Úvod do terénní zoologie bezobratlých Parazitičtí prvoci Andrea Bardůnek Valigurová andreav@sci.muni.cz Protistologie „Protista“ (Haeckel 1866): jednobuněčné eukaryotické organismy Relativita jednobuněčnosti (syncytia, potravní komunity, kolonie nebo mnohojaderná plazmodia) Starší termíny: „Protozoa“ (Goldfuss, 1818) „zoon“ – heterotrofie „Protophyta“ (E. Haeckel) „Protoctista“ (Hogg, 1861; Whittaker, 1959) „Animalcula“ (Leeuwenhoek, 1676), „Infusoria“ či „Animalcula Infusoria“ (Ledermüller, 1760-1763), „Urthiere“ (von Oken, 1805), „Animalia Microscopica“ (Bory de SaintVincent, 1826), „Eithiere“ či „Oozoa“ (Carus, 1832), „Archaezoa“ (Perty, 1852), „Microzoaires“ (Fromentel, 1874), ……. „Prvoci“ (Presl, 1821, sensu „Infusoria“) Formy protist (dřívější taxony) „PRVOCI“ „ŘASY“ „HOUBY“ Sarcomastigophora (Flagellata + Rhizopoda) Sporozoa Cnidosporidia Ciliata Rhodophyta Chlorophyta Chromophyta Euglenophyta Chlorarachniophyta Dinophyta Cryptophyta Myxomycota Plasmodiophoromycota Labyrinthulomycota Oomycota Hyphochytriomycota Chytridiomycota Eumycota Klasifikace eukaryotů podle Adl et al. 2012: J. Eukaryot. Microbiol. 59 (5) Entamoeba histolytica Amoebozoa – Archamoebae - Entamoebidae Trofozoit • 10-60 m • rozlišitelná endo- a ektoplasma (granuloplasma a hyaloplasma) • eruptivní lobopodie • ve vakuolách bakterie, erytrocyty Cysta • odolnost k chloraci vody • 10-20 m • 1-4 jádra • v mladých cystách glykogenová vakuola • během zrání - chromidie Entamoeba histolytica • kosmopolitní původce střevní a mimostřevní amébózy • forma minuta = neškodný komenzál (tvoří cysty); f. magna = invazivní patogen (netvoří cysty) • rozšíření v rozvojových zemích kvůli špatné hygieně a teplému/vlhkému klimatu • hlavním hostitelem je člověk  měňavková úplavice, může způsobit onemocnění jater • vzácně mohou být infikováni i psi, kočky a hlodavci, • chybí mezihostitel i zvířecí rezervoár • přenos odolnými cystami fekálně-orální cestou, člověk –člověk, při sexuálním styku, alimentární cestou - fekálním znečištěním potravin a vody Invaze střevní stěny mukosa muscularis mucosae submukosa „flask ulcer“  pokud napadne střevní sliznici, způsobuje střevní amébózu  invazivní kmeny mohou proniknout do tkání a způsobit extraintestinální amébózu Acanthamoeba spp. • oportunní paraziti • amfizoické měňavky s kosmopolitním výskytem ve vodě, v půdě, ve vzduchu • trofozoiti cca 25-55 µm, pseudopodie s výběžky – acanthopodie • netvoří bičíkatá stádia • silnostěnné cysty  dvě vrstvy-vnější svraštělá ektocysta, vnitřní hvězdicovitě zvlněná endocysta Amoebozoa – Discosea – Longamoebia - Centramoebida A. lugdunensis trofozoiti cysty kruhový infiltrát neutrofily Acantamébová keratitis (AK) • nebolestivá chronická infekce rohovky  ohrožení zraku • rizikové faktory: kontaktní čočky (80%), poranění oka (20%) • trofozoiti ve stromatu rohovky encystují (cysty) • léčba obtížná dendritická keratitida Granulomatózní amébová encefalitida (GAE) • objev Culbertsonem (1957) v kultuře buněk opičích ledvin pro kultivaci polio vakcíny  A. culbertsoni • první případy u lidí v 70. letech 20. století, 135 případů do roku 1998 • chronické onemocnění (týdny-měsíce) • u oslabených jedinců - při autoimunitních onemocněních, nádorových onemocněních, AIDS, diabetes, alkoholismus • infekce vdechnutím nebo kůží  hematogenní rozsev • chronický ložiskový zánět mozku (nekrotická ložiska) • bolest hlavy, křeče, strnutí šíje, apatie až smrt Excavata - Discoba - Discicristata - Heterolobosea améboidní trofozoit bičíkovec cysta • jednojaderná améba 15-30 µm • kosmopolit, výskyt v průmyslově oteplených vodách a v bazénech • roste až do teploty 45 °C, optimálně při 37 °C • široká laločnatá pseudopodie, amébostom – trogocytóza • stádia: bičíkovce (2 bičíky), améby, cysty sférické a dvouvrstevné • při snížení osmotického tlaku  tvorba bičíkatých stádií Naegleria fowleri Primární amébová encefalitida (PAME) • améboidní trofozoit proniká čichovou sliznicí do mozku – bulbus olfactorius  akutní zánět mozku (průběh fulminantní - velmi prudce, superakutně probíhající, s dramatickými příznaky)  bolest hlavy, horečka, meningeální příznaky, bezvědomí  úmrtí za 3 –7 dnů • intravitální diagnostika obtížná; vyšetření mozkomíšního moku - pohyb améb, barvení trichromem, kultivace 1,5% agar + Aerobacter aerogenes • léčba málo úspěšná Excavata - Metamonada - Fornicata - Diplomonadida jádra přísavný disk • přichycení na stěně tenkého střeva pomocí přísavného disku  porucha vstřebávání sacharidů a tuků v duodenu → steatorrhea (přítomnost tuků ve stolici) • nekrvavý průjem mastného vzhledu s hlenem, bolesti břicha, nevolnost, zvracení • lidská a zvířecí giardióza - epidemie zejména ve vyspělých zemích s imunologicky naivní populací (např. USA) cysta bičíky Giardia intestinalis 1. Cysty i trofozoiti ve stolici (diagnostické stádia). Odolné 4jaderné cysty přežívají měsíce ve studené vodě (přežijí i chlorování). 2. K infekci dochází po požití cyst ve vodě, potravě nebo fekálně-orální cestou. Inkubační doba 1-3 týdny. 3. Excystace v duodenu  uvolnění 2 trofozoitů z každé cysty. 4. Trofozoiti (v tenkém střevě, žlučovodech, žlučníku) se množí podélným binárním dělením a zůstávají v proximální části tenkého střeva - volné nebo přichycené na sliznici. 5. Při přechodu do tlustého střeva dochází k encystaci. Cysty ve stolici jsou infekční  možný přenos z člověka na člověka. Životní cyklus G. intestinalis Excavata - Metamonada - Parabasalia – Trichomonadida Trichomonas vaginalis • lidská urogenitální trichomoniáza (trichomonóza) – kosmopolitní rozšíření; trichomonádová kolpitida běžné populace žen se vyskytuje v 1–2 % • většina mužů a 50% žen jsou „přenašeči“ • časté onemocnění v méně rozvinutých zemích Monocercomonas Tritrichomonas foetus Histomonas Dientamoeba • převážné neškodní komenzálové střev obratlovců a hmyzu • několik parazitických druhů améboidní forma na poševní sliznici • parazituje v ženském dolním genitálním traktu – záněty vagíny a děložního hrdla, pěnovitý výtok, ↑ vnímavost k infekci HIV • žije také v močové trubici a prostatě mužů, ale jen vzácně tady způsobuje onemocnění zánět prostaty a nadvarlat až sterilita • množí se podélným binárním dělením • přenos pohlavním stykem infekčním stádiem je trofozoit • zdá se, že parazit nemá cystickou formu a ve vnějším prostředí nepřežívá dobře Životní cyklus T. vaginalis Excavata - Discoba - Discicristata – Euglenozoa Kinetoplastea - Trypanosomatida glykosomy acidokalcisomy • 1 bičík • výhradně parazitické druhy – jednohostitelské (Crithidia, Leptomonas), dvouhostitelské (Trypanosoma, Leishmania) • během životního cyklu tvoří různé formy (morfy) lišící se polohou jádra, kinetoplastu a bičíku  amastigot (1), promastigot (2), epimastigot (3) a trypomastigot (4) • specializované organely Leptomonas Leishmania Trypanosoma Stercoraria (stercus = trus)  vývoj v přenašeči ukončen v zadní části střeva Salivaria (saliva = slina)  přenašeč - vývoj ukončen v přední části střeva Trypanosomy z ryb a obojživelníků  proboscis pijavek • více než 300 druhů u všech tříd obratlovců • přenos: dvoukřídlý hmyz, ploštice, pijavky, upíři • i kontaminativní přenos Trypanosoma spp. Stercoraria Trypanosoma cruzi Salivaria Trypanosoma brucei Původci onemocnění • lidská spavá nemoc - africká trypanozomiáza • přenos bodalkou tse-tse, 100-300 tisíc nemocných, 5000 ročně umírá • trypanosomy pronikají do mozku a mozkomíšního moku  bolesti hlavy, mozkové příznaky, poruchy spánku a postupující kachektizace  neléčení až smrt  západní forma: Trypanosoma brucei gambiense, přenašeč Glossina palpalis  chronická onemocnění, letargie typická pro pozdější fáze  východní forma: (T. b. rhodesiense), přenašeč G. morsitans  rychle probíhající forma, smrt do několika týdnů Životní cyklus T. brucei Chagasova choroba - americká trypanosomiáza • přenašeči jsou ploštice z podčeledi Triatominae - přenos pouze tehdy když během kousnutí defekují; přenos krví (transfuze, transplantace, těhotenství) • inkubační doba 1-6 týdnů, lokální reakce v místě vpichu a v ½ případů se objeví infekce v blízkosti očí, zvětšení mízních uzlin v místě infekce • po 2-4 týdnech akutní fáze - zaplavení organismu parazity  horečka, dušnost, bolesti břicha, zvětšení srdce či hromadění tekutin na tváři a na nohou • latentní fáze trvá i několik let  chronické onemocnění srdce, malformace na střevě (odumírání gangliových buněk - poruchy peristaltiky), bez léčby smrt myokarditída megacolon Leishmanióza - přenos bodavým hmyzem rodu Phlebotomus a Lutzomyia  viscerální leishmanióza (kala azar - černá horečka): komplex druhů Leishmania d. donovani, L. d. chagasi a L. d. infantum  kožní leishmanióza: L. tropica, L. aethiopica a L. major (Starý svět) a L. mexicana, L. brasiliensis a L. peruviana (Nový svět).  mukokutánní leishmanióza (Espundia): L. brasiliensis Nejvýznamnější vektoři: Triatoma infestans Triatoma dimidiata Rhodnius prolixus Panstrongylus megistus Životní cyklus T. cruzi Alveolata Tetrahymena (Ciliophora) • společný znak - kortikální alveoly • ovlivňují stabilitu povrchu buňky – zajišťují pružnost a zároveň pevnost  Alveolata nepotřebují těžké schránky, často velcí dravci • alveoly nejsou nikdy celistvé mikropóry u výtrusovců • u různých alveolát různé utváření alveolů alveolus plasmatická membrána celulózní plát v alveolu membrána alveolu • alveoly - měchýřky pod povrchem • lokalizace pod plazmatickou membránou alveoly obrněnek - často obsahují celulózové pláty Apicomplexa - jeden nebo několik alveolů „Myzozoa“ • myzocytóza - narušení povrchu buňky kořisti a následné vysávání cytoplasmy • tubulární kristy • plastid u některých zastupců - sekundární červený plastid apicoplast u Apicomplexa - organela plastidového původu obrněnka Amphidinium testudo s chloroplasty Alveolata - Apicomplexa • základní charakteristika – přítomnost apikálního komplexu organel u invazivního stadia (zoitu) • uzavřený konoid • tento složitý aparát slouží k průniku do hostitelské buňky, k ukotvení parazita a k následné tvorbě parazitoforní vakuoly u intracelulárních nebo parazitoforního vaku u epicelulárních zástupců Všechna Apicomplexa jsou parazitická !!!! Apikální konec buňky (apex) zoitu konoid tachyzoit Toxoplasma gondii bradyzoit T. gondii Průnik zoitu do hostitelské buňky T. gondii pronikající do hostitelské buňky Sekvence po sobě rychle následujících procesů: 1. Uchycení zoitu na povrch hostitelské buňky; 2. orientace zoitu a zahájení rozrušování povrchu hostitelské buňky; 3. průnik do buňky, obsah rhoptrií a mikronem se vylévá  část materiálu se inkorporuje do membrány vznikající parazitoforní vakuoly; 4. pokračující průnik, odhození antigenního povrchu zoitu; 5. dotvoření parazitoforní vakuoly. Conoidasida - Gregarinasina Eugregarinorida Gregarina polymorpha • parazitují trávící trakt, gonády a tělní dutiny různých bezobratlých • většinou monoxenní paraziti, relativně velké rozměry • většinou extracelulární vývoj + epicelulární lokalizace vegetativního stadia • pelikula tvoří podélní epicytární záhyby  klouzavý pohyb • infekční oocysta s 8 sporozoity • aseptátní a septátní (epimerit, protomerit a deutomerit) formy trofozoitů solitérní gamonti gamonti - syzygie gametocysty oocysty v řetízkách trofozoiti sporozoit raný trofozoit Životní cyklus G. polymorpha ve střevě larvy potemníka (Tenebrio molitor) jednoduchý epimerit G. steini Gegarina garnhami komplikovaný epimerit Actinocephalus dujardini Beloides tenius Bothriopsides histrio modifikovaný protomerit Neogregarinida merozoiti (šipka) gamonti (hrot šipky) oocysty gamonti (šipky) oocysty (hrot šípky) Mattesia dispora • intracelulární parazit tukového tělesa larev Ephestia kuehniella • autoinfekce oocystami • na konci vývinu parazita larvy zrůžovějí, jsou letargické a nepřijímají potravu  smrt • přítomnost merogonie • převážné intracelulární vývoj v tukovém tělese a Malpighiho žlázách hmyzu • značná patologie až destrukce napadených orgánů Conoidasida - Cryptosporidium Cryptosporidium muris • parazité gastrointestinálního a dýchacího traktu člověka i zvířat  původci průjmových onemocnění savců a onemocnění dýchacího aparátu ptáků • přenos požitím sporulovaných oocyst se 4 sporozoity (bez sporocysty) • monoxenní cyklus; vývoj endogenních stadií je epicelulární v parazitoforním vaku hostitelského původu, obvykle na mikrovilárním povrchu epitelových buněk • autoinfekce (ve střevě) • nekrvavé vodnaté průjmy: u imunokompetentních jedinců infekce spontánně vymizí, u imunodeficitních (oportunní parazité, AIDS)  dehydratace až smrt • ojedinělé případy nebo větší či menší epidemie u lidí • významná je kryptosporidióza telat • léčba neefektivní sporozoit trofozoiti 10 µm oocysta merogonie II merozoiti I merozoiti IImacrogamontimicrogamonti zygota excystace merogonie I invaze hostitelské buňky Životní cyklus C. muris v BALB/c myších Cryptosporidium fragile Neparazitovaný žaludeční epitel Parazitovaný žaludeční epitel Duttaphrynus melanostictus žabí žaludeční buňky parazitované C. fragile mohou vytvářet tzv. „stopky“ Conoidasida – Coccidia - Eimeriorina oocysta E. tenella ze slepic merozoiti ve střevě • jednohostitelští paraziti • napadají většinou střevní epitel - kokcidióza  narušení resorpce živin, dehydratace organismu, ztráta krve, zvýšená vnímavost k jiným patogenům, úhyn • veterinárně významní paraziti chovů slepic a králíků (napadají játra) Eimeria tenella životní cyklus E. tenella řez slepým střevem kuřete v akutní fázi Vývojová stádia E. tenella tkáňové cysty v mozku chronicky infikovaných myší Toxoplasma gondii • dvouhostitelští intracelulární paraziti • kočka (Felidae – jediní známí definitivní hostitelé) – myš a mnoho jiných mezihostitelů včetně člověka (u nás cca 30 %) • zdroj nákazy - nedostatečně tepelně upravené maso nebo potraviny kontaminované trusem nakažených koček, krevní transfúzí a transplantací orgánů, transplacentárně od matky k plodu • původce onemocnění zvaného toxoplazmóza - u člověka průběh podobný chřipce  po odeznění akutní fáze přežívá ve formě tkáňových cyst až do konce života • ovlivnění hostitele - např. zpomalení reakční doby • infekce během těhotenství – kongenitální toxoplazmóza, těžké poškození plodu • v ČR nakažena asi 1/3 populace, jinde (např. Francie) téměř 90% populace Životní cyklus T. gondii 1. Nesporulované oocysty se vylučují s výkaly kočky. Oocysty se vylučují 1–2 týdny, sporulují za 1-5 dní a stávají se infekčními. 2. Mezihostitelé se nakazí požitím kontaminované půdy, vody nebo rostlin. 3. Po požití se oocysty transformují v tachyzoiti invadující nervovou a svalovou tkán  bradyzoiti v tkáňových cystách. 4. Nákaza kočky konzumací mezihostitelů s tkáňovými cystami. Kočky se mohou nakazit i přímo požitím zralých oocyst. 5. Domácí i volně žijící zvířata se mohou nakazit tkáňovými cystami po požití zralých oocyst. 6. U lidí se tvoří tkáňové cysty, nejčastěji v kosterním svalstvu, myokardu, mozku a v očích; setrvávají i po celý život hostitele. Vývojová stádia T. gondii tachyzoiti oocysty bradyzoiti v cystách Aconoidasida - Haemospororida • absence konoidu • definitivním hostitelem jsou členovci • nejvýznamnější je lidský patogen Plasmodium  4 nejvýznamnější „lidské“ druhy  přenos komáry rodu Anopheles  onemocnění malárie (napadeny stamiliony lidí)  malarické záchvaty způsobeny synchronním rozpadem infikovaných krvinek P. falciparum - krevní roztěr modifikace erytrocytů infikovaných P. falciparum Životní cyklus P. falciparum Morfologie krevních stádií P. falciparum meront (schizont, rozeta) gametocyt trofozoit prsténky Protistologická skupina na oddělení parazitologie Hlavní objekty výzkumu:  basální Apicomplexa - gregariny, kryptosporidie a nižší kokcidie (mořské) Cíle výzkumu:  interakce hostitel-parazit  strategie invaze parazita a přichycení k hostitelské buňce  analýza buněčného kortexu a pohybových elementů parazita  funkční morfologie a ultrastruktura buňky parazita  aplikace morfologických a imunocytochemických přístupů při studiu fylogenetických vztahů mezi ranými Apicomplexa  blízká příbuznost gregarin a kryptosporidií !!! Metodické přístupy:  kultivace parazitů in vivo a in vitro (buněčné kultury)  buněčné suspenze, histologie  imunoznačení, cyto- a histochemie  světelná a elektronová mikroskopie  fluorescenční analýza – konfokální mikroskopie a „live cell fluorescence imaging“ pro sledování buněčných procesů  biochemická analýza cílových proteinů, molekulárně-biologické postupy Metody 1. Sběr materiálu vs. experimentální infekce laboratorních zvířat, kultury např. faunistika prvoků udržování parazita pro experimentální účely 2. Zpracování materiálu  odběr materiálu (pro histologii, imunofluorescenci, EM, molekulárně genetické studie,…)  příprava nativních preparátů  fixace  příprava vlhkých nátěrů, roztlaků  příprava řezových preparátů (polotenké řezy, ultratenké řezy)  barvení  imunologické a biochemické postupy  molekulární genetika, fylogenetická analýza 1. flotace - izolace oocyst kryptosporidií z trusu 2. purifikace oocyst 3. experimentální infekce hostitele nebo příprava materiálu pro studie in vitro A. pro studie in vivo  pitva a získání materiálu z nakaženého zvířete B. pro studie in vitro  excystace oocyst a získání inf. sporozoitů pro další postupy 4. fixace a následovné zpracování materiálu Příklad standardních parazitologických postupů Cytologický preparát Zpracování tkání - histologie  odběr  fixace  krájení  tkáně prosycené parafínem nebo pryskyřicí  zmrzlé tkáně  barvení Odběr  Biopsie  punkce (nabodnutí tělní dutiny, kloubu, orgánu nebo patologického útvaru za účelem odběr tekutiny)  excize (vyříznutí)  kyretáž (výškrab)  předoperační biopsie (odběr vzorku tkáně tzv. bioptátu k následnému morfologickému vyšetření)  Nekropsie Postup: 1. oddělení vzorku - velikost tkáňového bločku max. 1 cm2 2. důkladné opláchnutí ve fyziologickém roztoku 3. vložení do fixační tekutiny - ihned po odběru !!! 4. označení vzorků Fixace  rychlá a šetrná denaturace bílkovin bránící autolýze tkání  podmínky fixace  rychlost - odběr, průnik, velikost vzorku (1 cm2, 1 mm2)  zachování struktury  barvitelnost  fixace fyzikální  fixace chemická Fixační tekutiny  formaldehyd (4% formaldehyd, neutrální nebo pufrovaný)  Bouinova (formaldehyd + k. pikrová)  Zenkerova (dvojchroman draselný, sublimát, formaldehyd)  metacarn (formaldehyd, metanol, voda)  Davidson (glycerol,formaldehyd,etanol, voda)  AFA (ethanol, formaldehyd, kyselina octová ledová)  oxid osmičelý, glutaraldehyd Parafínové řezy  odvodnění vzestupnou etanolovou řadou  projasnění xylenem  prosycení parafínem  zalití do parafínu  krájení na mikrotomu (tloušťka řezu 4-10 μm)  rotační nebo sáňkový mikrotom  napínání a lepení řezů na podložní skla Barvení parafínových řezů HE  odparafinování – xylen I, xylen II, 100% etanol, 96% etanol, 70% etanol, voda  barvení hematoxylinem  praní v tekoucí vodě do zfialovění  barvení eosinem  oplach ve vodě – odstranění přebytečného barviva  odvodnění vzestupnou etanolovou řadou  projasnění  montování do kanadského balzámu nebo pryskyřice Damara Histologické řezy histologický řez caeca sarančete s gregarinami (hematoxylin-Bestův karmin) polotenký řez tkáně s gregarinami (toluidinová modř) histologický řez žaludkem ropuchy s kryptosporidiemi (hematoxylin-eosin) Imunoznačení, přímé značení a fluorescence nepřímé (imuno)značení myozinu v trofozoitech gregarin přímé značení aktinu v trofozoitech gregarin pomocí FITC-faloidinu přímé značení nukleových kyselin gregarin pomocí DAPI (A.B) a akridinové oranže (C,D) Olympus CellR - motorizovaný invertovaný mikroskop se systémem rychlé fluorescence pro sledování procesů v živých buňkách Postupy pro elektronovou mikroskopii  fixace  odvodnění  zalévání  krájení ultratenkých řezů  kontrastování ultratenkých řezů  prohlížení v TEM  očištění preparátu  fixace  odvodnění  sušení  lepení preparátu na terčík  pokovení preparátu  prohlížení v SEM Skenovací elektronová mikroskopie (SEM) Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) n Trofozoiti eugregarin epicelulárně přichyceni k střevnímu epitelu hostitele (larvy Tenebrio molitor) Kryptosporidie epicelulárně přichyceny k žaludečnímu epitelu hostitele (exp. infekce u Mastomys natalensis) SEM TEMElektronová mikroskopie „Freeze fracture“ TEM analýza tachyzoit T. gondii invadující hostitelskou buňku pelikulární záhyby na povrchu buňky gregarin Koprologické metody  oocysty kokcidií, ciliata, atd. 1. Přímý nátěr 2. Koncentrační metody: • flotační metody • sedimentace • kvantitativní koncentrační metoda Mc Master 3. Kvantitativní metody • počítání v komůrce (s definovaným naředěním dle potřeby) – např. Cyrusova a Fuchs-Rosenthalova komůrka • flotace a sedimentace standardního objemu (nepřesné díky snížené záchytnosti) 4. Barvení v koprologii Další důležité diagnostické metody v protistologii