Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 1 prof. RNDr. Renata Veselská, Ph.D., M.Sc. Ústav experimentální biologie Přírodovědecká fakulta MU LÉKAŘSKY ASISTOVANÁ REPRODUKCE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 2 ▪ neplodnost a její příčiny ▪ lékařsky asistovaná reprodukce ✓ historický vývoj ✓ základní rozdělení a přehled metod ✓ IVF a její modifikace ▪ in vitro fertilizace ✓ Historický vývoj ✓ Standardní průběh a modifikace IVF ▪ klonování člověka ✓ Klonování pro výzkumné účely / terapeutické klonování ✓ Reprodukční klonování ▪ příprava umělých gamet Program přednášky: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 3 NEPLODNOST A JEJÍ PŘÍČINY Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 4 ▪ snížená nebo chybějící schopnost zplodit potomka (NE kompletní neschopnost mít děti, NE sterilita) ▪ po uplynutí 1 roku při nechráněném pravidelném styku nedošlo k otěhotnění ▪ celosvětové statistiky WHO: 5 - 15 % párů: neschopnost počít dítě 10 - 25 % párů: neschopnost počít druhé nebo další dítě (tzv. sekundární infertilita) NEPLODNOST Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 5 Primární neplodnost = naprostá absence početí i přes pravidelný nechráněný pohlavní styk po dobu jednoho roku Sekundární neplodnost = i přes pravidelný nechráněný pohlavní styk po dobu jednoho roku nedošlo k žádnému novému početí poté, co v minulosti k oplodnění došlo Pravidelné spontánní potraty / kojenecká úmrtnost = úmrtnost živě narozených dětí před dosažením pátého roku života "Neobjasněná neplodnost" = absence početí způsobená faktory jako laktace, antikoncepce, snížená sexuální aktivita nebo z neznámých příčin Kategorie neplodnosti dle WHO Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 6 Příčiny neplodnosti Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 7 ▪ ženská neplodnost poškození vejcovodů, hormonální poruchy ( produkce oocytů), vrozené vývojové vady dělohy, endometrióza, genetické či imunologické faktory neplodnosti (rejekce spermatu), problémy s nidací ▪ mužská neplodnost nízká kvalita spermatu, autoimunitní problémy, aktuální zdravotní stav, urogenitální infekce, poškození chámovodů, koitální problémy ▪ další příčiny neplodnosti vyšší věk při početí, stres, užívání drog a léků, kuřáctví, alkoholismus, vliv životního prostředí Příčiny neplodnosti Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 8 Posun věkových kategorií u žen (1983-2003): Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 9 Pravděpodobnost početí a neplodnosti u žen dle věkových kategorií: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 10 ▪ základní gynekologické vyšetření rodinná, osobní a gynekologická anamnéza, křivka bazálních teplot, mikroabrase endometria, mikrobiální obraz poševní, onkologická cytologie, kolposkopie, případně rentgenové vyšetření dělohy ▪ specializované vyšetření laboratorní hormonální screening, vaginální ultrazvuk, vyšetření spermiogramu, případně komplexní diagnostická laparoskopie a hysteroskopie, genetické, imunologické či urologické vyšetření Základní vyšetření při neplodnosti Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 11 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 12 LÉKAŘSKY ASISTOVANÁ REPRODUKCE Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 13 ▪ chirurgické zákroky ▪ farmakoterapie (např. hormonální léčba) ▪ umělé oplodnění (artificial insemination, AI) oplodnění v organismu ženy ▪ oplodnění ve zkumavce (in vitro fertilization, IVF) oplodnění mimo organismus ženy ASISTOVANÁ REPRODUKCE = jakýkoli medicínský zásah, který napomáhá lidskému rozmnožování Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 14 ▪ umělé oplodnění (artificial insemination, AI) IUI, GIFT ▪ oplodnění ve zkumavce (in vitro fertilization, IVF) IVF-ET , IVF-KET , ZIFT AH MESA , TESE PZD, SUZI ICSI / PICSI, ROSNI Asistovaná reprodukce (AR) zahrnující manipulace s gametami, příp. s embryi: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 15 ▪ umělé oplodnění (AI) ✓ intrauterinní inseminace (IUI) ✓ intrafallopiánní transfer gamet (GIFT) ▪ in vitro fertilizace (IVF) ✓ chirurgický odběr spermií z nadvarlete (MESA) nebo varlete (TESE) ✓ subzonální inzerce spermií (SUZI) ✓ parciální disekce zony pellucidy (PZD) ✓ injekce kulatého jádra spermatidy (ROSNI) ✓ intracytoplazmatická injekce spermií (ICSI / PICSI) ✓ přenos embryí po rozmražení (KET) ✓ intrafallopiánní transfer zygoty (ZIFT) ✓ asistovaný hatching (AH) AR homologní, heterologní Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 16 Intrauterinní inseminace (IUI) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 17 Intrafallopiánní transfer gamet (GIFT) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 18 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 19 ▪ experimenty probíhaly převážně v utajení (zásahy do reprodukce byly považovány za ostudné a nepřirozené) ▪ 1790 – Londýn (1866 – New York): první provedení homologní IUI ▪ 1884 – Philadelphia: první provedení heterologní IUI (zveřejněno 1909) ▪ 1953: první úspěšná IUI s využitím kryokonzervovaného spermatu Historický vývoj metod umělého oplodnění - IUI Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 20 IN VITRO FERTILIZACE (IVF) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 21 ▪ 1944 – první provedení IVF s lidskými gametami ▪ 1978 – narození prvního dítěte počatého metodou IVF ▪ 1982 – první dvojčata po IVF ▪ 1983 – narozeno první dítě po zamražení embrya ▪ 1985 – první známý případ náhradního mateřství ▪ 1988 – poprvé provedena preimplantační genetická diagnostika ▪ 1990 – poprvé použita metoda ICSI ▪ 1997 – první dítě ze zamraženého oocytu Historický vývoj metod IVF Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 22 1978 - Louise Brown (Velká Británie) Československo: 1982 - GIFT 1983 - IVF Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 23 2010 – Nobelova cena za fyziologii a lékařství: ▪ Sir Robert G. Edwards "for the development of in vitro fertilization" Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 24 Nárůst výkonů IVF v letech 1985-1997: Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 25 Základní schéma IVF Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 26 Příklad protokolu hormonální stimulace Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 27 Odběr oocytů po hyperovulaci Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 28 Prodloužená kultivace embryí (5 dní) IVF / ICSI ET Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 29 Asistovaný hatching (AH) ▪ metody narušení ZP (>15 mm): ✓ mechanicky (mikrojehla) ✓ chemicky (enzymy) ✓ laser Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 30 Asistovaný hatching (AH) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 31 Indikace k AH: ▪ věk pacientky nad 35 let ▪ opakované nedosažení těhotenství po transferu kvalitních embryí ▪ zvýšená hodnota FSH u pacientky ▪ zjištění silnějšího obalu embrya ▪ na žádost pacientky Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 32 Intracytoplazmatická injekce spermií (ICSI) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 33 Indikace k ICSI: ▪ selhání oplození vajíček v předchozích cyklech ▪ nízká koncentrace a pohyblivost spermií ▪ získání spermií chirurgickým odběrem z varlete nebo nadvarlete (= MESA/TESE) ▪ potřeba provedení preimplantační genetické diagnostiky (PGD) ▪ na žádost pacientky PICSI ▪ aplikace metody ICSI se zralými spermiemi, které byly selektovány pomocí vazby na hyaluronany Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 34 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 35 Metody pro léčbu poruch pohyblivosti spermií mikromanipulační metody Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 36 Transfer embryí = ET (příp. KET) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 37 Metody: ▪ biopsie (blastomer, blastocysty, polárního tělíska) ▪ genetické testy ▪ eliminace embryí se specifikovanou vadou PID se provádí obvykle v kombinaci s ICSI Preimplantační / pregestační genetická diagnostika (PID / PGD) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 38 Biopsie pólocytu pro účely PID Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 39 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 40 Indikace k PID: ▪ vrozená chromozomální aberace u některého z rodičů ▪ vyšší věk ženy, nebo obou rodičů ▪ porod dítěte s vrozenou vývojovou vadou v rodině ▪ opakované spontánní potraty nejasné etiologie ▪ opakovaná zástava vývoje embryí na prodloužené kultivaci Historický vývoj detekčních metod: ▪ cytogenetika (FISH): 13, 18, 21, X, Y ▪ molekulární genetika: dle indikace / diagnózy ▪ celogenomová analýza Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 41 Pro ženu: ▪ ovariální hyperstimulační syndrom (OHSS), vícečetné gravidity ▪ torze vaječníků, mimoděložní gravidita, preeklampsie, SC, psychické problémy ▪ dlouhodobé riziko nádorových onemocnění ??? Pro dítě: ▪ předčasný porod – (extrémně) nízká porodní váha ▪ riziko nádorových onemocnění ??? Rizika spojená s IVF Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 42 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 43 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 44 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 45 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 46 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 47 KLONOVÁNÍ ČLOVĚKA Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 48 Reprodukční klonování (Reproductive Cloning) ▪ přenos embrya, vzniklého metodou SCNT, do dělohy ženy, následné těhotenství a narození dítěte Terapeutické klonování (Research Cloning) ▪ embryo, vzniklé metodou SCNT, udržováno v podmínkách in vitro ▪ výzkum (genetická kontrola diferenciace) ▪ izolace ESCs a indukovaná diferenciace (buněčná terapie bez problémů s imunokompatibilitou) Tvorba cybridů Varianty klonování člověka (dle zamýšleného cíle) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 49 2001: José Cibelli et al. (Advanced Cell Technology) ▪ 19 rekonstruovaných embryí metodou SCNT: 3 embrya schopna buněčného dělení (max. 6 buněk) ▪ 22 oocytů aktivováno partenogeneticky: 6 embryí se dělilo až do stádia blastocysty Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 50 Hwang WS et al.: Evidence of a pluripotent human embryonic stem cell line derived from a cloned blastocyst. Science 303, 1669-1674, 2004 ▪ ES morfologie, normální karyotyp ▪ embryonální markery ▪ schopnost diferenciace in vitro ▪ 70 pasáží in vitro Hwang WS et al.: Patient-specific embryonic stem cells derived from human SCNT blastocyst. Science 308, 1777-1783, 2005 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 51 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 52 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 53 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 54 2005 - terapeutické klonování člověka povoleno ve Velké Británii (pro výzkumné účely) 2006 - první úspěšné provedení SCNT na lidských buňkách (UK) 2008 - "hybridní" embryo (cybrid): enukleovaný oocyt živočišného původu, jádro lidské somatické buňky) (2003: Čína) Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 55 ??? 2006 - Zavos and Illmense: ▪ 3 "rekonstruovaná" lidská embrya (SCNT), z toho 1 se vyvíjelo do 4buněčného stádia ▪ následná implantace do dělohy příjemkyni – gravidita se nepotvrdila http://www.zavos.org/library/UAAN_A_150346.pdf Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 56 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 57 PŘÍPRAVA UMĚLÝCH GAMET Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 58 2007 - Universities of Göttingen and Münster Medical School of Hannover ▪ "umělá spermie": spermatogonium připravené transdiferenciací buněk kostní dřeně následná diferenciace do fenotypu spermií ▪ neověřeno! Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 59 2009 - Karim Nayernia ▪ "umělá spermie" ▪ neplodný muž → jádro somatické buňky → SCNT → blastocysta → odběr hESCs → diferenciace do fenotypu spermií Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 60 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 61 2015 – "Three parent babies" ▪ britská vláda schválila návrh umožňující vytváření embryí z DNA 3 lidí Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 62 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 63 Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 05 / 20.3.2017 64