Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
1
DIFERENCIACE
BUNĚK
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta MU
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
2
Program přednášky:
• diferenciační potenciál buněk
• diferenciační dráhy
• růstové faktory
• indukovaná diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
3
Vývoj mnohobuněčného organismu
 identický genom ve všech buňkách
 kontrola na úrovni genové exprese
 buněčná proliferace
 diferenciace buněk
 buněčné interakce
 metabolismus buněk
 pohyb buněk
 buněčná smrt
Lidský organismus:
1 zygota → 1013 buněk (250 různých typů)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
4
Faktory „A“Faktory „B“
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
5
DIFERENCIAČNÍ
POTENCIÁL BUNĚK
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
6
Časná embryogeneze u savců:
zygota
morula (8, resp. 16 buněk = blastomery)
blastocysta (~ 64 buněk)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
7
Blastocysta:
 trofoektoderm → extraembryonální tkáně
(placenta)
 inner cell mass (ICM) → embryo
Gastrulace → 3 zárodečné listy:
 ektoderm (neurální a epidermální buňky)
 mesoderm (svalová a pojivová tkáň)
 endoderm (epitel vnitřních orgánů)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
8
Ektoderm
 CNS
 sítnice a čočky
 lebeční a senzorická ganglia a nervy
 pigmentové buňky
 pojivová tkáň hlavy
 epidermis
 vlasy, ochlupení
 prsní žlázy
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
9
Mesoderm
 lebka a kostra
 svalová tkáň (lebka i kosterní svalstvo)
 dermis
 pojivová tkáň
 urogenitální systém
 střevní svalovina
 srdce
 krevní a lymfatické buňky
 slezina
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
10
Endoderm
 žaludek
 tračník
 játra
 slinivka
 močový měchýř
 epiteliální výstelka průdušnice, plic, hltanu,
štítné žlázy, střev
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
11
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
12
Totipotence
 nelimitovaný diferenciační potenciál
 schopnost tvořit embryonální i extraembryonální
tkáně
 časná stádia rýhování zygoty (1-4 dny)
Pluripotence
 schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů
 buňky ICM (embryonální kmenové buňky, 5-14dní)
Multipotence
 schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáně
 např. hematopoetické kmenové buňky, neuronální
kmenové buňky…
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
13
totipotentní buňka
(zygota, blastomery)
pluripotentní buňky
(embryonální kmenové)
multipotentní buňky
(hematopetické kmenové)
progenitorové buňky
terminálně diferencované
buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
14
Rozdíl v diferenciačním
potenciálu kmenových a
progenitorových buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
15
Eukaryontní buňka:
• 5000 různých bílkovin (109 - 1010 molekul)
• každý buněčný typ vytváří asi 100 specifických
proteinů
• housekeeping genes:
exprimovány konstitutivně na relativně
konstantní úrovni ve všech buňkách
organismu
• housekeeping proteins:
esenciální metabolické enzymy, buněčné
komponenty
• exprese různých genů závisí na typu buňky, fázi
buněčného cyklu atd.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
16
Příčiny diferenciace:
• postupné změny v aktivitě genů
• odpověď na molekulární signály vysílané
ostatními buňkami
• odpověď na fyzikální kontakt s ostatními
buňkami
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
17
Signály regulující diferenciaci
 Solubilní regulátory
• Hormony (glukagon, hydrokortison, tyroxin,…)
• Růstové faktory (TGF-transformující růstový faktor,
FGF-fibroblastový růstový faktor, interleukiny, …)
• Vitaminy (D, A …)
• Ionty (Ca2+, …)
 Fyzické kontakty mezi buňkami (gap junctions)
 Kontakt buněk s mezibuněčnou matrix (kolagen, laminin,..)
 Polarita a tvar buněk
 Fyzikální parametry prostředí (teplota, parciální tlak O2, …)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
18
Molekulární mechanismy diferenciace
 nejdůležitějším místem regulace je iniciace transkripce
 vazba regulačních proteinů na specifické sekvence DNA
(regulační oblasti)
 relativně malý počet strukturních motivů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
19
Molekulární mechanismy diferenciace
• 2 základní mechanismy účinku regulačních proteinů:
a) ovlivnění vazby RNA polymerázy a transkripčních
faktorů na promotor
b) lokální modifikace struktury chromatinu v oblasti
promotoru
• kombinace regulačních proteinů
• u člověka asi 3000 TFs (predikovaných)
• ±5 TFs působí společně a reguluje transkripci jednoho
genu
• jeden TF reguluje více genů (pozitivně i negativně)
• tkáňová specifita
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
20
Zachování exprese genů po rozdělení buňky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
21
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
22
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
23
DIFERENCIAČNÍ
DRÁHY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
24
Diferenciace
buňky směřovány do určitého vývojového směru (linie) –
tento stav nelze měnit (například buňky erytroidní linie
„nepřeskočí“ do linie myeloidní)
Dediferenciace
ztráta diferencovaného fenotypu
• je obvyklá in vitro (adaptace na kultivační podmínky)
• in vivo u nižších živočichů (regenerace obojživelníků)
• experimentálně – příprava iPS cells
Transdiferenciace
schopnost určitých buněk určité tkáně (včetně SCs nebo
progenitorů) diferencovat do buněk typických pro jiné
orgány nebo tkáně (např. hematopoetické)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
25
Epigenetic landscape:
H.C. Waddington (1957)
Epigenetic landscape:
T. Graf & T. Enver (2009)
- role transkripčních faktorů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
26
Indukovaná transdiferenciace
a dediferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
27
Diferenciační potenciál hematopoetických
kmenových buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
28
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
29
Diferenciace
krevních buněk
- vliv růstových
faktorů a jiných
cytokinů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
30
Vliv TFs na
diferenciaci
krevních buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
31
Porucha diferenciace krevních buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
32
Průběh neuronální diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
33
TGF- superfamily
• TGF-  (1-3)
(transforming/tumor
growth factor)
• BMPs
(bone
morphogenetic
proteins)
• nodal
• activin
Růstové faktory
• FGF
• LIF
Regulace neuronální diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
34
Neuronální
diferenciace
Kmenová buňka:
• nestin
• GFAP
• DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
35
Neuronální
diferenciace
Progenitorová
buňka:
• b-tubulin III
• GFAP
• DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
36
Neuronální
diferenciace
Neurony:
• b-tubulin III
• DNA
Gliové buňky:
• GFAP
• DNA
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
37
Diferenciace příčně pruhované svaloviny
diferenciaci doprovází
• zástava buněčného cyklu
• změna morfologie
• fúze v syncytia
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
38
Diferenciace příčně pruhované svaloviny
• svalové prekurzory exprimují TF: mrf4, myf5 a myoD
• in vitro: po odstranění růstových faktorů se spustí
diferenciace
• exprese svalově specifických proteinů:
myogenin, svalový aktin, myosin II, tropomyosin ...
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
39
RŮSTOVÉ
FAKTORY
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
40
Růstové faktory (Growth Factors)
vazba na příslušný membránový receptor
aktivace specifické intracelulární signální dráhy
stimulace přežívání a růstu buněk (metabolismus,
zvyšování objemu, antiapoptotické)
některé fungují i jako mitogeny (aktivace MAPKs)
Induktory / inhibitory diferenciace
např. cytokiny, hormony (insulin), ... růstové
faktory
Cytokiny
signální proteiny ovlivňující buněčnou proliferaci,
diferenciaci a imunitní odpověď
(interleukiny, INFs, G-CSF, GM-CSF, chemokiny...)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
41
Příklady cytokinů
EPO (Erythropoietin)
• produkce v ledvinách
• stimulace tvorby erytrocytů
• rekombinantní EPO (cyklistika)
TPO (Thrombopoietin)
• produkce ve slezině a v ledvinách
• stimulace tvorby megakaryocytů, krevních
destiček
G-CSF (Granulocyte Colony Stimulating Factor)
• stimulace tvorby granulocytů/neutrofilů
GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony
Stimulating Factor)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
42
Příklady růstových faktorů
EGF (Epidermal Growth Factor)
• specifická vazba na EGFR (Epidermal Growth Factor
Receptor) → aktivace RTK kaskády
FGF Family (Fibroblast Growth Factor)
• 22 molekul
• FGF2 = bFGF (basic fibroblast growth factor)
• receptory FGFR1-4
VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)
• stimulace vaskulárních endotelií → angiogeneze
• v případě hypoxie - exprese HIF-1α -> VEGF
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
43
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
44
TGF (Transforming/Tumor Growth Factor)
• up-regulace u některých typů nádorů
• schopnost indukovat nádorovou transformaci v
podmínkách in vitro (krysí fibroblasty ledvin)
• TGF-α (makrofágy, mozkové buňky,
keratinocyty): vývoj epitelu - příbuznost s EGF,
vazba na EGFR
• TGF- - isoformy  1,  2,  3: diferenciace
buněk, vývoj embrya, regulace imunitního
systému, apoptóza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
45
Neurotrofiny
produkovány cílovou tkání → přežívání neuronů,
neuronální diferenciace
• receptory:
p75, Trk receptory (A,B,C)
• NGF (nerve growth factor)
• BDNF (brain-derived
neurotrophic factor)
• NT-3 (neurotrophin-3)
• NT-4 (neurotrophin-4)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
46
Pleiotropní efekt BDNF
Hematopoetic Precursor Cell
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
47
BDNF-indukovaná neovaskularizace
HPCs- hematopoietic precursor cells, MCs - mural cell, ECs endothelial cells
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
48
RECEPTOROVÉ TYROZIN-KINÁZY
funkce: regulace proliferace, diferenciace, metabolismu, aj.
lidský genom: 59 genů (alternativní sestřih), 20 receptorových rodin
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
49
DOMÉNY :
• extracelulární (receptorová)
• transmembránová
• cytoplasmatická (tyrozin kinázová)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
50
AKTIVACE:
dimerizace vlivem růstových faktorů → cross-fosforylace
a) → konformační změna – stimulace katalytické aktivity
b) → tvorba vazebných míst pro domény adaptorových
proteinů (Grb-2)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
51
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
52
INDUKOVANÁ
DIFERENCIACE
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
53
Indukovaná diferenciace
 induktory diferenciace (růstové faktory, vitamíny,
inhibitory kináz, změny v kultivaci, syntetické
látky…)
 indukce příslušné diferenciační dráhy
 inhibice signálních drah pro „self-renewal“
Příklady induktorů diferenciace in vitro:
 kyselina all-trans retinová (ATRA)
 1,25-dihydroxycholekalciferol (1,25(OH)2-D3)
 phorbol myristylacetát (PMA)
 trichostatin
 dimethylsulfoxid (DMSO)
 SU5402 (inhibitor FGFR1)...
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
54
Kyselina all-trans retinová (ATRA)
jako induktor diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
55
1. vazba na jaderné receptory (RAR, RXR)
2. vazba komplexu na regulační oblast (RARE)
3. acetylace histonů  aktivace transkripce
Kyselina retinová (RA) jako modelový
induktor diferenciace (a morfogeneze)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
56
Linie HL-60:
• induktory granulocytární diferenciace:
kyselina all-trans retinová (ATRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktory monocyto/makrofágové diferenciace:
phorbolmyristyl acetát (PMA)
1,25-dihydroxyvitamin D3
• lidská myeloidní leukémie
• spontánní diferenciace:
asi 10 % buněk populace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
57
Diferenciace linie HL-60 do stádia granulocytů:
Induktor: 1mM kyselina all-trans retinová
Marker: CD-66b (CD-67)
Detekce: anti-CD66b (II. Ab-FITC)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
58
Diferenciace linie HL-60 do stádia makrofágů:
Induktor: 1,6 nM phorbolmyristyl acetát (PMA)
Marker: CD-14
Detekce: anti-CD14 (II. Ab – FITC)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
59
Linie P19:
• myší embryonální karcinom
• 7denní embryo do testes
• „embryoid bodies“ (EB)
• induktory mesodermální diferenciace:
kyselina all-trans retinová (ATRA)
dimethylsulfoxid (DMSO)
• induktor neuronální diferenciace:
kyselina all-trans retinová (ATRA)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
60
Schéma diferenciace buněk P19
metoda kultivace na
bakteriologických miskách
metoda „visících kapek“
(hanging drops)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
61
Mesodermální diferenciace buněk P19:
Induktor: 0,8% DMSO
Marker: myosin II
Detekce: anti-skeletal myosin, (II. Ab – FITC)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
62
50 mm
ATRA – 1.den
100 mm
DMSO – 2.den
160 mm
ATRA – 4.den
50 mm
DMSO – 4.den
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
63
Neuronální diferenciace buněk P19:
Induktor: 1mM kyselina all-trans retinová (ATRA)
Marker: neurofilamin
Detekce: anti-neurofilament 160 (II. Ab – FITC)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
64
Praktické využití indukované diferenciace:
 základní výzkum
 diferenciační terapie v onkologii
→ hematologické malignity (APL, AML)
→ vybrané typy solidních nádorů (neuroblastom)
 diferenciační terapie v dermatologii
→ akné
 příprava buněčných derivátů in vitro
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
65
Ablain et The 2011
RA jako induktor diferenciace u APL
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
66
Retinoidy jako induktory diferenciace v klinické praxi:
Vesanoid
(tretinoin, all-trans-RA)
• akutní leukemie
Roaccutane
(isotretinoin, 13-cis-RA)
• akné, neuroblastom
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
67
COMBAT
léčba solidních nádorů (meduloblastom, neuroblastom, sarkomy...)
celecoxib inhibitor cyclooxygenázy antiangiogenní účinek
etoposid inhibitor topomerázy II zástava b. cyklu
temozolomid alkylační činidlo apoptóza
kys. retinová diferenciační činidlo diferenciace/apoptóza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 06 / 27.3.2017
68
Teoretické modely diferenciční terapie
• přímá diferenciace nádorové buňky
• oprava onkogenního mechanismu vede k původní
diferenciaci
• „přesměrování“ na prekurzor  jiná diferenciační dráha
Dela Cruz et Matushansky 2012