Izolace restrikčních endonukleáz z bakteriálních buněk •Příprava hrubého extraktu proteinů z produkčního bakteriálního kmene –Kultivace bakteriálních buněk –Shromáždění, promytí a stanovení výnosu –Lyze buněk sonikací –Částečná purifikace hrubého lyzátu –Průkaz enzymatické aktivity Poznámky k postupu •Práce s velkým objemem potenciálně patogenního organismu Staphylococcus aureus –Buňky centrifugujeme v rotoru 6× 500 ml –Stanovení výtěžku buněk –Promytí v promývacím roztoku •Příprava protoplastů, buňky nesmí lyzovat úplně –Množství lyzostafinu pro lyzi buněk dávkujeme 15 µl na 1 g buněk (koncentrace lyzostafinu 500 µg/ml) –Inkubace na třepací lázni 37°C, vizuální kontrola –Převod do sonikačního pufru (práce s merkaptoetanolem – v digestoři) –Během následující izolace nesmí teplota překročit 10°C Poznámky k postupu •Lyze buněk sonikací –při sonikaci chladíme v ledové lázni –Sonikace, dodržujeme bezpečnostní předpisy •Odstranění zbytků buněk ultracentrifugací –ultracentrifugační kyvety 10 ml nutno vyvážit na předvážkách s přesností na 0,01 g •Vysrážení DNA streptomycinem –provádíme ve sterilní kádince –precipitát odstraníme ultracentrifugací •Dialýza a skladování extraktu •Ověření aktivity Princip stanovení aktivity izolovaných restriktáz •DNA fága 3A není štěpena restriktázou Sau3AI •DNA fága 96 není štěpena restriktázou Sau96I •Jiné fágové a bakteriální DNA jsou štěpeny oběma restriktázami •Vybíráme optimální reakční pufr: A, M, MULTIcore Výsledky v protokolu •Stanovení výtěžku buněk •Izolovaný hrubý extrakt rozplněný do alikvotů •Gel se štěpenými fágovými DNA •Stanovení optimálního reakčního pufru Modifikace konců DNA a klonování produktu PCR •Úloha demonstrující izolaci určitého genu z neznámého genomu s využitím degenerovaných primerů nesoucích restrikční místa –Příprava vektoru pBluescript izolace plazmidu → štěpení dvojicí RE (EcoRI a BamHI) → izolace linearizovaného vektoru z gelu → elektroforéza → stanovení koncentrace DNA –Příprava inzertu PCR → štěpení dvojicí RE (EcoRI a BamHI) → purifikace → elektroforéza→ stanovení koncentrace DNA –Ligace a transformace –Skríning klonů pomocí PCR nebo lyzí varem Obecné poznámky k postupu •Příprava materiálu: –Kompetentní buňky –Neštěpená purifikovaná DNA vektoru •K zabránění znovuspojení konců plazmidu štěpíme dvojicí restriktáz •V průběhu experimentu zařazujeme vhodné kontroly •Práci s GMO evidujeme dle předpisů Poznámky k postupu klonování •PCR a štěpení inzertu a vektoru restriktázami –Příprava dostatečného objemu reakční směsi 4 × 25 µl –Před štěpením RE produkt nutno purifikovat –Výběr vhodného pufru společného pro obě restriktázy –Purifikaci po štěpení RE provádíme současně s naštěpeným vektorem –Nenaštěpený vektror eliminujeme izolací linearizovaného vektoru z gelu z LMT agarózy Poznámky k ligaci •Volba poměru inzertu a vektoru ng vektoru × kb velikost inzertu inzert kb velikost vektoru vektor • •V případě, že neznáme koncentraci: • • • •Používáme rychlý ligační pufr s 10% PEG • • •× molární poměr = ng inzertu vektor inzert 1:3 1:1 3:1 1:5 5:1 Poznámky k transformaci •Z každé ligační směsi provádíme tři transformace (1, 3 a 5 µl ligační směsi) •Médium pro výsev: LBA obsahující 100 µg/ml ampicilinu, 40 µg/ml Xgal a 0.1 mM IPTG •Zásobní roztoky: Ampicilin 100 mg/ml, Xgal 40 mg/ml, 0,1 M IPTG •Kontroly: –Prázdný vektor = ověření frekvence transformace –Linearizovaný vektor = ověření, že nedochází k cirkularizaci bez inzertu –Bez DNA = oběření, že kompetentní buňky jsou citlivé k ampicilinu Skríning rekombinantních vektorů 1.Přeočkování kolonií ve formě dlouhých čárek na misky 2.Izolace plazmidu lyzí varem 3.Štěpení DNA dvojicí restriktáz 4.Elektroforéza 5.Ověření inzertu sekvencováním Výsledky v protokolu •Kontrolní gely s inzertem a vektorem před a po štěpení •Výsledky stanovení koncentrace inzertu a vektrou •Výpočet složení ligační směsi •Počty kolonií – modrobílý test •Gel s rekombinantními vektroy •Sekvence inzertu •Zamražení řádně označených klonů Klonování a exprese fágového lytického enzymu •Úloha demonstrující expresní klonování a funkční test připraveného enzymu –Návrh sekvence primerů pro amplifikaci genu pro účely klonování v transkripčním fúzním vektoru –Příprava vektoru pSP72 izolace plazmidu → štěpení dvojicí RE → defosforylace → izolace linearizovaného vektoru z gelu → elektroforéza → stanovení koncentrace DNA –Příprava inzertu vyštěpení dvojicí RE z pBluescript → izolace inzertu z gelu → elektroforéza→ stanovení koncentrace DNA –Ligace a transformace –Přeočkování klonů na médium pro expresi a funkční test –Zymogram Obecné poznámky k postupu •K dispozici budou: –Připravené kompetentní buňky DE3 –purifikovaná DNA vektoru pSP72 –Purifikovaná DNA pBluescript s inzertem (endolyzin) –Usmrcené autoklávované buňky S. aureus •K zabránění znovuspojení konců plazmidu štěpíme dvojicí restriktáz a defosforylujeme •Vektor neumožňuje provést modrobílý test •V průběhu experimentu zařazujeme vhodné kontroly, vektor i inzert izolujeme z gelu •Postup ligace – viz předchozí experiment •Selektivní médium po transformaci obsahuje pouze ampicilin Výsledky v protokolu •Kontrolní gely s inzertem a vektorem před a po štěpení •Výsledky stanovení koncentrace inzertu a vektrou •Výpočet složení ligační směsi •Srovnání počtů kolonií po ligaci: samotný pSP72, pSP72 + inzert •Gel s rekombinantními vektroy •Fotografie misky s funkčním testem •Zamražení řádně označených klonů Metody přenosu DNA do buněk •Elektroporace dvou typů plasmidů do Staphylococcus aureus •Příprava kompetentních buněk •Stanovení minimální inhibiční koncentrace antibiotik •Příprava selekčních médií •Izolace plasmidů z transformant •Ověření plasmidů pomocí PCR Výsledky v protokolu •Srovnání frekvence transformace obou plasmidů •Výsledky MIC •Srovnání dvou postupů přípravy kompetentních buněk •Foto gelů •