370 ‹Referáty ›
Plazma a živé organizmy
Zdenko Machala
Oddelenie fyziky životného prostredia, Katedra astronómie, fyziky Zeme a meteorológie,
Fakulta matematiky, fyziky a informatiky, Univerzita Komenského, Mlynská dolina, 84248 Bratislava
Článok sa venuje interakcii studenej plazmy so živými organizmami, predovšetkým jej aplikáciám na biodekontamináciu.
Popisuje výsledky bio-dekontaminácie v troch typoch jednosmerných elektrických výbojov
pri atmosférickom tlaku vo vzduchu a vode. Pomocou elektrickej a optickej diagnostiky, porovnávania
efektov výbojov a priameho i nepriameho pôsobenia plazmy na mikroorganizmy, bol identifikovaný vplyv
reaktívnych kyslíkových častíc ako dominantný mechanizmus bio-inaktivácie. Článok načrtá aj rôzne
biomedicínske aplikácie plazmy tvoriace základ novej vednej disciplíny – plazmovej medicíny.
PLAZMA
Úvod
Plazma sa považuje za štvrté skupenstvo hmoty. Ide
o čiastočne alebo úplne ionizovaný plyn, kde platí podmienka
kvázineutrality, tzn. že počet kladných a záporných
nábojov je približne vyrovnaný a plazma je navonok
elektricky neutrálna, a podmienka kolektívneho
správania, tzn. že kladné a záporné náboje sa navzájom
ovplyvňujú a tienia. Vzhľadom na hustotu častíc, ktorá
závisí od tlaku a teploty, tu záleží na vonkajších rozmeroch
plazmy, ktoré musia byť dostatočné na to, aby sa
náboje mohli navzájom tieniť. Toto kritérium sa nazýva
aj Debyeovo tienenie a vzdialenosť, na ktorú sa náboje
tienia, sa nazýva Debyeova dĺžka [1].
Hoci sa plazma vo vesmíre hojne vyskytuje, v článku
sa podrobnejšie venujem interakcii plazmy a živých
organizmov, pôjde o plazmu generovanú v laboratóriu,
zvyčajne pri atmosférickom tlaku (pa).
Generácia plazmy
Existujú dva prístupy ako ionizovať plyn, a tým vytvoriť
plazmu v laboratórnych podmienkach. Prvý spôsob
je termická ionizácia – čiže zohriatie plynu na vysokú
teplotu,abyprivzájomnýchzrážkachmolekúl(atómov)
plynu dochádzalo k ionizácii. K tomu dochádza až pri
teplotách niekoľkých 1000 K. Žiadny živý organizmus,
ani väčšina materiálov takú vysokú teplotu neznesie,
preto sa týmto prístupom nebudem zaoberať.
Druhý spôsob je ionizácia pomocou elektrického
poľa. Pri naložení vonkajšieho poľa sa nabité častice
začnú pohybovať zrýchleným pohybom. Elektróny
majú voči všetkým ostatným časticiam omnoho
menšiu hmotnosť (rádovo 104
-krát), preto omnoho
rýchlejšie reagujú na vonkajšie pole a rýchlo dosiahnu
vysoké kinetické energie, zatiaľ čo ostatné častice
sa len pomaly rozbiehajú. Rýchle elektróny sa často
zrážajú s inými časticami plynu, obzvlášť pri pa, kde
je vysoká zrážková frekvencia. Pri zrážkach ionizujú
neutrálne častice, a tým vznikajú ióny a ďalšie elektróny,
ktoré opäť získavajú kinetickú energiu od poľa
a ionizujú ďalšie častice. Tento rýchlo sa šíriaci proces
sa nazýva elektrónová lavína a je základom pre
vznik plazmy.
Okrem toho nepružné zrážky elektrónov s časticami
plynu vedú aj k vzbudeniu (excitácii) častíc, čím
vznikajú radiačné stavy vedúce k vyžarovaniu fotónov
a metastabilné stavy, ktoré slúžia ako rezervoáre
energie. Zrážkami s elektrónmi dochádza tiež k disociácii
molekúl, čím vznikajú chemicky nerovnovážne
fragmenty molekúl – radikály. Tieto ďalej reagujú navzájom
a s prítomnými iónmi, excitovanými časticami
a elektrónmi. V plazme tak vzniká ohromné množstvo
vzájomných interakcií, ich popisu a kinetike sa venuje
plazmochémia. Práve toto reaktívne prostredie je zodpovedné
za zaujímavé účinky plazmy a umožňuje jej
použitie napr. na čistenie plynných exhalátov a vody,
alebo pre biologickú dekontamináciu.
Elektrické výboje
Pri generácii plazmy vonkajším elektrickým poľom hovoríme
o elektrických výbojoch. Tieto môžu byť jednosmerné
(DC), striedavé (AC) alebo pulzné, podľa
aplikovaného napätia na elektródach. Podľa frekvencie
môžu AC výboje byť až v rádiofrekvenčnej (RF)
a mikrovlnnej (MW) oblasti – v týchto prípadoch už
nie je nutná priama prítomnosť elektród a plazma sa
generuje bezkontaktne, čo má výhody pri aplikáciách.
Podľa konfigurácie elektród môže byť elektrické pole
homogénne (rovinné elektródy) alebo nehomogénne
(napr. hrot-rovina či koaxiálne usporiadanie vytvárajú
nehomogénne pole typické pre korónový výboj). Výboje
s dielektrikami na povrchu elektród alebo medzi
nimi – tzv. dielektrické bariérové výboje (DBD), vyžadujú
striedavé alebo pulzné napájanie, využívajú opakované
nabíjanie povrchu dielektrík, a tým vznikajúce
zosilnenie elektrického poľa potrebné pre ionizáciu.
Pri atmosférickom tlaku sa významne uplatňuje tzv.
streamerovský mechanizmus vzniku výboja, ktorý je
základom koróny, iskry i DBD. Streamery, alebo ionizačné
vlny, sú rýchlo expandujúce elektrónové lavíny,
ktoré sa šíria do priestoru procesom fotoionizácie, až
vytvoria vodivostný kanál medzi elektródami. Všetky
spomínané výboje, okrem oblúka, generujú nerov-
č. 6 ‹Čs. čas. fyz. 59 (2009) › 371
novážnu (netermickú, studenú) plazmu, kde je teplota
(čiže kinetická energia) elektrónov oveľa vyššia ako teplota
plynu, Te>>Tg. Práve takáto studená plazma sa dá
najlepšie využiť pri pôsobení na organizmy.
Čo však majú živé organizmy spoločné s plazmou?
Je pravdepodobné, že život na Zemi vznikol v morskej
vode pri bleskovej činnosti, keď z anorganických zložiek
vznikala organická hmota, z ktorej neskôr vznikali
prvé bielkoviny – základné stavebné látky buniek.
Prvý slávny laboratórny experiment tohto druhu vykonal
Miller (1953), keď v iskrovom výboji syntetizoval
organické látky v anorganickej atmosfére [2]. Podobnú
syntézu organických látok z anorganickej plynnej zmesi
N2-CO2-H2 sme previedli aj u nás [3].
PLAZMA A MIKROORGANIZMY –
BIO-DEKONTAMINÁCIA
V tomto článku však chcem poukázať hlavne na to, že
interakcia studenej plazmy s organizmami môže byť
užitočná. Predovšetkým sa venujem nebezpečným mikroorganizmom.
Ide o vírusy, baktérie a ich rezistentné
formy života – spóry, sinice, plesne a spoločenstvá mikroorganizmov
vytvárajúce biofilmy, ktoré spôsobujú
kontamináciu vody a vzduchu, potravín, medicínskych
nástrojov a prístrojov, spôsobujú rôzne nákazy a choroby,
často epidémie, ale aj napr. zubný kaz. Niektoré
z nich môžu byť potenciálnym nástrojom bioterorizmu,
napr. Anthrax. Preto je všeobecným záujmom ich
ničiť – sterilizovať, resp. dezinfikovať. Sterilizácia znamená
úplné zničenie mikroorganizmov, v praxi aspoň
šesť rádový pokles ich populácie [4]. Toto prísne kritérium
berie do úvahy, že mikroorganizmy majú vysokú
reprodukčnú schopnosť, za vhodných podmienok sú
niektoré baktérie schopné zdvojnásobiť populáciu už
za 20 minút. Dezinfekcia označuje čiastočné zníženie
ich populácie. Oba tieto termíny budem ďalej nazývať
všeobecne bio-dekontaminácia.
Klasické metódy sterilizácie sa zakladajú na suchom
alebo vlhkom teple, napr. medicínske nástroje sa bežne
sterilizujú autoklávom, kde sa mikróby ničia pri teplote
cca 120°C a tlaku p = 1,2 atm po dobu 20-30 min. Niektoré
citlivé medicínske prístroje a pomôcky však pri
tomto spôsobe podliehajú degradácii materiálu, napr.
plastové katétre, endoskopy a iné, čím sa znemožňuje
ich viacnásobné použitie. Problém predstavuje aj dezinfekcia
prístrojov a medicínskeho prostredia, napr. interiéru
nemocníc, operačných sál a pod. Takisto nie je
možné teplom sterilizovať potraviny bez toho, aby nestratili
svoju nutričnú hodnotu. Iné spôsoby sterilizácie
a dezinfekcie sú chemické (napr. použitie konzervačných
látok pre uchovanie potravín, dezinfekcia pitnej
vody chlórom či ozónom), alebo radiačné (dezinfekcia
ultrafialovým žiarením). Preto má zmysel hľadať nové
alternatívne spôsoby bio-dekontaminácie nespôsobujúce
degradáciu materiálov a nežiaduce vedľajšie účinky
chemikálií. Plazma a elektrické výboje tu predstavujú
veľký aplikačný potenciál.
Bio-dekontaminácia sa v elektrických výbojoch
dosahuje vďaka generovaniu plazmy vhodných vlastností
na iniciovanie rôznych plazmochemických, najmä
oxidačných procesov. Studenú plazmu generovanú
elektrickými výbojmi pri pa dnes využívajú aj
mnohé environmentálne a priemyselné aplikácie [5,
6]. Vďaka nerovnovážnym podmienkam prebiehajú
v plazme procesy ionizácie, excitácie, disociácie a následné
plazmochemické reakcie pri pomerne nízkej
teplote plynu. Tak vznikajú voľné elektróny a ióny,
ktoré získavajú energiu z elektrického poľa, excitované
častice, ktoré sú zdrojom žiarenia plazmy (napr.
UV), alebo uskladňujú energiu, a napokon radikály
(napr. OH, HO2, O, H, N, NO). V porovnaní s konvenčnými
metódami sterilizácie teplom, či s UV ožarovaním
alebo ozonizáciou, dosahuje plazma elektrických
výbojov často vysoké účinnosti v krátkych
časoch opracovania. Je to vďaka synergii efektov tepla,
UV žiarenia, reaktívnych neutrálnych i nabitých
častíc a elektrického poľa.
Z technologického i finančného hľadiska je výhodné
pri aplikáciách pracovať pri pa, keďže nie sú nutné
vákuové zariadenia. Výskumu bio-dekontaminácie
pomocou elektrických výbojov pri pa sa v poslednom
desaťročí venuje mnoho renomovaných inštitúcií po
celom svete a boli testované rôzne druhy elektrických
výbojov: korónové [7], DBD [8, 9], pulzné [10, 11], rádiofrekvenčné
a mikrovlnné [12-14], a rôzne plazmové
trysky a afterglow (zhasínajúca plazma výbojov) [12-
15]. Autori kvôli homogenite a ľahšiemu zapáleniu výbojov
zvyčajne generujú plazmu v inertných plynoch
(He, Ar) bez/s prímesou O2. Z praktického hľadiska má
väčší význam generovať výboje priamo vo vzduchu, je
to však náročnejšie na prevenciu prierazu a homogenitu
plazmy. Nedá sa všeobecne povedať, ktorý druh
výboja je najlepší, výber vhodnej plazmy, pracovného
plynu a konfigurácie závisí silne od:
a) druhu mikroorganizmu (Gram-pozitívne a Gramnegatívne
baktérie sa líšia hrúbkou a štruktúrou
bunkovej membrány, Gram-pozitívne tvoria v nepriaznivých
podmienkach vysoko rezistentné formy
– spóry. Takisto je ťažké dekontaminovať biofilmy
– mnohovrstvové kolónie mikroorganizmov. Vyššie
eukaryotické bunky (napr. plesne) sú tiež rezistentné
voči dekontaminačným účinkom).
b) prostredia, v ktorom sa nachádza (napr. vo vode,
vzduchu, či povrchu rôznych materiálov). Pri sterilizácii
a dezinfekcii vody je nutné ju čo najúčinnejšie
vystaviť účinkom plazmy, čo je možné napr. generovaním
pulzných výbojov priamo vo vode alebo na
rozhraní voda-plyn [11].
Obr. 1 Schéma základnej experimentálnej aparatúry na testovanie biologických účinkov DC
výbojov a ich elektrickej a optickej diagnostiky.
372 ‹Referáty ›
BIO-DEKONTAMINÁCIA PLAZMOU
NA FMFI UK
V Bratislave sa pôsobením plazmy na živé organizmy
zaoberali už od r. 1979 pri opracovaní semien jačmeňa
korónovým výbojom za účelom zvýšenia ich
klíčivosti [16]. V posledných rokoch sa na oddelení
Fyziky životného prostredia FMFI UK intenzívne venujeme
výskumu bio-dekontaminácie vody a povrchov
pomocou DC elektrických výbojov pri pa. Testujeme
a porovnávame pôsobenie koróny, prechodovej
iskry a tlecieho výboja v kladnej i zápornej polarite
na rôzne mikroorganizmy vo vode a na povrchoch.
Tieto výboje boli predtým úspešne aplikované na čistenie
plynov od prchavých organických látok, rozklad
CO2 a i. [17-19].
Aparatúra
Schéma základnej experimentálnej aparatúry na testovanie
biologických účinkov DC výbojov je znázornená
na obr. 1. Výboje generujeme zvyčajne v konfigurácii
hrot-rovina, pričom rovinná elektróda je ponorená do
dekontaminovaného média (voda, fyziologický roztok,
živný agar). Pri dekontaminácii papiera a plastov sú
povrchy položené priamo na rovinnú elektródu. Aparatúra
umožňuje komplexnú elektrickú a optickú diagnostiku
výbojov pomocou osciloskopických meraní
napätí a prúdov a emisnej spektroskopie. Pre praktickú
aplikovateľnosť metódy na dezinfekciu pretekajúcej
vody sme vyvinuli trubicovú výbojku s piatimi paralelnými
výbojmi. Ďalšia aparatúra umožňuje pretekanie
kontaminovanej vody cez dutú ihlovú vysokonapäťovú
elektródu do aktívnej zóny výboja pri stanovenom
prietoku vody.
Výboje
Streamerová koróna (streamer corona, SC) je typická
krátkymi malými prúdovými pulzami (~ 100 ns, ~ 10
mA) a vysokou frekvenciou (~ 30 kHz), pri ktorých
ostáva napätie takmer konštantné. Energia uvoľnená
v pulze je veľmi malá (~ 0,1-1 μJ). Fotografia a typický
osciloskopický záznam SC sú zobrazené na obr. 2.
Na bio-dekontamináciu plastových a papierových
povrchov od spór sme využívali zápornú korónu v režime
Trichelových pulzov. Nad plastovou fóliou sa prejavovali
typické Trichelove pulzy [21] s frekvenciami
0,5-5 MHz a amplitúdami do 0,26 mA. Frekvencia
pulzov rástla s aplikovaným napätím až do hodnoty,
kedy pulzný mód prešiel do bezpulzného “glow“ módu
s konštantným malým prúdom.
V prípade dekontaminácie papiera položeného na
uzemnenú elektródu, výboj čiastočne prenikal do poréznej
štruktúry papiera, v ktorej sa tvorili mikrovýboje.
Podobný jav nastáva u spätnej koróny [22], ktorá
vzniká na poréznej vrstve s veľkým odporom pokrývajúcej
nízkonapäťovú elektródu. Tomu zodpovedajúce
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
U[kV]
-100 0 100 200 300
t [ns]
12
10
8
6
4
2
0
I[mA]
Obr. 2 Fotografia (a) a typický priebeh napätia a prúdu
(b) streamerovej koróny (SC, 26 kHz, Imax = 25 mA,
d = 6 mm) nad vodou.
a
b
Obr. 3 Fotografie zápornej koróny nad plastovým
(a) – Trichelove pulzy, f = 2,7 MHz, a papierovým
povrchom, (b) – spätná koróna, f = 1,3 kHz, d = 4-5 mm.
a
b
č. 6 ‹Čs. čas. fyz. 59 (2009) › 373
» Emisná
spektroskopia
v UV a viditeľnej
oblasti je
účinnou
technikou
neinvazívnej
diagnostiky
plazmy. «
výbojové pulzy boli vyššie ako Trichelove (do 16 mA),
ale s nižšou frekvenciou (~ 1-2 kHz). Obr. 3 zobrazuje
fotografie zápornej koróny nad plastovým a papierovým
povrchom.
Prechodová iskra (transient spark, TS) je napriek DC
napájaniu pulzný výboj s veľmi krátkymi silnými impulzmi
prúdu (~ 100 ns, ~ 1 A) a regulovateľnou frekvenciou
(~ 1-10 kHz). Jej fotografia a typický osciloskopický
záznam sú zobrazené na obr. 4. Je iniciovaná
streamerom, ktorý v dôsledku lokálneho ohrevu plynu,
a tým zvýšením redukovaného elektrického poľa, prerastie
do iskry. Pomocou vhodnej konštrukcie výbojky
a elektrického obvodu je možné kontrolovať energiu
pulzu a udržiavať ju na veľmi malých hodnotách
(~ 10-100 μJ), aby impulz trval veľmi krátko a energia
sa nemíňala na neefektívny ohrev plynu. Naopak, väčšina
energie sa použije na urýchlenie elektrónov, ktoré
iniciujú všetky ostatné plazmochemické procesy, a tým
zabezpečujú vysokú účinnosť procesu.
Vysokotlaký tlecí výboj (high pressure glow dischrage,
GD) je veľmi jednoducho udržateľný bezpulzný režim
výboja fungujúci pri malých prúdoch (~ mA) a bez
prítomnosti dielektrických vrstiev medzi elektródami.
Hoci sa časť jeho energie stráca na ohrev plynu a dosahuje
vyššie teploty v kanáli, dá sa ním generovať netermická
plazma väčších objemov s vysokou hustotou
elektrónov, čo je zaujímavé pre mnohé technické aplikácie.
Jeho fotografia a volt-ampérová charakteristika
sú znázornené na obr. 5. Skúmané DC výboje sú podrobne
popísané v prácach [17, 22, 23].
Emisná spektroskopia DC výbojov
Emisná spektroskopia v UV a viditeľnej oblasti je účinnou
technikou neinvazívnej diagnostiky plazmy [24].
Využíva jav excitácie atómu alebo molekuly a následnej
deexcitácie s vyžiarením (emisiou) fotónov, ktoré detegujeme.
Typické namerané spektrá výbojov sú zobrazené
na obr. 6. Ich analýzou sme u všetkých výbojov
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
U[kV]
-100 0 100 200 300
t [ns]
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
I[A]
Obr. 4 Fotografia (a) a typický priebeh napätia a prúdu
(b) prechodovej iskry (TS, 1 kHz, Imax = 2 A, d = 6 mm)
nad vodou.
a
b
3
2,5
2
1,5
1
U[kV]
1 10
I [mA]
Obr. 5 Fotografia (a) a volt-ampérová charakteristika
(b) tlecieho výboja (GD, I = 6 mA, d = 6 mm) nad vodou.
a
b
374 ‹Referáty ›
» Kombinácia
plazmového
opracovania
vody s filtráciou
alebo
sedimentáciou
môže viesť
k úplnej
sterilizácii. «
zistili vyžarovanie N2 (2. a 1. pozitívny systém) a OH,
čo poukazuje na prítomnosť OH radikálov vznikajúcich
disociáciou molekúl vody. V GD je OH najsilnejšie
kvôli silnému vyparovaniu vody a pozorujeme aj NO
γ systém. NO vzniká reakciou radikálov N+O vznikajúcich
disociáciou N2 a O2 v dôsledku zvýšenej teploty
plynu. V TS vyžaruje aj N2
+
, čo svedčí o vysokej energii
elektrónov, pretože na excitáciu N2
+
do stavu B3
Πu
+
je
potrebných 19 eV. Vysokoenergetické elektróny sa prejavujú
u TS aj vo viditeľnom spektre ako čiary atómových
radikálov O, N a H.
Simulovaním emisných spektier a následným porovnaním
s nameranými spektrami je možné určovať
teploty plazmy: rotačnú Tr a vibračnú Tv teplotu. Vo
výbojoch pri pa platí, že teplota plynu sa vyrovnáva
s Tr v dôsledku vysokej zrážkovej frekvencie. Porovnaním
Tr a Tv možno zistiť, či je plazma v termodynamickej
rovnováhe (vtedy Tr = Tv). Na simuláciu emisných
spektier používame program SPECAIR [25]. Všetky
tri vyšetrované DC výboje generujú nerovnovážnu
plazmu s Tr = 300-350 K (SC), 450-650 K (TS) a 1800-
2000 K (GD).
Pomocou nameraných a simulovaných spektier je
možné zmerať aj koncentráciu OH radikálov, ktoré
sú dôležité oxidanty pri procese bio-dekontaminácie.
Emisno-spektroskopická analýza skúmaných DC výbojov
a meranie koncentrácie OH sú podrobne popísané
v [26].
Bio-dekontaminačné účinky DC výbojov
Biologické účinky atmosférických DC výbojov sme testovali
vo vodnom roztoku Gram-negatívnych (Salmonella
typhimurium) a Gram-pozitívnych (Bacillus cereus)
baktérií a kvasiniek (Saccharomyces cerevisiae),
a na plastových a papierových povrchoch kontaminovaných
spórami (Bacillus cereus). Tieto mikroorganizmy
sú dôležité z hľadiska dekontaminácie pitnej vody
a potravín, sterilizácie medicínskych nástrojov, aj opatrení
proti bioterorizmu.
Kultiváciu mikroorganizmov a vyhodnotenie plazmovej
dekontaminácie robíme vo vlastnom mikrobiologickom
laboratóriu v sterilnom digestore so zabudovanou
UV germicídnou lampou a manipuláciou nad
plameňom plynového kahana, štandardnou mikrobiologickou
kultivačnou metódou. Jej podstata spočíva
v tom, že každá živá baktéria sa v priaznivom prostredí
(na živnom agare a pri optimálnej teplote, zvyčajne
37 °C) rýchlo rozmnožuje a za niekoľko hodín vytvorí
kolóniu. Jednotlivé baktérie, ktoré sa stanú kolóniotvornými
jednotkami, sú po kultivácii viditeľné okom
na Petriho miske s agarom a spočítateľné (obr. 7).
Pri prvých experimentoch sme porovnávali účinnosť
troch DC výbojov (SC, TS a GD) v oboch polaritách
pri rôznych časoch ich pôsobenia (15, 30 a 60 s) na
vzorku 5ml kontaminovanej vody pri rôznych počiatočných
koncentráciách baktérií. Ukázalo sa, že najvyššiu
účinnosť má TS v kladnej polarite. SC má najnižšiu
objemovú hustotu energie, ale aj najnižšiu účinnosť.
GD je účinný, no energeticky náročný, čo súvisí s vysokou
teplotou v kanáli výboja.
Pri klasickej sterilizácii sa jej účinnosť popisuje tzv.
D-hodnotou (decimálnou hodnotou). Je to čas, za ktorý
klesne mikrobiálna populácia o 1 rád. V neoptimalizovanom
statickom režime sme dosiahli D-hodnoty
1,8-30 min, porovnateľné s klasickými metódami ste-
rilizácie.
Pri bio-dekontaminácii kladnou TS v prietočnom
režime vody v trubicovej výbojke pri rôznych prietokoch
sme dosiahli omnoho vyššie účinnosti dekontaminácie
oproti statickému režimu, zodpovedajúce 2-4
rádovému poklesu mikrobiálnej populácie. Takisto Dhodnoty
boli o 1-2 rády nižšie (3-8 s), čiže metóda je
vysoko účinná. Pre praktické aplikácie na dezinfekciu
vody má význam sledovať dlhodobé časové závislosti
populácie baktérií po plazmovom opracovaní, ako
sú zobrazené na obr. 8 spolu s časovým vývojom populácie
v kontrolnej vzorke. Populácia po cca 18 min
opracovania v TS ďalej klesala. To indikuje, že okrem
priamych účinkov plazmy vznikajú vo vode dlhšie žijúce
aktívne častice, napr. ozón, zodpovedné za ďalšiu
inaktiváciu baktérií. Navyše zostávajúce baktérie po
plazmovom opracovaní vo vode koagulovali a vytvorili
sediment a populácia vo vyčírenej časti klesla na
nulu v čase 40 h. Tento výsledok ukazuje, že kombinácia
plazmového opracovania vody s filtráciou alebo
sedimentáciou môže viesť k úplnej sterilizácii.
Obr. 6 Typické emisné spektrá DC výbojov v UV (a) a VIS-NIR
(b) oblasti.
intenzita
λ [nm]
intenzita
λ [nm]
Obr. 7 Kultivácia baktérií S. typhimurium na Petriho miskách. Kolóniotvorné jednotky
(colony-forming units, CFU) v referenčnej (a) a plazmou opracovanej vzorke (b).
a b
b
a
č. 6 ‹Čs. čas. fyz. 59 (2009) › 375
Pre ešte účinnejšiu interakciu výbojovej plazmy
s mikroorganizmami sme vyvinuli konfiguráciu, kde
voda pretekala cez vysokonapäťovú dutú ihlu priamo
do aktívnej zóny výboja. Na hrote ihly tvoriace sa
kvapky so zvyšovaním napätia zmenšovali svoj objem,
až nastával jav elektrostatického rozprašovania vody
(elektro-hydro-dynamickej atomizácie), obr. 9 [27].
Tento jav je spôsobený narúšaním elektrostatických síl
medzi molekulami vody a následným poklesom povrchového
napätia vody v dôsledku zvyšovania intenzity
elektrického poľa. Jednotlivé kvapky sa nabíjajú, a teda
sú medzi elektródami urýchľované a vzájomne sa odpudzujú.
V tejto konfigurácii sme dosiahli pomerne
vysoké účinnosti bio-dekontaminácie s veľmi krátkymi
D-hodnotami (od 0,1 s), a to aj v koróne, ktorá bola
v statickom režime neúčinná. Navyše sme tu dosiahli
najnižšie energetické náklady procesu (0,7-20 J/ml na
jeden rád poklesu populácie).
Bio-dekontaminácia spór B. cereus na plastových
a papierových povrchoch v zápornej koróne viedla
k povzbudivým výsledkom napriek tomu, že spóry sú
veľmi ťažko inaktivovateľné.
Identifikácia dominantných mechanizmov
bio-dekontaminácie
Okrem dosiahnutia maximálnych účinností bio-dekontaminácie
a optimalizácie procesu pre aplikácie je
ťažiskom nášho výskumu tiež vniknúť do podstaty elementárnych
mechanizmov interakcie plazmy so živou
bunkou a zistiť, ktoré inaktivačné činitele plazmy (UV
žiarenie, teplo, elektrické pole, nabité častice, radikály
a i.) sú pri bio-dekontaminácii dominantné. K tomu
používame komplexnú elektrickú a optickú diagnostiku
výbojov, porovnávame účinky výbojov pri rôznych
parametroch na mikroorganizmy a dávame ich
do súvislosti s ich elektrickými a spektrálnymi cha-
rakteristikami.
Podľa súčasných zdrojov literatúry sa názory na mechanizmy
inaktivácie mikroorganizmov v plazme líšia.
Väčšina autorov sa zhoduje na tom, že pri výbojoch
pri atmosférickom tlaku dominantnú úlohu hrajú radikály
a iné aktívne častice, predovšetkým reaktívne
kyslíkové častice, čiže najmä O, OH, O3, ktoré pôsobia
deštruktívne na bunkové membrány [9, 12-15]. Efekty
teploty a UV žiarenia sú známe biocídne faktory,
ale v studenej plazme pri pa sú málo významné. UV
efekt sa prejavuje len vtedy, keď plazma vyžaruje v UV
germicídnej oblasti (220-280 nm). V našich DC výbojoch
bolo toto žiarenie generované NO γ systémom len
v GD. Názory expertov sa však líšia pri efekte nabitých
častíc a elektrického poľa, ktoré môžu narúšať integritu
bunkovej membrány, resp. obmedziť látkovú výmenu
cez membrány, ktorá funguje na elektrostatickom
princípe [8].
Svetlo do identifikácie mechanizmov bio-inaktivácie
vnášajú aj naše experimenty zamerané na porovnávanie
priameho a nepriameho pôsobenia plazmy
na mikroorganizmy, s postupným odfiltrovaním
elektrického poľa, nabitých častíc, ostatných reaktívnych
častíc a UV žiarenia. Výsledky týchto experimentov,
dokumentované na obr. 10, ukazujú minimálnu
úlohu žiarenia generovaného plazmou. Navyše, efekt
priamej expozície plazmy a nepriameho pôsobenia len
neutrálnych aktívnych častíc bol takmer totožný, čo
poukazuje na dominantnú rolu týchto aktívnych častíc.
V spolupráci s Odd. biomedicínskej fyziky FMFI
UK sme vyvinuli merania plazmou vyvolaného oxidačného
stresu membrán buniek (metóda TBARS
[28]), ktoré potvrdili dominantnú rolu reaktívnych
kyslíkových častíc.
BIOMEDICÍNSKE APLIKÁCIE PLAZMY
V medicíne má veľký význam sterilizovať vnútorné
plochy tenkých plastových trubíc (katétre, endoskopy),
ktoré nie je možné autoklávovať. Na to sa dajú vhodne
použiť RF a MW výboje alebo afterglow iných výbojov.
Tu sa zvyčajne pracuje pri nízkom tlaku, pretože
plazma viac expanduje do objemu a dostane sa aj do
vnútorných častí sterilizovaných nástrojov. Nízkotlaké
sterilizátory pracujúce s RF plazmou sú už aj komerčne
dostupné [29]. Na druhej strane, výhodou pa je, že nie
sú nutné vákuové zariadenia, čo znižuje cenu, zvyšuje
flexibilitu a uľahčuje prevádzku. Pri aplikáciách na živých
bunkách či tkanivách in vivo (v živom organizme)
sú nízke tlaky neprípustné.
Obr. 8 Krivka prežitia baktérií S. typhimurium v 0,1 l vody opracovanej v trubicovej výbojke
5 TS výbojmi počas 18 min, vývoj populácie v dlhej časovej škále v semilogaritmickej
mierke. Vo vyčírenej vode po spontánnej koagulácii baktérií došlo k úplnej sterilizácii.CFU/ml
čas [h]
Obr. 9
Fotografie elektrostatického
rozprašovania vody (d = 8 mm,
prietok 0,5 ml/min).
(a) tvorba kvapiek, U = 0;
(b) rozprašovanie, U = 5,5 kV;
(c) rozprašovanie s SC výbojom,
U = 6,5 kV; (d) prechod SC-TS,
U = 7,8 kV; (e) TS, U = 9 kV.
a b
c d
e
376 ‹Referáty ›
Biocídne účinky plazmy sa dajú uplatniť aj priamo
na ľuďoch či zvieratách, napr. pri terapii kožných ochorení.
Plazmová sterilizácia mikroorganizmov v otvorených
ranách či vredoch významne urýchľuje ich hojenie.
Okrem účinku sterilizácie rany, studená plazma
tiež urýchľuje procesy koagulácie krvi, a tým napomáha
rýchlemu hojeniu [30, 31]. Plazmová ihla bola úspešne
testovaná pre aplikácie v zubnom lekárstve, jej aplikácia
môže v budúcnosti nahradiť bolestivé vŕtanie pri
odstraňovaní zubného kazu [32]. Pri in vivo aplikáciách
na ľudských tkanivách samozrejme nie je možné aplikovať
priamo vysoké napätie na elektródach, je nutné
použiť dielektrické či vysokofrekvenčné bezelektródové
výboje alebo afterglow.
Ďalšie zaujímavé aplikácie plazmy v medicíne sú
rôzne bunkové manipulácie v tkanivách, napr. bunkový
odtrh od povrchov, či naopak umožnenie adhézie
buniek na povrchy implantátov a protéz, alebo riadená
bunková smrť – tzv. apoptóza, ktorá má obrovský potenciál
pri terapii rakovinových nádorov. Všetky tieto
aplikácie zahròuje plazmová medicína – nová, no veľmi
rýchlo sa rozvíjajúca vedecká disciplína [30-32].
ZÁVER
Studená plazma generovaná rôznymi elektrickými výbojmi
vo všeobecnosti interaguje s bunkami mikroorganizmov
a pôsobí na ne viacerými faktormi, čo vedie
k ich inaktivácii a smrti. Tento jav sa úspešne využíva
pri plazmovej bio-dekontaminácii vody, povrchov a nástrojov,
čo potvrdili aj naše experimenty porovnávajúce
tri DC výboje vo vzduchu pri pa. Syntéza našich výsledkov
štúdia fyzikálnych vlastností týchto výbojov a ich
emisných spektier s výsledkami testov ich biologických
účinkov v rôznych konfiguráciách a porovnaním priamej
a nepriamej expozície v plazme, doplnená o merania
oxidačného stresu buniek, nám umožnila čiastočne
vniknúťdoproblematikymechanizmovbio-inaktivácie.
Na základe týchto experimentálnych zistení konštatujeme,
že v plazme generovanej DC výbojmi vo vzduchu za
i bez prítomnosti vody, sú dominantným inaktivačným
faktorom mikroorganizmov radikály a aktívne častice,
predovšetkým reaktívne kyslíkové častice.
Okrem plazmovej bio-dekontaminácie a sterilizácie,
nachádza studená plazma nové možnosti využitia
v medicíne pri terapii kožných, zubných i rakovinových
ochorení. Plazmová medicína má obrovský potenciál
stať sa medicínou budúcnosti.
Poďakovanie
Výskum podporený agentúrou VEGA, grant 1/0293/08.
Na experimentoch i plodných diskusiách sa významne
podieľali moji kolegovia M. Janda, K. Hensel, V. Martišovitš,
I. Jedlovský, L. Chládeková, B. Pongrác, M. Pelach,
L. Šikurová (FMFI UK) a P. Polčic (PriF UK).
Literatúra
[1] V. Martišovitš: Základy fyziky plazmy, UK Bratislava 2006.
[2] S. L. Miller: Science 117, 528 (1953).
[3] M. Janda, M. Morvová, Z. Machala, I. Morva: Orig. Life
Evol. Biosph. 38, 23 (2008).
[4] T. von Woedtke et al.: Plasma Process. Polym. 5, 534
(2008).
[5] R. Hippler et al.: Low temperature plasma physics, WileyVCH,
Weinheim 2001.
[6] K. H. Becker et al.: Non-Equilibrium Air Plasmas at Atmospheric
Pressure, IoP Publishing, Bristol 2005.
[7] R. S. Sigmond, B. Kurdelová, M. Kurdel: Czech. J. Phys. 49,
405 (1999).
[8] G. Fridman et al.: Plasma Process. Polym. 4, 370 (2007).
[9] M. Laroussi, F. Leipold: Int. J. Mass Spectrom. 233,
81(2004).
[10] H. Ayan et al.: J. Phys. D: Appl. Phys. 42, 125202 (2009).
[11] P. Lukeš et al.: Plasma Sources Sci. Technol. 17, 024012
(2008).
[12] E. Stoffels et al.: Plasma Sources Sci. Technol. 11, 383
(2002).
[13] R. Brandenburg et al.: Contrib. Plasma Phys. 47, 72
(2007).
[14] T. C. Montie, K. Kelly-Wintenberg, J. R. Roth: IEEE Trans.
Plasma Sci. 28, 41 (2000).
[15] X. Lu et al.: J. Appl. Phys. 104, 053309 (2008).
[16] P. Lukáč, V. Sekerka: Acta Phys. Univ. Comen. XXIV, 57
(1984).
[17] Z. Machala, M. Morvová, E. Marode, I. Morva: J. Phys. D:
Appl. Phys. 33, 3198 (2000).
[18] Z. Machala, E. Marode, M. Morvová, P. Lukáč: Plasma
Process. Polym. 2, 152 (2005).
[19] M. Morvová, F. Hanic, I. Morva: J. Therm. Anal. Calorimetry
61, 273 (2000).
[20] R. S. Sigmond, M. Goldman: in Corona discharge physics
and applications, Electrical Breakdown and Discharges in
Gases, NATO ASI Series B: Physics, ed. E. E. Kunhardt a L.
H. Luessen, Plenum, New York, 1983.
[21] A. Jaworek, A. Krupa, T. Czech: J. Phys. D: Appl. Phys. 29,
2439 (1996).
[22] Z. Machala, I. Jedlovský, V. Martišovitš: IEEE Trans. Plasma
Sci. 36, 918 (2008).
[23] Z. Machala, E. Marode, C.O. Laux, C.H. Kruger: J. Advanced
Oxid. Technol. 7, 133 (2004).
[24] C. O. Laux, T. G. Spence, C. H. Kruger, R. N. Zare: Plasma
Sources Sci. Technol. 12, 125 (2003).
[25] C. O. Laux: http://www.specair-radiation.net.
[26] Z. Machala et al.: J. Mol. Spectrosc. 243, 194 (2007).
[27] G. Taylor: Proc. R. Soc. Lon. A 280, 383 (1964).
[28] Z. Machala et al.: Eur. J. Phys. D 54, 195 (2009).
[29] Sterrad, http://sterrad.com.
[30] G. Fridman et al.: Plasma Process. Polym. 5, 503 (2008).
[31] A. Kramer et al.: GMS Krankenhaushyg. Interdiszip. 3, 1
(2008).
[32] E. Stoffels et al.: Plasma Sources Sci. Technol. 15, S169
(2006).
Obr. 10 Porovnanie efektov priameho a nepriameho pôsobenia plazmy na baktérie S.
typhimurium na agare. (a) kontrolná vzorka, (b) priame pôsobenie výbojov SC a TS
– tmavé miesta indikujú dekontaminovanú oblasť, (c) pôsobenie len neutrálnych
aktívnych častíc – nabité častice a elektrické pole odfiltrované uzemnenou mriežkou,
(d) pôsobenie len UV žiarenia z výbojov cez kremenné sklo.
a) kontrola
b) výboj priamo c) len neutrálne častice d) len UV žiarenie
mriežka
kremenné
sklo
VN VN VN
SC
TC