Konfokální mikroskopie
a nové trendy ve fluorescenční
mikroskopii
RNDr. Jan Škoda (přednáší Mgr. Blanka Jančeková)
Ústav experimentální biologie PřF MU
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Program přednášky
 Historie a princip konfokálního mikroskopu
 Typy konfokálních mikroskopů
 Dvoufotonový (multifotonový) mikroskop
 Možnosti zobrazení
 Rozlišení a dekonvoluce
 Superrozlišovací mikroskopie
 Lightsheet fluorescence microscopy a TIRF
2
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Konfokální mikroskop
Marvin Lee Minsky
(9. srpna 1927 – 24. ledna 2016)
 kognitivní vědec; studium umělé
inteligence
 studium nervových sítí v mozku
 snaha zaznamenávat děje v živých
tkáních
Standardní (widefield) fluorescenční mikroskop
Neostrý obraz tkáně
mozku z důvodu
zachycení fluorescence
struktur mimo rovinu
ostrosti
ALE JAK?
3Historie a princip konfokálního mikroskopu
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Konfokální mikroskop
 1955 – Marvin Minsky sestrojil první konfokální mikroskop (1961 patent)
 základem 2 konfokální bodové clonky (pinhole apertures)
• a) před zdrojem světla → úzký paprsek světla (světlo do konkrétního bodu)
• b) před detektorem → propustí pouze zaostřené světlo (na úzkou rovinu)
 navržení konstrukce i pro odražené (emitované světlo)
a b
b
a
http://www.google.com/patents/US3013467
4Historie a princip konfokálního mikroskopu
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
DetectorDetectorDetectorDetector
Princip konfokálního mikroskopu
Obě bodové clonky –
tzv. konjugovaných
rovinách ostrosti
(současně zaostřené)
Světlo excituje širokou
oblast vzorku a do detektoru
se dostává i fluorescence
mimo rovinu ostrosti
Bodová clona před
detektorem blokuje průniku
signálů mimo rovinu ostrosti
Konfokální bodová clona zaostřuje světlo do shodné
roviny ostrosti v pozorované oblasti – redukce
nežádoucí fluorescence mimo zaostření
Dichroické zrcátko umožňuje, aby
zdroj světla byl v rámci mikroskopu
umístěn ve stejné rovině jako
dektor
5Historie a princip konfokálního mikroskopu
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Tloušťka optického řezu – průměr bodové clonky
Rozlišení v ose Z = tloušťka optického řezu závisí
na:
 vlnové délce excitace/emise (Rx-y=/2NA)
 numerické apertuře objektivu
 indexu lomu komponent v optické dráze
 průměru bodové clonky (pinhole) → ve
většině konfokálních mikroskopů nastavitelná
velikost clony
 Rz asi 2x větší než Rx-y
Malý průměr bodové clonky – propouští signály z
tenkého řezu → (+) z jiných rovin jsou signály
odfiltrovány; (-) prochází minimum světla
Velký průměr bodové clonky – (+) vyšší intenzita
signálu; (-) propouští signály v rovině ostrosti
i mimo ni
Detector
Detector
6Historie a princip konfokálního mikroskopu
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Konfokální mikroskop dle Marvina Minsky
 omezení neostrého signálu
 zvýšení signálu proti pozadí
 zvýšení rozlišení
 mikroskopie silných a členitých praparátů
s dostatečným rozlišením
× neměl k dispozici vhodný (výkonný) zdroj světla
× celkový obraz (složení jednotlivých bodů)
vytvářen pomocí pohybu stolku s preparátem
× počítače nebyly dostatečně výkonné a dostupné –
obraz byl promítán skrze armádní radar (bez záznamu;
snímek zobrazen 10s, pak nový sken)
Memoár Marvina Minsky: http://web.media.mit.edu/~minsky/papers/ConfocalMemoir.html
7Historie a princip konfokálního mikroskopu
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Snímání vzorku – tvorba výsledného obrazu
Z uspořádání mikroskopu vyplývá, že v jednom kroku získáme informaci pouze
o jednom bodu (velmi omezené oblasti) – pro získání obrazu celé roviny je nutné
detekovat sérii signálů z dané roviny.
3 možnosti snímání vzorku
a) pohybuje se vzorek (Minsky)
b) pohybuje se objektiv (David Egger a Paul Davidovits; doi:10.1038/223831a0)
c) pohybuje se paprsek světla – (skenování, rastrování)
• multiple-beam scanning – na bázi Nipkowova disku
• single-beam scanning – laserový skenovací konfokální mikroskop
8Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova disku
Paul Nipkow (1860–1940)
 německý inženýr polského původu
 snímání a rozklad obrazu pomocí rotujícího disku
• po obvodu opatřen otvory umístěnými ve spirále
• vyžaduje 1 snímací fotočlánek
• 1884 patentoval
• 1925 byl Nipkowův disk použit pro první (mechanickou) třicetiřádkovou
televizi (5 snímků/s)
9Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
prof. Mojmír Petráň (28. března 1923) shlédnout dokument ČT
 profesor biofyziky; působil na Lékařské fakultě UK v Plzni
 modifikace Nipkowova disku pro optickou mikroskopii a zároveň zajišťující
konfokální efekt → Tandem-Scanning-Microscope
 v roce 1967 patentoval v USA se spolupracovníkem Milanem Hadravským
 1968 – výroba v rámci JZD Komorno u Plzně v jednotkách kusů
Konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova disku
Spinning Disk Confocal Microscopy
10Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
 redukce velikost disku i otvorů; zvýšení
počtu otvorů z desítek na tisíce
 na zorné pole prochází světlo asi
z 1000 otvorů
 při rotaci jsou pokryty prostory
původně neosvícené → vykrytí celého
zorného pole
 rychlost až 1000 (2000) snímků/s
11Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Laserový skenovací (rastrovací) konfokální mikroskop (LSCM)
 rozvoj od konce 70. let 20. století
 rastrování probíhá rozmítáním (posunem) paprsku pomocí natáčecích zrcadel
– umístěny mezi dichroické zrcadlo a objektiv
 snímání všech bodů roviny (princip jako pohyb po stínítku televize)
 rychlost maximálně 30 snímků/s
Laser Scanning Confocal Microscope
12Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Detekce signálu u LSCM
Fotonásobič (photo-multiplier tube, PMT)
 citlivý detektor světla (UV, VIS, near IR)
 zesiluje signál přinášený světelným paprskem
(fluorescence z preparátu)
Princip fotonásobiče
 konverze fotonu na elektron
(fotokatoda)
 znásobení elektronů (dynody)
 detekce signálu – proudu (anoda)
13Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Srovnání LSCM a konfokální mikroskopie na bázi rotujícího disku
LSCM Nipkowův disk
Nutnost snímat obraz bod po bodu →
delší doba rastrování = max. 30 snímků/s
V jednom okamžiku snímáno více bodů →
obraz rastrován 100–1000krát rychleji
Fotonásobič schopný detekovat pouze
15–45 % fluorescence = zvyšení rychlosti
skenování snižuje množství fotonů, které
dopadnou na fotonásobič a tím zvyšuje
šum ve výsledném obrazu → nutno využít
vyšší excitační energii laseru
Obraz rastrován otvory v disku paralelně – ve
stejném čase (v porovnání s LSCM) je
naskenováno více bodů obrazu (i opakovaně)
→ lze využít nižší intenzity osvětlení = nižší
vysvícení (photobleaching) preparátu, nižší
fototoxicita
Postupné snímání bodů → lepší axiální
rozlišení (v ose Z)
„Pinhole crosstalk“ – průchod odraženého
světla skrze sousední otvory v disku →
zvýšené pozadí pro tlusté vzorky a snížení
axiálního rozlišení
Snadno lze využít metody FRAP,
fotoaktivace a fotokonverze
Nutno zabudovat přídavný polohovatelný laser
pro lokální vysvícení/aktivaci fluoroforů
→ Výhodné pro kolokalizační studie → Výhodné pro life imaging, zejména
dynamických procesů
14Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Moderní konfokální mikroskopie
 zdroj světla – laser
 detektor: CCD kamera, fotonásobič
 obraz tvořen v PC
• zaznamená intenzitu signálu a
polohu bodu
• v rastru naskenována jedna rovina
praparátu, posun do jiné roviny
• software umožňuje skládání
obrazů (velké objekty v ose X-Y;
tlusté objekty v ose Z)
• 3D a 4D projekce
Konfokální mikroskop Nikon A1+
Konfokální mikroskop Olympus FluoView FV1200
15Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Standarní fluorescenční mikroskop
 vznik fluorescence i v oblastech
vzorku, který je mimo zaostření –
interferuje s fluorescencí v místě
zájmu
 platí pro preparáty tlustější jak
2µm
 celý vzorek ozářen – celé zorné
pole lze sledovat nebo
zaznamenat (kamera)
 rozlišení v ose Z: 2-3 µm
Srovnání konfokálního a standardního (widefield) mikroskopu
Konfokální fluorescenční mikroskop
 omezení signálu který je mimo
rovinu ostrosti → zvýšení rozlišení
 jeden nebo více světelných paprsků
„skenuje“ plochu zorného pole
 získání optického řezu = 1 obrázek
z dané roviny zaostření
 lze tedy zaostřit do jakékoliv roviny
buňky (objektu) bez fyzického řezání
 automatické získání obrazů z více
rovin - tvorba 3D obrazu
 optické rozlišení v ose Z: 0,5µm
16Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Srovnání konfokálního a standardního (widefield) mikroskopu
Standardní
fluorescenční
mikroskop
Konfokální
mikroskop
Standardní
fluorescenční
mikroskop
Konfokální
mikroskop
Výhody konfokální mikroskopie
 vymezená hloubka ostrosti – možnost
snímání optických řezů vzorkem
 eliminace signálu (jasu) z rovin mimo
zaostření
 lze snímat objemnější živé objekty
Online tutoriál 1
Myšímozkovátkáň
17Typy konfokálních mikroskopů
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Možnosti zobrazení
 1 optická rovina (řez)
18Možnosti zobrazení
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
apoptotické buňky linie P19,
modrá: DAPI; červená: phalloidin-TRITC
Možnosti zobrazení
Z-Serie a 3D zobrazení
 sekvence optických řezů z různých rovin kolmých na osu Z
 skládání řezů při postupném posouvání preparátu v ose Z
 krok a celkovou hloubku posunu lze navolit
 řezy lze softwarově sečíst nebo spojit v animaci
19Možnosti zobrazení
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Možnosti zobrazení
3D zobrazení
 optické řezy z různých rovin kolmých na osu Z
 tvorba 3D snímku
20Možnosti zobrazení
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
detekce nestinu v buňce glioblastomu svalová vlákna
Možnosti zobrazení
X-Z, Y-Z zobrazení
 s použitím optických řezů lze vidět preparát „z boku“
21Možnosti zobrazení
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Živé embryo
D. melanogaster po injekci
calcium green – změny
distribuce v čase
Možnosti zobrazení
časosběrné snímání a zobrazení živých buněk (objektů), 4D
 rozdíly mezi živým a fixovaným objektem
22Možnosti zobrazení
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Multifotonová fluorescenční mikroskopie
 Pozorování vzorků s velkou optickou hloubkou - řezy tkání (Pozorování nervových
sítí, mikrovaskulatury atp., in vivo studie,excitace jednotlivých organel)
 Metoda podobná konfokální mikroskopii (hardware, detektor)
 Infračervený pulsní laser - excitace fotony s nižší energií (větší vlnová délka světla) =
menší poškození vzorku
 Biologický materiál lépe absorbuje světlo o větší vlnové délce – fotony pronikají hlouběji
 dvoufotonová: využívá současné absorbce 2 fotonů k excitaci fluorochromu
 třífotonová: využívá současné absorbce 3 fotonů
Dvoufotonový (multifotonový) mikroskop 23
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Dvoufotonová fluorescenční mikroskopie
 energie dodaná fluorochromu současnou absorpcí dvou fotonů o dané vlnové délce
→ excitace 1 elektronu
 současně = v intervalu 10-18 s
 2 excitační fotony mají přibližně dvakrát větší vlnovou délku a poloviční energii
jako jednotlivý foton schopný vyvolat excitaci fluorochromu
24Dvoufotonový (multifotonový) mikroskop
Základním principem je excitace dvěma fotony o větší vlnové délce a nižší energii
 pravděpodobnost absorbce 2 fotonů
fluoroforem je velmi nízká → nutná vysoká
denzita fotonů (1.000.000x vyšší než
současně = v intervalu 10-18 s
• vyžaduje vysoce účinný pulsní IR laser
(např. titan-safírový) = drahé
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Emise fluorescence v ose Z v rámci preparátu
a) dvoufotonový mikroskop (v místě zaostření)
b) konfokální mikroskop (v celé hloubce preparátu)
Dvoufotonová fluorescenční mikroskopie
 excitace fluoroforu zejména v místě
zaostření paprsku laseru (je zde vyšší
pravděpodobnost absorbce 2 fotonů než v
místech, kde je paprsek více rozptýlený)
 excitace je lokalizována do velmi malého
bodu (1 femtolitr = 10-15l)
• To snižuje fototoxicitu
• nedochází tak k rychlému vysvícení v
celé hloubce preparátu
 omezení nezaostřeného obrazu = není
potřeba bodová clona
 snímání signálu pomocí fotonásobiče
 jeden snímaný bod = 1pixel (voxel)
a b
25Dvoufotonový (multifotonový) mikroskop
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Wide-field vs. Confocal vs. Two-photon (Multi-photon)
26Dvoufotonový (multifotonový) mikroskop
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Optické rozlišení (difrakční limit)
- taková vzdálenost dvou bodů objektu, kdy je ještě
rozlišíme jako samostatné, tzn. nesplynou v jeden bod.
Rozlišení mikroskopu ovlivňují:
 difrakce světla - ohyb světla na štěrbině nebo překážce
 numerická apertura
 kondenzor
 vady čoček
Difrakce světla
- jev odchýlení světla od přímočarého
směru šíření, které není způsobeno
odrazem, či lomem
- vzniká při průchodu světla optikou
mikroskopu
- ovlivňuje výsledný obraz (konvoluce)
- optické rozlišení (difrakční limit) závisí
na vlnové délce
27Rozlišení a dekonvoluce
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Rozptylová funkce (point spread function, PSF)
- popisuje tvar, do nějž se v mikroskopu vykreslí
bodový zdroj světla.
- při zobrazení v ploše ji popisuje Airyho funkce
- Sestává se z nejintenzivnějšího maxima prvního
řádu, okolo nějž jsou výrazně méně intenzivní
maxima vyšších řádů, tzv Airyho disky
- Obraz, který pozorujeme v mikroskopu, je konvolucí
(„kombinací“) signálu pozorovaného objektu a
rozptylové funkce, která je důsledkem difrakce světla
- .
28Rozlišení a dekonvoluce
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Konvoluce – praktické dopady
Vliv zaostření na velikost Airyho disku
Částice v rovině ostrosti Nezaostřené částice
Airyho disky limitují rozlišení jednotlivých bodů v mikroskopu
29Rozlišení a dekonvoluce
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Dekonvoluce
 počítačové zpracování obrazu
 SW na základě znalosti PSF odstraní signál vznikající difrakcí světla
 zvýšení kontrastu a rozlišení - odstranění neostrých částí obrazu
 2D dekonvoluce - lze využít pro tvorbu 3D obrazu z jednotlivě upravených nasnímaných
rovin
 3D dekonvoluce – každý pixel 3D obrazu (náročná na čas a výkon počítače)
 https://svi.nl/HuygensDeconvolution
Původní snímek Po dekonvoluci
30Rozlišení a dekonvoluce
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Superrozlišovací mikroskopie
 optická mikroskopie umožňující pozorovat objekty s rozlišením vyšším než
difrakční limit
2014 – Eric Betzig, Stefan Hell a William Moerner
Nobelova cena za chemii: "for the development of super-resolved
fluorescence microscopy"
31Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
4pi mikroskopie (1991 – vynalezl Stefan Hell)
 využívá druhého objektivu, který snímá opačnou stranu vzorku
 zaostřeny do stejného bodu → výsledný součet 2 signálů (vlnoploch) přináší až
7x lepší rozlišení v ose Z oproti běžnému konfokálnímu mikroskopu
Histon H2AX
(zelená barva)
Bewersdorf et al.,
Proc Natl Acad
Sci U S A, 2006
32Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Mikroskopie se strukturovaným osvětlením (SIM)
 Levná a jednoduchá metoda pro získání optických řezů
 Využívá standartní wide-field mikroskop
 osvětlení vzorku světlem s pruhovaným vzorem vzniklým difrakcí na mřížce
 5-7 snímků přes mřížku pro vytvoření obrazu
 Efekt vyvolaný osvětlením přes mřížku se používá k identifikaci fluoroforů, které
se nachází v rovině zaostření jednotlivých snímků – složení obrazu
Structured Illumination Microscopy
33Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Vyčerpání stimulovanou emisí (STED)
Stimulated Emission Depletion
 1994 – vynalezl Stefan Hell a Jan Winchmann
 spolu s excitačním světlem se oblast ozáří i světlem s delší vlnovou
délkou (tvar mezikruží; depletion donut, STED pattern)
 v oblasti STED dochází k vyzáření fluorescence o vlnové délce shodné s
depletion beam = odfiltrováno
 zůstává fluorescenční záření pouze v nezhášené oblasti uvnitř mezikruží
 Výkonný pulsní laser - drahé
34Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
STED
 laterální rozlišení (osy X-Y) obecně asi 20 nm, axiální (osa Z) 40-50 nm
35Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
STED
Histon H3 (zelená); mikrotubuly (červená) Proteinové komplexy jaderného póru
36Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Velké množství fluorochromů
(cílových molekul) a příliš blízko
→ nelze rozlišit jednotlivé molekuly
Single-Molecule Superresolution Imaging
 STORM – stochastic optical reconstruction microscopy
 PALM – photoactivated localization microscopy (vynalezl Eric Betzig)
 FPALM – fluorescence photoactivation localization microscopy
 využívají wide-field mikroskopii
 vychází z fluorescence jednotlivých (nepřekrývajících se) molekul
fluorochromů (single-molecule imaging)
37Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Single-Molecule Superresolution Imaging
1. Snímek fluorescence
jednotlivých molekul
(nepřekrývajících se)
fluochromů = snímek
obsahuje pouze omezený
počet signálů
2. Softwarově určen střed
(pozice) daných molekul
3. Další snímek zaznamená
jiné nepřekrývající se
fluorochromy
4. Softwarově určen střed
(pozice) těchto molekul
5. Výsledný obraz je tvořen
složením (překryvem)
tisíců takových snímků
38Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Single-Molecule Superresolution Imaging
 William Moerner: „photoswitchable“ značka - eYFP lze reaktivovat modrým
světlem (405 nm) → lze znovu excitovat světlem 488 nm
 značky (fluorescenční proteiny, fluorochromy) musí umožňovat změnu
spektrálních vlastností za pomoci světla o definované délce
(Chozinski et al., FEBS Lett, 2014)
 fotoaktivace (photoactivation)
 „fotopřepínání“ (photoswitching)
 fotokonverze (photoconversion)
 použití laseru s nízkou intenzitou
 jednotlivé molekuly fluorochromů
– nízká pravděpodobnost zásahu
a změny stavu (off→on)
39Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/superresolution/storm/index.html
Single-Molecule Superresolution Imaging
Systém dvojice fluorochromů: aktivátor + „photoswitchable“ reportér
40Superrozlišovací mikroskopie
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
STORM
 laterální rozlišení <10 nm, axiální rozlišení <20 nm
Historie a princip konfokálního mikroskopu 41
Mikrotubuly (zelená), klatrinem potažené jamky (červená; clathrin-coated pits)
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
 modifikace: do objektivu přidána cylindrická čočka – cílená změna PSF
 lze určit pozici v rovině Z a zobrazit v rámci snímku
3D-STORM
42Superrozlišovací mikroskopie
(Huang et al., Science, 2008)
Mikrotubuly – pozice v Z rovině odpovídá barvě
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
3D-STORM
Historie a princip konfokálního mikroskopu 43
Aktin – pozice v Z rovině
odpovídá barvě
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Porovnání rozlišení zobrazovacích technik
44Superrozlišovací mikroskopie
x / y z
• Wide-field fluorescenční MS: 230 1000 nm
• Konfokální a multiphoton MS : 180 500
• Superrezoluční MS: 4Pi 200 90
SIM: 100 250
STED, PALM, STORM: 20 50
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM)
 zdroj světla je umístěn kolmo k optické dráze
 osvětlení vzorku pomocí úzké roviny světla (light sheet)
 nedochází k excitaci fluoroforů mimo rovinu světla = vhodné pro optické řezy
 vzorek uzavřen v agaróze, hydrogelu ve skleněné kapiláře (nedochází k
deformacím objektu); posun objektu a otáčení → skládání 3D obrazu
 výhodná zobrazovací metoda pro 3D zobrazování velkých objektů
45Lightsheet fluorescence microscopy a TIRF
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Light Sheet Fluorescence Microscopy (LSFM)
46
Medaka japonská – acetylovaný tubulin (zelená) Hlava medaky – 20x zvětšeno
Lightsheet fluorescence microscopy a TIRF
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Total internal reflection fluorescence (TIRF)
 velmi vhodná metoda pro studium dějů na membráně
 výborné axiální rozlišení
 „evanescent wave“ proniká
v preparátu pouze do hloubky
cca 100nm
47Lightsheet fluorescence microscopy a TIRF
Bi8920 Fluorescenční mikroskopie – Konfokální mikroskopie a nové trendy ve fluorescenční mikroskopii
Total internal reflection fluorescence (TIRF)
48
F-aktin (zelená) v nádorové buněčné linii
Lightsheet fluorescence microscopy a TIRF