Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
1
EMBRYONÁLNÍ A
ADULTNÍ KMENOVÉ
BUŇKY
RNDr. Jakub Neradil, Ph.D.
Ústav experimentální biologie
Přírodovědecká fakulta MU
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
2
 vlastnosti kmenových buněk
 adultní kmenové buňky
 embryonální kmenové buňky
 linie kmenových buněk v podmínkách in vitro
 indukované pluripotentní buňky
Program přednášky:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
3
Totipotence
 nelimitovaný diferenciační potenciál
 schopnost tvořit embryonální i extraembryonální
tkáně
 časná stádia rýhování zygoty
Pluripotence
 schopnost tvořit buňky všech 3 zárodečných listů
 buňky ICM (embryonální kmenové buňky)
Multipotence
 schopnost tvořit buňky příslušného typu tkáně
 např. hematopoetické kmenové buňky, neuronální
kmenové buňky…
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
4
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
5
VLASTNOSTI
KMENOVÝCH BUNĚK
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
6
Kmenové buňky (Stem Cells, SCs)
= buňky z embrya, fetu nebo dospělého
organismu, které se za určitých podmínek
mohou neomezeně množit a rovněž dávat
vzniknout specializovaným buňkám různých
typů tkání
• zdroje kmenových buněk:
embryo, fetus, dospělý organismus
[+ placenta, pupečníková krev]
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
7
TERMINOLOGIE:
• embryonální SCs (ESCs):
 embryonální kmenové (Embryonic Stem Cells)
 embryonální zárodečné (Embryonic Germ
Cells)
 embryonální karcinomové (Embryonic
Carcinoma)
 linie embryonálních kmenových buněk
• dospělé (adultní) SCs (ASCs)
• kmenové buňky nádorů (Cancer SCs, CSCs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
8
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
9
Stemness
• sebeobnova
• diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
10
Sebeobnova (self-renewal)
SCs se mohou dělit po „neomezeně“ dlouhou dobu,
narozdíl od ostatních buněk organismu
Diferenciace
SCs jsou nespecializované buňky, postupnou
diferenciací vznikají specializované typy buněk
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
11
Plasticita (Transdiferenciace)
schopnost adultních SCs určitého orgánu nebo tkáně
diferencovat do jiného druhu tkáně
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
12
Replikační potenciál SCs:
In vivo
 ESCs - tvorba ICM ve stádiu blastocysty
 ASCs - po celou dobu života organismu
In vitro
 ESCs, neuronální ASCs - neomezeně
 většina ASCs – omezené dělení
 telomerázová aktivita
ESCs - symetrická mitóza
ASCs - asymetrická mitóza
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
13
A – kmenová buňka
B – progenitorová buňka
C – diferencovaná buňka
1 – symetrické dělení
2 – asymetrické dělení
3 – dělení progenitorů
4 – terminální diferenciace
Replikační potenciál SCs:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
14
“Niche” (hnízdo) SCs
• mikroprostředí (microenvironment):
podpůrné buňky, extracelulární matrix, adhezní
molekuly a signální molekuly
• udržuje self-renewal SCs
• chrání před deplecí živin
• reguluje proliferaci SCs
• ASCs - po celou dobu
života organismu niche cells
SCs (mitóza)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
15
Diferenciační potenciál lidských SCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
16
ADULTNÍ KMENOVÉ BUŇKY
(ADULT
STEM CELLS, ASCs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
17
Typy ASCs:
• mozek
• krev
• rohovka
• sítnice
• srdce
• tuková tkáň
• kůže
• dřeň zubu
• kostní dřeň
• cévy
• kosterní svalstvo
• střeva
• pupečníková krev
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
18
Lidské SCs kostní dřeně
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
19
Diferenciační potenciál
hematopoetických a stromálních SCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
20
Plasticita hematopoetických SCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
21
Izolace
hematopoetických
SCs pomocí FACS
lin-/CD34+/CD90+
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
22
Fetální kmenové buňky
• primitivní (málo diferencované) buňky v orgánech fétu
• např: KB neurální lišty, hematopoetické KB, pankreatické
progenitory, neurální KB
• izolovány z abortovaných fétů
Kmenové buňky z pupečníku
pupečníková krev – hematopoetické KB (HSCs), endoteliální
progenitory, mezenchymální KB (MSCs), VSELs...
Whartonův rosol – zdroj mezenchymálních KB (MSCs)
• většinou jsou multipotentní
• buňky tvoří kolonie, mohou být kultivovány a mají dlouhé
telomery
• vyšší imunologická kompatibilita než buňky KD
• HSCs - frekvence výskytu minimálně stejná jako v kostní
dřeni
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
23
EMBRYONÁLNÍ
ZÁRODEČNÉ BUŇKY
(EMBRYONIC
GERM
CELLS, EGCs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
24
• vznik z primordiálních zárodečných buněk (PG cells)
• migrují v embryu do genitální lišty
• později společně se somatickými buňkami tvoří gonády
• izolace ve vhodný čas + kultivace in vitro
 pluripotentní EGCs
• lidské EGCs netvoří teratomy ani chiméry
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
25
EMBRYONÁLNÍ
KMENOVÉ BUŇKY
(EMBRYONIC
STEM
CELLS, ESCs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
26
5denní blastocysta
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
27
Schopnosti ESCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
28
Typy mESCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
29
Izolace a indukovaná diferenciace ESCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
30
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
31
LINIE EMBRYONÁLNÍCH
KMENOVÝCH BUNĚK
V PODMÍNKÁCH IN VITRO
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
32
1981 - myší ES buněčná linie:
M.J. Evans and M.H. Kaufman
University of Cambridge, UK
Gail R. Martin
University of California,
San Francisco, CA, USA
1998 - lidská ES buněčná linie:
J.A. Thomson et al.
University of Wisconsin,
Madison, WI, USA
Nobel Prize 2007
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
33
Postup při vytvoření
linie ESCs:
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
34
exprese: AP, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60,
TRA-1-81
exprese a aktivita telomerázy
(A) Gut-like structures (B)
Rosettes of neural epithelium
(C) Bone (D) Cartilage (E)
Striated muscle (F) Tubules
interspersed with structures
resembling fetal glomeruli.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
35
• odstanění zony pelucidy pronázou (proteáza)
• imunochirurgické uvolnění ICM
(anti-lidský IgG, komplement)
• přenesení ICM na feeder-layer (MEFs)
• pasážování mechanicky nebo enzymaticky
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
36
http://portal.gov.cz/app/zakony/zakon.jsp?page=0&fulltext=&nr=227~2F2006&part=&name=&rpp=15#seznam
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
37
Zákon č. 40/2009 Sb., trestní zákoník
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
38
Alternativní metody získání pluripotentních SCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
39
Alternativní metody získání pluripotentních SCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
40
Alternativní metody získání pluripotentních SCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
41
Markery lidských ESCs:
• Oct-4 (TF, octamer-4 binding protein)
• Nanog (homeobox TF)
• Sox2 (TF)
• SSEA3
SSEA4
(povrchové markery: Stage Specific Embryonic
Antigen)
• Tra-1-60
Tra-1-81
(Tumor-Rejection Antigen)
• alkalická fosfatáza (Tra-2-54)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
42
Kultivační médium pro izolaci lidských ESCs:
 DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)
 20% FBS nebo KO-SR (serum replacement)
 aditiva (b-merkaptoethanol, Gln, AAs, Atb)
 růstové faktory: bFGF (FGF2)
 feeder-layer (myší embryonální fibroblasty, lidské
fibroblasty): inaktivace mitomycinem-C
 matrigel
Metody diferenciace lidských ESCs:
 kultivace při vyšší densitě
 kultivace v přítomnosti dalších buněčných linií
 přídavek růstových faktorů / cytokinů do média
 aktivace endogenních transkripčních faktorů
 suspenzní kultura (tvorba embryoid bodies)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
43
Zachování self-renewal
mESCs vs. hESCs
• nepotřebují feeder
• LIF (leukemia inhibitory factor)
• vazba na LIF R a gp130
receptor
• aktivace (fosforylace)
transcripčního faktoru STAT3
• protiháč: ERK1/2 
diferenciace
• specifický marker SSEA-1
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
44
Zachování self-renewal mESCs vs. hESCs
• potřebují feeder layer nebo
• adhezivní matrix (laminin, kolagen IV, heparan sulfát
proteoglykany(HSPGs), entaktin – Matrigel)
• kondiciované médium z MEF
• KO - serum replacement (insulin, transferin, BSA)
• FGF-2 (4ng/ml)
• aktivace signálních drah: FGF, TGFb rodina - activin,
nodal
• protiháč: BMP  diferenciace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
45
Základní signální dráhy ovlivňující
self-renewal a pluripotenci
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
46
feeder-layer
myší vs. lidský
• druhová odlišnost
• odlišnosti v produkci
růstových faktorů
myší lidský _
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
47
hESCs niche
• regulace Smad1 signální (diferenciační) dráhy
• agonista-BMP2 (bone morphogenic factor)
• produkován extra-embryonálním endodermem
• antagonista – GDF3 (growth and differentiation factor (GDF)
• produkován hESCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
48
„Adaptované“ lidské ESCs:
 ESCs v podmínkách in vitro
 změny v karyotypu
 nejčastěji zisky (gains) chromosomů 12, 17 a X
 obdobné změny - markery germinálních nádorů
 prokázáno již od nízkých pasáží
Peter Andrews
University of Sheffield
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
49
Baker et al., Nature Biotechnology 2007
trisomie ch17
zisky a ztráty
částí chromozomů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
50
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
51
Diferenciační protokoly pro ESCs in vitro:
• neurony, astrocyty, oligodendrocyty
• kardiomyocyty
• endoteliální buňky
• pankreatické β-buňky
• CD34+ hematopoetické progenitorové buňky
• antigen-prezentující buňky a NK-buňky
• buňky plicního epitelu
• osteoblasty
• hepatocyty
• melanocyty
• buňky prostaty
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
52
Complete Meiosis from
Embryonic Stem Cell-Derived
Germ Cells In Vitro.
Zhou Q, Wang M, Yuan Y, Wang X, Fu R,
Wan H, Xie M, Liu M, Guo X, Zheng Y,
Feng G, Shi Q, Zhao XY, Sha J, Zhou Q.
Cell Stem Cell. 2016 Mar 3;18(3):330-40.
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
53
Přínos studia kmenových buněk
• Studium vývoje organismů na buněčné a molekulární
úrovni
• Nádorová biologie – nádorové KB
• Tvorba modelů různých onemocnění
• Studium „genových cílů“ pro nová léčiva
• Testování léčiv, teratogenních a toxických sloučenin
• Studium mechanismů regenerace tkání
• Buněčná terapie - náhrada chybějící nebo nefunkční
buněčné populace
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
54
• diferencovaná somatická
buňka
• reprogramace vývoje
• vnesením a spuštěním
vhodných genů
• změna do „embryonálního“
stádia
Indukované pluripotentní kmenové buňky (iPSCs)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
55
• vytvoření iPSCs bez využití embrya
• metoda:“jaderné programování somatických buněk”
• 4 geny : Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4
• retrovirové vektory (náhodná integrace, nádorová
transformace buněk)
• přeprogramování kožní buňky na pluripotentní
• ověřeno diferenciací a podílem iPSCs na tvorbě embrya
(chimerické embryo)
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
56
Schéma tvorby myších iPSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
57
Podíl iPSCs na chimerickém myším embryu
epiblast
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
58
• 4 geny : Oct4, Sox2, c-Myc, Klf4
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
59
• 4 geny : Oct4, Sox2, Nanog, Lin28
• lentivirové vektory (náhodná integrace, nádorová
transformace buněk, nekontrolovaná exprese)
• přeprogramování kožní buňky na pluripotentní
• ověřeno: celogenomová exprese podobná hESCs,
exprese povrchových antigenů, tvorba teratomů po
injekci do imunodeficientní myši
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
60
využití iPSCs
• studium vývoje a funkce tkání
• transplantační medicína
(vlastní buňky)
• vývoj a testování léčiv
• modelování chorob
• léčba genetických poruch (genové inženýrství)
• náhrada za hESCs z embryí
rizika spojená s přenosem a indukcí exprese nových genů
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
61
Příprava tělu vlastních iPSCs
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
62
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
63
• Exprese: Oct4, Nanog, Sox2
• Diferenciace: ektoderm,
mesoderm, endoderm
• Tvorba teratomů
• Tvorba chimér
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
64
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
65
Bi8120 Aplikovaná buněčná biologie / 07 / 3.4.2017
66