sibiřský
 mezi druhy - tygr x lev (Panthera tigris x P. leo)
 mezi rody - ovce x koza (Ovis x Capra)
 mezi čeleděmi - výjimečně
 mezi řády - u živočichů není známo
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
56
MEZIDRUHOVÝ HYBRID
• křížení v rámci rodu (odlišné druhy)
• potomek fenotypově podobný rodičům
• často infertilní (různý počet chromosomů)
• odlišnosti v námluvních rituálech, páření a chování
• jiná sezóna páření
• antigenní reakce na spermie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
57
mul, mezek (63 chr.)
osel (62 chr.) x kůň (64 chr.) - Equus sp.
mul
klisna x osel
mezek
oslice x hřebec
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
58
zeedonk, zonkey
osel (62 chr.) x zebra (32- 46 chr.) - Equus sp.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
59
liger, tigon
lev (38 chr.) x tygr (38 chr.) – Panthera sp.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
60
MEZIRODOVÝ HYBRID
• křížení odlišných rodů
• přirozeně výjimečný výskyt (Toast of Botswana)
• možnost (nutnost) asistované inseminace (cama)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
61
„Toast of Botswana“ (57 chr.), popsán r.2000
ovce (54 chr.) x koza (60 chr.)
odliš Geep = chiméra
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
62
cama
velbloud (74 chr.) x lama (74 chr.)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
63
CHIMÉRA
řecky Χίμαιρα (Chímaira); latinsky Chimaera
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
64
CHIMÉRA
organismus obsahující alespoň 2 geneticky odlišné buněčné
populace původem z odlišných zygot
Vznik:
• ze 4 buněk- dvě zygoty (tetragametická ch.)
• ze 3 buněk – (partenogenetická ch.)
• transplantací kostní dřeně (přenos kmenových buněk)
• spojením cévních oběhů (anastomózy) u dvojvaječných
dvojčat
• z časného embrya a diploidních buněk (fůzí, injekcí)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
65
Tetragametický chimerismus
• vrozený chimerismus - u lidí výjimečně (běžné u primátů)
• spojením dvou zygot (časných embryí)
• riziko i při asistované reprodukci
• organismus obsahuje dvě odlišné sady chomozomů
• orgány a tkáně mají jiný původ
• viditelné rozdíly: barva očí, vlasů, „Hitchhiker's thumb„
(AR), Blaschkovy linie, pohlaví může být hermafroditní
(46,XX/46,XY), 2 populace krvinek (imunologická
tolerance obou skupin)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
66
Hitchhiker's thumb Blaschkovy linie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
67
Tetragametický chimerismus
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
68
Partenogenetický chimerismus
• oocyt podléhá partenogenezi a rozdělí se
• vznik 2 haploidních buněk
• oplozeny 2 spermiemi
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
69
Androgenetický chimerismus
• standardní fertilizace oocytu spermií (23,X)
• vznik sekundárního polárního tělíska
• endoreplikace parentálního prvojádra
• vznik 1 diploidní buňky (46,XX) a 1haploidní (23,X)
• haploidní buňka podléhá endoreplikaci
->androgenetická linie
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
70
VYUŽITÍ CHIMÉR VE VÝZKUMU
• studium vývoje savčího embryogeneze
• ověření podílu kmenových buněk na vývoji embrya
• tvorba „nových druhů“
• medicínský význam
• příprava - agregačně
- injikačně
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
71
D6
D9,5
srdce
chimerické
myši
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
72
počet: cca 0,02% BM MNC
definice: Sca-1+ (stem cell antigen-marker HSC)
lin- (lineage-negative)
CD45- (Leukocyte Common Antigen)
exprimují: SSEA-1, Oct-4, Nanog, Rex-1
velikost: 2-4 µm
schopnost diferenciace do různých linií 3 zárodečných vrstev
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
73
KARDIOMYOCYTY NEURONY
OLIGODENDROCYTY PANKREATICKÉ BUŇKY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
74
Schéma experimentu
VSELs (GFP+)
8-cell embryo
24 h
3-4 dny
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
75
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
76
Chiméry: tvorba „nových druhů“
geep (kovce?) chiméra kozy a ovce (ne hybrid)
poprvé v roce 1978 Austrálie, Dr. R.S. White
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
77
Chiméry: medicínský význam
Výzkum krvetvorby a krevních chorob:
• hematopoetické kmenové b. z lidských fetálních jater
• intraperitoneální injekce do fetu ovce
• lymfoidní prekurzory přetrvávaly až 3,5 roku po
transplantaci
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
78
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
79
Náhrada orgánů
• prekurzorové ledvinové b. z lidské fetální tkáně
• transplantace do myšího embrya
• diferenciace ve funkční nefrony a podpůrné tkáně
• tvorba miniaturního funkčního orgánu - produkce moči
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
80
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
81
Výzkum neurodegenerativních chorob:
• hESCs implantovány do myšího fetálního mozku
• diferenciace ve funkční linie neurálních buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
82
2 dny po injekci D 8,5
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
83
• 2012 - první primátí uměle vytvořená
chiméra
• model: Makak rhesus
• vznik: agregace 6 x 4-buněčná zygota
• narození: Roku+Hex (dvojčata), Chimero
• bez vývojových vad
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
84
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
85
Podíl lidských kmenových buněk (hiPSCs) na tvorbě postimplantačního
prasečího embrya – 28. den
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 03 / 6.3.2017
86