Molekulová luminiscenční spektroskopie • absorbovaná energie (např. ve formě světelného záření může být přeměněna na světelnou energii o jiné (většinou vyšší) vlnové délce → luminiscence • skupina v molekule zodpovědná za luminiscenci (fluorescenci) se nazývá luminofor (fluorofor). • molekulová luminiscenční spektroskopie je významná analytická metoda. Rozdělení luminiscence podle zdroje excitace • fotoluminiscencefotoluminiscence - absorpce energie ve formě světla •• chemiluminiscencechemiluminiscence a bioluminiscencebioluminiscence - zdrojem energie je chemická, nebo biochemická reakce •• elektroluminiscenceelektroluminiscence –zdrojem je el. proud •• radioluminiscenceradioluminiscence – zdrojem je radioaktivní záření •• triboluminiscencetriboluminiscence – zdrojem je mechanická energie •• krystaloluminiscencekrystaloluminiscence – krystalizace je doprovázena luminiscencí • další zdroje (sonoluminiscence, thermoluminiscence, atd.) excitační zdroj (Xe lampa), λ = 532 nm detektor emise (fotonásobič) Rozdělení spektrometrických metod • podstatou většiny spektrometrických metod je sledování interakce elektromagnetického záření s analytem za účelem studia kvality (struktury), nebo kvantity • atomy a molekuly mohou přijímat, nebo odevzdávat energii do okolí ∆E = Epřijatá – E odevzdaná = h . ν • tato energie je kvantována • absorpce energie: energie je absorbována valenčními elektrony atomů (AAS), vnitřními elektrony (RTG absorpční spektrometrie), vazebnými i nevazebnými elektrony molekulových orbitalů (UV-Vis spektrometrie), případně při absorpci dochází ke změně rotačních a vibračních stavů molekuly (IČ spektrometrie) • emise energie: excitovaný atom, nebo molekula, která byla převedena dodáním energie do vyššího (excitovaného) stavu, přechází do základního stavu a vyzáří energii • fluorescence a fosforescence... • zvláštním typem interakce je rozptyl (deformační srážky-Raman, Tyndálův rozptyl, atd.) Molekulová elektronová struktura • orbitaly a elektrony v molekule, jenž jsou ovlivněny vazebnými interakcemi jsou zodpovědné za vznik elektronových spekter ve viditelné a ultrafialové oblasti spektra • platí Pauliho vylučovací princip • nejčastější metody výzkumu molekulové elektronové struktury jsou spektrofotometrie (absorbance) v oblasti UV-Vis, luminiscenční spektroskopie. Světelné záření • světlo je elektromagnetické vlnění, které se skládá ze dvou složek: elektrické a magnetické • vektor elektrické složky kmitá (osciluje) kolmo na směr šíření paprsku • vektor magnetické složky je kolmý na směr šíření paprsku a zároveň na vektor elektrické složky Světelné záření • světelný paprsek je charakterizován frekvencí (υ) oscilace magnetické a elektrické složky (kolikrát za sekundu je vektor složky v maximu), resp. vlnovou délkou (λ) • rychlost světla (c) ve vakuu je 3 x 108 m/s • pro rychlost světla platí: c = λ υ • elektricky nabitá částice (elektron) je schopna interakce se světelným vlněním (ovlivnění je dáno elektrickou složkou paprsku). • přijatá energie (E) je kvantována: E = h υ • h je Planckova konstanta (h = 6.625 x 10-27) v=3 v=2 v=1 v=0 S0 S2 S1 T1 ______ radiační přechody (s účastí fotonu) ............ neradiační přechody (bez účastí fotonu) absorpce absorpce vibrační relaxace fosforescence přechod mezi systémyvnitřní konverze fluorescence Jablonského diagram Typy přechodů E σ π n π * σ * hladiny energií molekulových orbitalů Typy přechodů Přechod σ - σ* : jednoduché vazby (např. C-C, nebo C-H), vyžadují velikou energii (méně než 190nm, vakuová oblast) Přechod n - σ* : nutná přítomnost atomu s volným elektronovým párem (N, S, I, Cl, Br), absorpce kolem 200nm. Přechod π – π*: sloučeniny s dvojnými a trojnými vazbami, čím lepší konjugance vazeb, tím vyšší vlnová délka (energetická hladina nejvyššího obsazeného vazebného orbital se zvýší a energetická hladina nejnižšího nevazebného orbitalu se sníží → nižší ∆E), delokalizované π orbitaly aromatických systémů → rozdíl energií je nízký (absorpce ve Vis oblasti) n – π*: v molekule je kromě dvojné vazby přítomen také atom s volným elektronovým párem (N, S, Cl...), nízká energie, ovlivnění π – π* přechodu Typy elektronových přechodů v komplexech kovů a) přechody v rámci iontu kovu vázaného do komplexu (dd, nebo f-f přechody): dochází ke štěpení podhladin iontu kovu vlivem ligandového pole. b) C-T (charge-transfer) přechody: přenos náboje mezi ligandem a iontem kovu, dochází k přechodu elektronu z orbitalu atomu s výrazně vyšší elektronovou hustotou do orbitalu jiného atomu s menší elektronovou hustotou (buď přechod M-L, nebo L-M), tyto přechody mají vysokou intenzitu v porovnání s přechody d-d. c) elektronové přechody v rámci ligandu vytvořené vlivem elektrostatické interakce s iontem kovu. Absorpce Fluorescence 1 – rovnovážná konfigurace v základním stavu 2 – nerovnovážná konfigurace v excitovaném stavu (Franckův-Condonův stav) 3 – rovnovážná konfigurace v excitovaném stavu 4 – nerovnovážná konfigurace v základním stavu (Franckův-Condonův stav 1 2 3 4 Zpožděná fluorescence T1 S1 S0 fluorescence zpožděná fluorescence fosforescence ∆E (teplo, srážky, atd.) absorpce Vliv prostředí na luminiscenci Dynamické zhášení luminiscence • k interakci mezi zhášečem a potenciálním fluoroforem dojde po excitaci, kdy excitovaná molekula vytvoří „komplex“ s jinou částicí (molekulou, „species“), který nefluoreskuje – dojde k vytvoření nových hladin a dojde k deexcitaci vnitřní konverzí. Typická je např. tvorba komplexu s kyslíkem rozpuštěným v rozpouštědle (oxidace), I-, Cs+, akrylamidem, atd. F0/F = 1 + KSV [Q] • Stern-Volmerova rovnice: F0 je intenzita fluorescence bez zhášedla, F je intenzita fluorescence se zhášedlem, KSV je Stern-Volmerova zhášecí konstanta, Q je koncentrace zhášedla • dynamické zhášení snižuje τ Dynamické zhášení Zhášení fluorescence fluoresceinu za přítomnosti I- Zhášení luminiscence • statické zhášení: ke „komplexaci“ dochází v základním stavu (vytvoří se nefluoreskující komplex). Luminiscence jsou pak schopny jen disociované molekuly, ale rychlost disociace je malá ve srovnání s se zářivými přechody (zářivé přechody jsou neefektivní). Typický příklad – komplexace těžkým kovem (snížení fluorescence kys. salicylové po komplexaci Fe(III).) F0/F = 1 + Ka[Q] Luminiscence molekuly je charakterizována: emisní spektrum (emisní maximum), excitační spektrum (excitační maximum), Stokesův posun, kvantový výtěžek, čas vyhasínání luminiscence Emisní a excitační spektra emisní spektrum (fluorescenční resp. fosforescenční spektrum): závislost intenzity luminiscence na vlnové délce. Měří se při konstantní λex. excitační (aktivační, „absorpční“) spektrum: závislost absorpce luminoforu (fluoroforu) na vlnové délce. Měří se při konstantní λem. 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 450 500 550 600 650 λ [nm] IF Emise Excitace λex, max λem, max Stokesův posun Emisní spektrum Excitační spektrum Excitační a absorpční spektrum mají podobný tvar, jestliže absorbuje pouze ta část molekuly odpovědná také za fluorescenci Emisní a excitační spektra • Stokesův posun: rozdíl mezi emisním a excitačním maximem (v nm) • Kashovo pravidlo: tvar emisního spektra není ovlivněn vlnovou délkou excitace a lze excitovat zářením s kteroukoli vlnovou délkou z excitačního spektra • nejvyšší intenzita luminiscence: excitace vlnovou délkou rovnou excitačnímu maximu • fosforescenční spektra jsou posunuty k vyšším vlnovým délkám, neboť přechod z T1 do S0 je spojen s menším rozdílem energie, než přechod z S1 do S0 Zrcadlové pravidlo • emisní a excitační spektra organických látek mají podobný tvar, ale jsou zpravidla zrcadlově obrácené Rhodamin 6G 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 450 500 550 600 650 λ [nm] IF[a.u.] Emise Excitace Emisní spektra Aditivní pravidlo: fluoreskuje-li po ozáření ve vzorku více nezávislých fluoroforů, výsledná emise je součtem příspěvků emisí těchto látek. Toto pravidlo však platí pouze pro molekuly, které spolu nevyměňují energii... Fluorescence a fosforescence Čas vyhasínání fosforescence – 10-4 až několik s Čas vyhasínání fluorescence – 10-12 až 10-6 Fosforescence: posun emise k vyšším vlnovým délkám Základní vztahy A = c l ε = log (Φo/Φ) (Lambert-Beerův zákon) A – absorbance, c – koncentrace, ε – absorbční koeficient, l – tloušťka kyvety, Φo - záření vyslané na vzorek, Φ - záření prošlé vzorkem F = k φ Φo (1-10-clε) F – fluorescenční signál (fotony/s), k – podíl emitovaných fotonů, které dorazí na detektor, φ – výtěžek luminiscence F = k φ Φo 2.3 c l ε zjednodušený vztah pro nízké koncentrace „Čas života“ (lifetime) fluoroforu • nestudujeme jednu molekulu s fluoroforem, ale mnoho molekul s populací elektronů na excitovaných hladinách • na základě studia systému z mnoha molekulami určujeme „čas života“ určité molekuly s fluoroforem dn*/dt = -n* Γ + f(t) n* je počet excitovaných částic, t je čas, Γ je rychlostní konstanta emise fluorescence, f(t) je časová jednotka (čas excitace) • jestliže k excitaci dojde v čase t = 0, pak: dn*/dt = -n* k pro počet excitovaných molekul lze rovnici zapsat takto: n*(t) = n*(0) exp k t jestliže: τ = k -1 pak: n*(t)/n*(0) = e - t/τ τ je tedy čas, kdy 1/e molekul (36.8%) je v základním stavu Časově rozlišená luminiscence I = I0 exp -(t/τ) tτ I0 - 1 e excitační puls fluorescence IF • Doba života (luminescence lifetime): τ = 1/ kF - kvalitativní a strukturní analýza, studium polohy fluoroforu Časově rozlišená luminiscence log I0 excitační puls fluorescence log IF t logIF = logI0 - t τ • obecná definice: φ = kf / (kf + ki + kx) kf rychlost emisního procesu (fluorescence) ki rychlost nezářivých přechodů (teplo, relaxace...) kx rychlost mezisystémových přechodů - jestliže rychlost deaktivačních procesů je pomalá ve srovnání s kf potom kvantový výtěžek je vysoký • kvantový výtěžek: φk = Nem/Nabs = Iem/Iabs = Iem/(I0-I) • energitcký výtěžek: φe = Eem/Eabs = hνem/hνex Výtěžek luminiscence φe<φk (Stokesův posun) Stanovení kvantového výtěžku 1) absolutní stanovení (primární metody) • chemický aktinometr • kalorimetrie • kalibrované zdroje záření, korekce spekter, atd. 2) relativní stanovení (sekundární metody) • srovnání s fluorescenčním standardem Stanovení kvantového výtěžku kvantový výtěžek: φk = Nem/Nabs • pro stanovení kvantových výtěžků používáme fluorescenční standardy (tj. látky s definovaným kvantovým výtěžkem) • potřebujeme znát molární absorpční koeficienty (nebo hodnoty absorbancí při stejné koncentraci) stanovované látky i standardu pro vlnovou délku excitačního záření • změříme a porovnáme plochy (F) emisních spekter Fx Fst x εst εx φ φx = st Molekulová luminiscence: instrumentace I • Fluorimetr a spektrofluorimetr: základní uspořádání přístrojů • Součásti (spektro)fluorimetru excitační zdroje monochromátory polarizační filtry cely detektory Schema měření fluorescence excitační zdroj výběr excitační λ vzorek výběr emisní λ detektor Schema měření fluorescence (pokr.) • Fluorimetr vs. spektrofluorimetr Fluorimetr - neslouží k záznamu spekter - filtry pro výběr vlnové délky Spektrofluorimetr - záznam spektra (emisního nebo excitačního) - využit(y) monochromátor(y) • Polarizační fluorescence mezi monochromátory a vzorkem mohou být začleněny polarizační filtry Součásti (spektro)fluorometru • Excitační zdroje výbojky, LED, lasery • Monochromátory filtry, hranoly, mřížky • Polarizační filtry • Cely • Detektory fotonásobiče, lavinové fotodiody, CCD Měření a prezentace dat • Jednoduchý sken – emisní spektrum (λexc = konst., sken λem) – excitační spektrum (λem = konst., sken λexc) • Synchronní sken – současný sken λem a λexc, λem-λexc = konst. • 3D spektra – množina excitačních/emisních spekter – ze 3D spektra lze získat emisní, excitační spektrum nebo rozdílové spektrum odpovídající synchronnímu skenu Příklad 3D spektra luminiscence Eu3+ Srovnání absorpční a luminiscenční spektroskopie v oblasti UV-Vis Spektroskopie v oblasti UV-Vis A = c l ε = log(Io /I) Absorpční spektroskopie: měření poměru dvou světelných toků + přesnost (odolnost vůči změnám abs. hodnoty světelného toku Φo) - citlivost (nepatrný rozdíl mezi Io/I při nízké koncentraci analytu) Luminiscenční spektroskopie F ~ k φ Io 2.3 c x ε Luminiscenční spektroskopie: měření vyzářené energie + vysoká citlivost při použití citlivého detektoru (i jednotlivé fotony) - přesnost (fluorescence je přímo úměrná ecitačnímu světelnému toku (Io); projevuje se u ní negativně kolísání excitačního zdroje aj. Luminiscence organických molekul: ukázky 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 270 290 310 330 350 370 390 410 430 450 470 λ [λ [λ [λ [nm] IF[a.u.] Trp Tyr Phe 0 7.0 0.04282200257Fenylalanin (Phe) 0.143031,400274Tyrosin (Tyr) 0.203485,600280Tryptofán (Trp) Kvantový výtěžek Vln.délka (nm) Abs. koeficient Vln.délka (nm) Aminokyselina FluorescenceAbsorpce 1. P. Pekárková, Bakalářská práce, 2005 2. www.biotek.com Chinin emisní maximum: 446 nm excitační maximum: 349 nm Stokesův posun: 97 nm Deriváty fluoresceinu excitační maximum: 494 nm emisní maximum: 520 nm Deriváty rhodaminu 0 1 2 3 4 5 550 600 650 700 750 Vlnová délka [nm] IF Fluorofory s emisním maximem v oblasti kolem 600nm Luminiscence anorganických „species“ v roztoku 1. slabě fluoreskující ligand má komplexaci lepší fluorescenční vlastnosti (nebo obráceně...) 2. ionty kovů (zejména f-prvky), nebo jejich „species“ jeví fluorescenci (někdy také fosforescenci) v roztoku i bez komplexace 3. „anorganická“ luminiscence pochází z komplexů z nefluoreskujícími ligandy Zlepšení luminiscečních vlastností po komlexaci (1) • kov nijak neovlivňuje fluorescenční vlastnosti, jen stabilizuje organické ligandy tak, aby byl upřednostněn zářivý proces deexcitace • kov může také v některých případech zhášet luminiscenci • obou jevů lze využít pro analytické stanovení, nejedná se však o příliš selektivní metodu Luminiscence anorganických „species“ – luminiscence nekomplexovaných iontů v roztoku (2) • lanthanité ionty (např. Eu3+, Tb3+, Gd3+, a další) • některé aktinoidy (např. UO2 +, Th(I)) • závisí i na okolí „species“ – pH, komplexace, teplota, atd. • jedná se o přechody mezi f-f, případně d-f elektronovými přechody • pro emisní spektra jsou obvyklé ostré píky, čas vyhasínání luminiscence je extrémně dlouhý (až ms) Luminiscnce Lanthanoidů(III) Některé komplexy Ln(III) mají velmi neobvyklé spektrální vlastnosti: • dlouhý čas vyhasínání luminiscence • Stokesův posun může být i více než 100 nm • emisní spektrum obsahuje ostré píky FRET • FRET je Fluorescence Resonance Energy Transfer – Fluorescenční rezonanční energetický transfér • podle objevitele Főrster nazýván také Förster Resonance Energy Transfer • přenos energie mezi dvěma fluorofory vzdálenými 10-100 Å 1. první fluorofor (donor) je excitován specifickou vlnovou délkou 2. místo fluorescence je energie přenesena na druhý fluorofor (akceptor) 3. Akceptor vyzáří přijatou energii ve formě světla Podmínky: a) vzdálenost mezi molekulami je menší, než 100 Å b) emisní spektrum donoru se překrývá se absorpčním (excitačním) spektrem akceptoru c) molekuly mají stejně orientovány dipólové momenty FRET: schéma M 1 M 2 molekula 1 F1 F2 F1 F2molekula 2 F2 FRETFRET Aplikace • sledování strukturních a konformačních změn (dvě molekuly (případně dvě části molekuly) jsou označeny donorem a akceptorem a sledujeme zda dochází k výměně energie • sledujeme: studium struktury proteinů, polynukleotidů, DNA, protein-protein interakce, DNA-protein interakce, atd. • analytické aplikace Sledováni změn konformace molekuly • např. sledování změn struktury proteinu, případně jiných biopolymerů • nevýhoda: ovlivnění struktury navázáním fluoroforů F1F1 F1 F1 FRETFRET KONFORMACE 1 KONFORMACE 2 Sledování interakcí mezi vlákny DNA • vzdálenost mezi vlákny DNA spojenými vodíkovými můstky je 30-60 Å • na větší vzdálenosti: donor obsahuje Ln3+ Chemiluminiscence Chemiluminiscence • zdrojem excitace je chemická reakce • z reakce jedné molekuly ~ jeden foton A + B → X* → Produkt + světlo http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Chemoluminescent_reaction.jpg Příklad chemiluminiscenční reakce – oxidace luminolu kyslíkem Chemiluminiscenční reakce • reakce luminolu v zásaditém prostředí s kyslíkem (peroxid, vzdušný kyslík) → modře fluoreskující roztok • jestliže jsou v roztoku obsažen také Fe2+, nebo Cu2+ (katalýza reakce) dochází k zvýšení intenzity luminiscence http://people.howstuffworks.com/luminol.htm Bioluminiscence • celkem je známo asi 550 druhů organismů, které produkují luminiscenční světlo • v roce 1887 profesor Duboise izoloval ze světlušek dvě látky: luciferin a luciferázu • na zemi světélkují zejména brouci z čeledi Lampyriade (světlušky) a někteří kovaříci (např. Pyrophorus noctilucus) • v moři bylo zatím objeveno přibližně světélkujících 250 druhů: medusy, chobotnice, krakatice, ryby, paryby, atd. • bioluminiscence živočichů je vysvětlována různými důvody: hledání partnera (světlušky), lákání kořisti (např. ryba zubatka, některé druhy světlušek, žraloček brazilský ), zastrašení nepřátel (ryba stříbrnáč, medusy z čeledi klanonožců). Světlušky... Luciferin Luciferin • luciferin se za přítomnosti katalyzátoru luciferázy a oxiduje kyslíkem na oxyluciferin • přeměna 1 molekuly luciferinu na oxyluciferin je doprovázena emisí 1 fotonu (namodralé světlo) • u tohoto děje se 1 molekula ATP přemění na ADP • u některých organismů je tzv. fotoprotein – kyslík, luciferin a luciferáza se nacházejí blízko sebe, ale teprve změna konformace fotoproteinu spustí chemickou reakci („aktivátorem“ jsou většinou ionty Ca2+) Bioluminiscence medusy A. Victoria Většina mořských živočichů jevících bioluminiscenci emituje namodralé světlo (základem je oxidace luciferinu). U medusy Aequorea Victoria však byla pozorována zelenzelenáá luminiscence... ?? Bioluminiscence medusy A. Victoria • medusa obsahuje protein aequorin, který se skládá s apoproteinu (apoaequorin) a prostetického proteinu (coelenterazine), který je podobný luciferinu • v přítomnosti O2 a při vysoké hladině Ca2+ dojde k oxidaci coelenterazinu na excitovaný coelenteramid a CO2 • relaxací coelenteramidu do základního stavu se uvolňuje modré světlo (λ = 469 nm) • uvolněné světlo může být absorbováno dalším proteinem obsaženým v těle medusy – GFP „Green fluorescent protein“ • absorpční maxima GFP jsou 395 a 475 nm ~ může dojít k absorpci světla uvolněného z aequorinu • absorbované světlo excituje GFP a dochází k vyzáření zeleného světla (λ = 509 nm) Struktura GFP • GFP byl objeven Shimamurou v 60. letech • GFP obsahuje běžné aminokyseliny, ale ve slunečním světle jeví lehce nazelenalou fluorescenci (kolem 500 nm), stejně jako živá Aequorea Victoria v moři... Struktura GFP • GFP vzniká cyklizací, dehydratací a oxidací vzdušným kyslíkem sekvence proteinu obsahujícím Ser-Tyr-Gly Tsien Y. R., Annu. Rev. Biochem. 1998. 67:509–44. Fluorescenční vlastnosti GFP „Divoký“ typ GFP – směs fenolového a fenolátového derivátu Hlavní excitační pík - 395 nm (emisní maximum - 508 nm) Minoritní excitační pík - 475 nm (emisní maximum – 503 nm) Použití GFP v chemii a biologii • lze připravit protein, který obsahuje sekvenci (např. Ser-Tyr-Gly), který má vlastnosti stejné jako ostatní proteiny, ale je mnohem lépe detegovatelný • genové inženýrství – sekvenci z DNA medusy, která je zodpovědná za tvorbu GFP lze vpravit do DNA jiného organismu, např. i savce... • FRET GFK – Green Fluorescent Králík Použití GFP v chemii a biologii • nejde o bioluminiscenci (chemiluminiscenci), ale o fotoluminiscenci (excitace lampou, nebo laserem) • obecně lepší rozlišení při sledování mikroskopem • sledování genové exprese • medicína a biologie: sledování metastáze tumoru Spojení separačních technik a fluorescence Kolonové separační techniky - HPLC, CE, ITP, atd. Planární Techniky – 2D elektroforéza (detekce bílkovin v gelu Coomasie blue, SYPRO Orange) Laser nejčastěji jako zdroj excitačního záření (LIF) kompatibilita laserového paprsku s mikrokolonovými technikami - dostatečný světelný tok i při rel. malém výkonu laseru (~mW) - vyšší toky způsobují bělení • pro danou třídu analytů, resp. derivátů zvolen vhodný laser podle vlnové délky, nebo možnost derivatizace • jednoduchá sestava detektorová vialka laser mikroskopový objektiv na posuvném držáku štěrbina zdroj vysokého napětí injekční vialka v karuselu skříň kapilára fotonásobiččočka filtry stínítko Srovnání LIF a UV-Vis detekce u CE 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 t [s] I[a.u.] -0,00005 -0,00003 -0,00001 0,00001 0,00003 0,00005 0,00007 0,00009 300 350 400 450 500 550 t (s) Absorbance,540nm Analyt: Rhodamin B, c = 1x10-5 mol/l (při obdobném dávkování) Analyt: Rhodamin B, c = 1x10-12 mol/l, excitace: 532 nm, 5 mW; emise: > 560 nm, kapilára: 50 mm i.d., 375 mm o.d., l = 30/37 cm, dávkování: U = 5 kV, ti = 10 s nebo Dh = 2cm, ti = 30s, separace: 0,02 mol/l fosfát v 10% MeOH, pH 10; U = 10 kV. LOD ~ 2 x 10-13 mol/l ... ~ 102 molekul Nepřímá LIF detekce • menší citlivost, než přímá, ale stanovovaná látka nemusí mít fluorofor • vhodné pro stanovení jednoduchých látek • obdoba nepřímá UV-Vis detekce Fluorescenční značky a sondy • fluorescenční značky (fluorescent labels) jsou nevlastní (extrinsic fluorescence) fluorofory, které se ke sledovaným biomolekulám (proteinům, peptidům, ligandům, oligonukleotidům a jiným) vážou kovalentní vazbou • fluorescenční sondy (fluorescent probes) jsou nevlastní fluorofory, které se ke sledované struktuře vážou nekovalentně a často přitom mění své fluorescenční vlastnosti. Derivatizace fluoroforem Rhodamine B (c =1x10-12 mol.l-1) Rhodamin B (c =1x10-12 mol.l-1) Vnitřní (nativní) x vnější luminiscence luminiscenční značky a sondy Molekuly bez vlastní (vnitřní, nativní, přirozené) luminiscence lze derivatizovat luminiscenčními značkami Omezení: lze detekovat i jednotlivé molekuly („single molecule detection“) obsahující silné luminofory, problém je jejich navázání na analyt... Fluorescenční značky Fluorescenční značky jsou nevlastní fluorofory, které se ke sledovaným biomolekulám (proteinům, peptidům, ligandům, oligonukleotidům a jiným) vážou kovalentní vazbou. Nejčastěji se používají k fluorescenčnímu značení proteinů, kdy se kovalentně vážou na jejich aminové, sulfhydrylové nebo histidinové boční řetězce, thiolové skupiny atd. Použití luminiscenčních značek: • analytické stanovení (např. v kombinaci se sep. metodou) • fluorescenční mikroskopie • FRET – měření vzdálenosti funkčních skupin • flow cytometry • fluorescenční in situ hybridizace (FISH) • značení buňek a tkání • fluorescenční „imunoassays“, klinická diagnostika Výběr fluorescenčních značek kritéria pro výběr: spektrální vlastnosti (excitace, emise, kvantový výtěžek atd.) vazebné místo (-NH2, -SH skupina a další) podmínky reakce (pH, koncentrace...) hydrofobicita Výběr luminiscenčního barviva – spektrální vlastnosti Výběr luminiscenčního barviva – spektrální vlastnosti RBITC 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 450 500 550 600 650 λ [nm] IF[a.u.] Emise Excitace O OH O N + NCH3 CH3 CH3 CH3 N S N S Cl - Výběr luminiscenčního barviva – spektrální vlastnosti Výběr fluorescenčních barviv Fluorescenční značky – vazebná místa amino-reaktivní značky sukcinimidyl estery (Rh6GSE) sulfonyl chloridy isothiokyanáty (FITC, RBITC) Fluorescenční značky – vazebná místa thiol-reaktivní značky Fluorogenní substráty – stanovení enzymatické aktivity Princip: volný fluorofor má jiné luminiscenční vlastnosti, než když je navázaný na biomolekulu. Fluorofor je na biomolekulu navázán vazbou, kterou štěpí stanovovaný enzym. Fluorogenní substráty Fluorescenční metody v imunoanalýze Imunoanalytické metody: • dříve hlavně tvorba precipitátu • dnes značené hlavně různým způsobem značené reaktanty (antigeny a protilátky) • radiometricky, enzymaticky, fluorescenčně (luminiscenčně) značené reaktanty • enzymové metody mohou mít luminiscenční detekci Dělení fluorescenční imunoanalytických metod • Fluorescence Immuno Assay (FIA) • Fluorescence Polarization Immuno Assay (FPIA) • Time Resolved Fluorescence Immuno Assay (TR-FIA) • Elektroluminiscenční, chemiluminiscence a další • Enzymatické metody s luminiscenční detekcí Radiometrická vs. fluorescenční detekce v imunoanalýze • dříve byla nejcitlivější metodou RIA, ale s příchodem levných laserů je rozšířenější luminiscenční detekce • detekční limity obou metod jsou srovnatelné (až 10-12 g.l-1), ale luminiscenční detekce je bezpečnější a levnější Fluorescenční imunoanalýza (FIA) • poprvé použity v roce 1964 • často ovlivněna fluorescencí matrice a samotného vzorku • řešením je TR-FIA (Time Resolved Fluorescence Immuno Assay). Tato metoda využívá jako značek chelátů s lanthanitých kationtů (Eu3+, Tb3+, Sm3+ a dalších) • FIA lze provádět v homogenním i heterogenním prostředí, v kompetitivním i nekompetitivním uspořádání Ab +