Úvod do terénní zoologie bezobratlých jaro 2017 Kateřina Francová Mária Seifertová kfranc@sci.muni.cz r_parazit r_parazit PARAZITOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ RYB se zaměřením na sběr helmintů Ryby pro parazitologické vyšetření: nejlépe živé a čerstvě ulovené (držené v původní nebo odstáté vodě) 1.Usmrcení ryby: omráčení úderem do hlavy a přestřižení páteře → přenesení do pitevní misky s vodou (povrch těla nesmí oschnout!) 2. Záznam údajů: druh ryby, délka (celková, standardní), hmotnost, (pohlaví, stáří) (+ foto s identifikačním číslem) 3. DNA vzorek tkáně hostitele (ploutev, svalovina) 4. Zevní prohlídka ryby (makroskopicky): pijavky, korýši 5. Parazitologická pitva PARAZITOLOGICKÉ VYŠETŘENÍ RYB A.Povrch těla -seškrab slizu s povrchovými vrstvami kůže do Petriho misky • s vodou -prvoci, Monogenea, Posthodiplostomum (Digenea), korýši - - • • • • • • • • •B. Ploutve -odstřižení ploutví → Petriho miska s vodou -prvoci, Monogenea, metacerkárie, glochidie - • ryba2005 Obrázek2 Parazitologická pitva C. Nosní jamky - vypreparování → miska s vodou - Dactylogyrus nasalis (Monogenea) D. Žábry, žaberní dutina, dutina ústní -odstřižení skřelí → izolace jednotlivých žaberních oblouků (celý žaberní aparát) → Petriho miska s vodou -prvoci, Monogenea, metacerkárie, korýši, glochidie E. Orgány dutiny tělní -otevření a prohlídka dutiny tělní: hlístice (Philometra), larvální stadia tasemnic (Ligula) -přenesení jednotlivých orgánů do misek s fyziologickým roztokem (0,65% NaCl) -seškrab vnitřních stěn dutiny tělní ryba1004 •Vyšetření orgánů •- nejprve prohlídka zevní strany (cysty) • •A. kompaktní orgány (játra, slezina, ledviny, …) → kompresní metoda (rozmáčknutí mezi dvěma skly – nejlépe miskami) • • • • • • •B. orgány s dutinou (žaludek, střevo, žlučník, plynový měchýř, srdce) • → rozstřižení nebo roztrhání, poté možno i kompresní metoda • → prohlídka vnitřní stěny a obsahu • http://www.weego.in.th/ImgContent/S/45009846=CHICKEN%20%20LIVER.jpg F. Ostatní orgány Oko: - vyjmutí oční bulvy do misky s fyziologickým roztokem - vyšetření sklivce (Tylodelphys) a čočky (Diplostomum) - roztrhání, kompresní metoda Mozek: - odstřižení lebečního krytu, kompresní metoda •- fixace: 4% formaldehyd nebo 70% ethanol –„naplocho“(viz také následující slajd) NEBO horkým 4% formaldehydem (viz fixace hlístic dále; • možné pouze u Trematoda a Cestoda; Acanthocephala - puchýřky) •- barvení: železitý acetokarmín (IAC) •- montování do kanadského balzámu • • Příprava cizopasníků pro druhovou determinaci: Trematoda, Cestoda, Acanthocephala (!) http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/8/8e/Szalka_petriego.jpg/220px-Szalka_petriego. jpg http://www.raledo.cz/images/gallery/produkty/maticka.jpg http://www.raledo.cz/images/gallery/produkty/maticka.jpg přiměřené zatížení (!prasknutí, homogenizace vnitřních orgánů – ovlivnění morfometrických znaků!) podložní sklo 1 podložní sklo 2 http://www.oocities.org/br/hestevesneto/tax24/Trematoda.jpg http://www.raledo.cz/images/gallery/produkty/maticka.jpg http://www.raledo.cz/images/gallery/produkty/maticka.jpg Fix_staining1.jpg barvení a montování do uzavíracího media Postup fixace „naplocho“ pomocí lehkého tlaku krycího skla (možno použít i pro Monogenea, Diplozoidae (tělo mimo haptor), což je zde ilustrováno) Fixace při mírném zatížení ( narovnaný, lehce zploštělý, nikoliv však prasklý jedinec) a následné barvení jedince umožňuje optimální pozorování taxonomicky významných struktur. Jedinci mohou být barveni ihned po fixaci nebo mohou být skladováni ve fixáži (volně v eppendorfce) a barveni později… voda voda přikapat ethanol ethanol gkrystal-obr111aaa.gif Příprava cizopasníků pro druhovou determinaci: Nematoda (Cestoda, Trematoda, Monogenea) -fixace: 4% formaldehyd zahřátý na 80°C natažení těla, přenesení do ependorfky – uchování -projasnění: směs glycerinu a vody (1:5) -montování do glycerin-želatiny 1. Sběr hlístic do fyziologického roztoku v hodinovém sklíčku 2. Zalití hlístic horkým 4%F (po odstranění přebytečného množství fyz. roz.) gkrystal-obr111.gif 3. Přenesení hlístic do ependorfky olagosta_Eppendorf_(closed).png Čtverzubec zelený – import z JV Asie http://acquariofiliaconsapevole.it/sites/default/files/field/image/tetraodon_fluviatilis_artaev_fis hbase.jpg http://www.aquaportal.bg/Fish/Photos/260_3.jpg http://www.thepufferforum.com/forum/ug.php?g2_view=core.DownloadItem&g2_itemId=14713 Dichotomyctere nigroviridis Čeleď: čtverzubcovití (Tetraodontidae) Místo původního rozšíření: JV Asie (lehce brakické prostředí!) Potrava: masožravec – živá/mražená (šneci, nítěnky, korýši,…) vločkové krmivo Délka života: cca 5-8 let nafouknutí v případě pocitu ohrožení (syn. Tetraodon nigroviridis) http://www.biolib.cz/IMG/GAL/278817.jpg dactylogyrus350 https://www.youtube.com/watch?v=OiOeznXQZuI žaberní paraziti Monogenea (Platyhleminthes) Čtverzubec jako HOSTITEL monogeneí (žábrohlístů) MONOGENEA Kmen: ploštěnci (Platyhelminthes) Způsob života V drtivé většině případů se jedná o ektoparazity vodních živočichů, jejich vývoj je přímý, na rozdíl od ostatních parazitických ploštěnců nemají žádné mezihostitele. Jejich larva se nazývá onkomiracidium, je vybavená množstvím háčků a dvěma páry fotoreceptorů. Po přichycení se na žábry či kůži hostitele se postupně přetváří v dospělce. Vzácně (u 5% zástupců) se může jednat i o endoparazity, ti potom parazitují v močovém měchýři, močovodu, případně střevech obojživelníků, nebo ryb. Dospělí jedinci mají přichycovací hlavové orgány a koncový příchytný terč - haptor. Utváření haptoru je důležité z hlediska taxonomie jednotlivých druhů. Monogenea - taxonomie → snažíme se identifikovat nalezené jedince a zařadit je do již známých taxonů (např. druhů, rodů, čeledí) - v případě nalezení dosud neznámého druhu následuje jeho popis a pojmenování Obrázek1 sklerotizované příchytné háčky haptoru a sklerotizované části reprodukční soustavy = důležité identifikační znaky nutno na vhodně fixovaném jedinci pozorovat, zakreslit, změřit Obr_Mjuni_1.jpg haptor metoda úplného roztlačení červa až k prasknutí dactylogyrus350 1 Obrázekbila 2 Obrázekbila 5 6 Obrázekbila roz •popíšeme •preparát VÁŠ ÚKOL – zhotovení preparátu a)pod preparačním stereomikroskopem hledáme na žábrách monogenea b)parazita přeneseme na podložní sklo… parazit v kapce vody přiklopíme krycím sklem •přidáme GAP fixáž • Monogenea přeneseme pomocí jehel do kapky vody na podložním skle krycí sklíčko připevníme k podložnímu lakem na nehty 3 odsajeme vodu parazit praská filtrační papírek 4 označíme polohu parazita Obrázekbila roz Výsledek obrázku pro centropen xxxxx.png Zpracování monogeneí pro analýzu DNA Druhá část je uložena v 96% alkoholu pro izolaci DNA. Získaná genová sekvence je uložena v databázi GenBank. → rozdělení jedince na dvě části pomocí tenkých jehel GAP (kanadský balzám) xxxxxhl.png PaBades_sp1+2b.tif samčí kopulační orgán Část nesoucí důležité morfologické znaky (sklerotizované struktury) je zcela roztlačena a fixována v GAP pro následnou morfologickou identifikaci. Později může být také převedena do kanadského balzámu (trvalý preparát – vhodné k uložení do muzea). IMG_0030.jpg Kreslicí zařízení Studené světlo (husí krky) 1. Zaostření na pozorovaný objekt 2. Optimální nastavení (poměr) intenzity vnitřního (mikroskop) a vnějšího osvětlení (husí krky) 3. Fixace papíru lepítky 4. Zaostření na špičku tužky Obrázek1 KRESLENÍ POZOROVANÝCH STRUKTUR